一、Primary Purification of Co-expressed Soluble and Insoluble Alpha-interferon 2b from Recombinant E. coli（论文文献综述）
宋文[1]（2021）在《多氯联苯全细胞生物传感器的研究以及几丁质酶在毕赤酵母GS115的高效表达》文中认为多氯联苯（PCBs）是一种持久性有机污染物,广泛存在于生态环境中,具有高毒性、环境持久性、生物累积性、半挥发性、可远距离迁移等特点。目前常用的多氯联苯检测方法仍存在各种不便,因此急需发展快速灵敏、简单高效的检测新方法。生物传感器可直接对样品进行测定,准确度高,因此成为一种新型的环境污染物检测手段。全细胞生物传感器是一种以微生物细胞为敏感元件,可以快速感应环境中污染物的装置。因其具有响应快、体积小、成本低、可实现原位监测等优势,在环境监测、药品研发、食品工业等领域显示出巨大潜力。本论文以微生物作为感应中心,构建了用于检测多氯联苯的全细胞微生物传感器。主要结果如下:1、将恶臭假单胞菌TOL质粒来源的XylS/Pm系统与绿色荧光蛋白（e GFP）进行融合,构建了氯苯甲酸传感系统,并针对E.coli XL10-gold、DH10B、Top10、DH5α菌株探究了该系统最适宿主菌。发现在E.coli DH5α中本底荧光值最低,对氯苯甲酸感应效果最好,其中对苯甲酸及3-氯苯甲酸的检测下限为10μM,而对2-氯苯甲酸及4-氯苯甲酸无法响应;2、在E.coli DH5α构建了PCBs好氧降解上游途径,与氯苯甲酸传感途径结合,使得PCBs降解为氯苯甲酸,从而诱导Pm启动子的表达产生绿色荧光信号。检测了该途径对0～0.5 m M 2,2-二氯联苯、2,6-二氯联苯、4,4’-二氯联苯及2,4,4’-三氯联苯的感应能力,发现仅能响应0.5 m M的2,2-二氯联苯,对2,6-二氯联苯、4,4’-二氯联苯及2,4,4’-三氯联苯无法做出响应;3、为提高PCBs的降解能力,基于已有文献报道的T335A/F336M突变体,利用在线软件Fireprot设计了17个单点突变,然后实验获得了突变体并测定了不同突变体对PCBs的降解能力,筛选得到T335A/F336M/G389M突变体,相较于T335A/F336M而言,对2,6-二氯联苯及4,4’-二氯联苯的降解能力分别提高了71%和44%;4、为提高氯苯甲酸传感途径的灵敏度,基于结构分析、分子对接结果以及已有研究对XylS进行分子改造。构建了A111位点的单点饱和突变体库以及St Ep13五突变体,发现A111V使得苯甲酸与3-氯苯甲酸的检测下限由10μM降低至1μM,但仍无法响应2-氯苯甲酸及4-氯苯甲酸。而St Ep13五突变体对四种氯苯甲酸的检测下限均降低至1μM。随后我们组合了XylS-St Ep13五突变与联苯双加氧酶Bph A1-T335A/F336M/G389M三突变体,发现重组菌株Cb3x5对2,2-二氯联苯及2,4,4’-三氯联苯的检测下限为0.01 m M,对4,4’-二氯联苯与2,6-二氯联苯检测下限为0.05 m M;5、另外,我们发现氯苯甲酸传感系统在E.coli DH5α表达时,菌株经传代培养后对氯苯甲酸的荧光信号增强了约4倍,随后以荧光增强菌株DX-H继续传代培养,对氯苯甲酸的感应能力却又减弱,并且与原始菌株相比,DX-H生长速度更为缓慢,同等菌体量抽提质粒时DX-H的质粒浓度更低,将从DX-H中抽提得到的质粒进行测序未发现突变。该菌株为何无法稳定传代的现象仍需进一步探究;6、探究了大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、贝莱斯芽孢杆菌及恶臭假单胞菌对PCBs的耐受性,选择在枯草芽孢杆菌SCK6中构建PCBs全细胞生物传感器。首先重构了PCBs好氧降解上游途径,经HPLC检测能够成功降解PCBs。随后在SCK6中重构了氯苯甲酸传感途径,但经3-氯苯甲酸诱导培养未能检测到荧光信号,分析认为是SCK6中缺乏Pm转录所需的σ因子,后续实验需对Pm启动子与σ因子识别相关区域进行改造。下一步工作还需将PCBs全细胞生物传感器中的报告蛋白e GFP换成蛋白酶,使得信号级联放大从而增强检测灵敏度,为PCBs的检测提供选择。另一方面,在酶制剂工业生产当中,在毕赤酵母GS115中对具有经济意义的蛋白进行高效表达是一种重要手段。几丁质酶及几丁质寡糖可广泛应用于多个领域,因此开发高产几丁质酶的菌株至关重要。具体策略及结果如下:1、将地衣芽孢杆菌WX-02菌株来源的几丁质酶基因构建到p HBM905M表达载体进行基因表达框的串联表达,随后通过生物砖策略构建得到多拷贝串联模块,并整合到毕赤酵母GS115基因组上的his4基因位点进行诱导表达;2、对分别含有1、2、3、4、6多基因拷贝的重组几丁质酶菌株进行摇瓶,发现基因拷贝数为4时,与分子伴侣HAC1共表达的重组毕赤酵母菌株其几丁质酶的分泌表达量最高,高密度发酵时上清液中总蛋白量达到12.7 mg/m L,比目前已有文献报道报告高出24倍;3、探究了ChiA对不同浓度胶体几丁质的水解能力,发现该几丁质酶可以水解30%的胶体几丁质,转化率达到74%,水解产物以Glc NAc为主,其次是N,N’-二乙酰基壳二糖。另外,结合Bs Nag Z联合水解胶体几丁质,水解产物可以进一步完全转化为Glc NAc,转化率为88%。4、本研究几丁质酶水解胶体几丁质的产物可以明显促进水稻和小麦的发芽生根,在10天内能使幼苗的苗长和根长增加至少1.6倍。
宋世斌[2]（2020）在《藏獒犬IFN-γ,IFN-α和IL-18基因克隆、表达及产物活性鉴定》文中研究说明干扰素（Interferon,IFN）是机体细胞受到病毒等生物诱导剂刺激而产生的一类分泌型糖蛋白类细胞因子,而白细胞介素18（Interleukin-18,IL-18）是一种具有促炎作用的细胞因子,由机体活化的单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞等产生,能诱导IFN-γ等细胞因子的分泌,具有促进T细胞增殖、增强Th1型细胞、NK细胞及CTL细胞的细胞毒效应,与临床自身免疫性疾病及心血管系统疾病等多种疾病的发生发展呈现相关性,IFN和IL-18都具有抗病毒、抗寄生虫和细菌感染、抗肿瘤、免疫调节等多种生物学功能。因此,本实验开展藏獒犬IFN-γ、IFN-α和IL-18的相关研究,采用分子克隆和基因工程等技术获得了3个基因,体外制备了藏獒犬3个基因的重组蛋白,验证了其生物学活性,并开展了临床相关实验,丰富了犬细胞因子的知识,对犬疾病的检测和防控以及保障人类健康有着重要的意义,在犬疾病的防控上有着广阔的应用前景。第一,从藏獒犬血液中分离淋巴细胞,利用脂多糖（LPS）与植物血凝素（PHA）联合刺激淋巴细胞后提取RNA,经RT-PCR扩增IFN-γ、IFN-α和IL-18基因全长片段,将扩增到的基因分别克隆到pGEM-T-easy载体,经酶切、测序鉴定,结果表明:所克隆的IFN-γ基因与GenBank上登载的犬核苷酸序列同源性达99.6%,开放阅读框为501 bp,编码166个氨基酸（AA）,N端23个AA为信号肽,成熟蛋白编码143个AA,分子量为17.2 kD;克隆的IFN-α基因与GenBank上登载的犬核苷酸序列同源性达96.0%,其开放阅读框为564 bp,N端23个AA为信号肽,成熟蛋白编码164个AA,推测的分子量为19.0 kD;克隆的IL-18基因与GenBank上登载的犬核苷酸序列同源性达100%,其开放阅读框为582 bp,编码193个AA,N端36个AA为信号肽,成熟蛋白编码157个AA,推测的分子量为18.1 kD。第二,根据克隆的藏獒犬IFN-γ、IFN-α和IL-18基因阅读框序列,设计3个基因去掉信号肽的表达引物,克隆去信号肽后的目的片段,构建原核表达质粒pET-30a-IFN-γ、pET-30a-IFN-α和pET-30a-IL-18,转化大肠杆菌后诱导表达。经优化诱导条件后,3个重组菌都能够在温度为37℃,浓度为0.5 mM IPTG的诱导条件下成功的表达,3个重组菌在诱导后主要以包涵体形式表达,其中pET-30a-IFN-γ重组蛋白在上清中也有一定量的表达;经SDS-PAGE分析,pET-30a-IFN-γ、pET-30a-IFN-α和pET-30a-IL-18表达的蛋白分别约为23 kD、25kD和24 kD,表达的蛋白大约占菌体蛋白30%35%。第三,用镍琼脂糖凝胶纯化层析柱纯化pET-30a-IFN-γ、pET-30a-IFN-α和pET-30a-IL-18重组蛋白,纯度达到90%以上,通过梯度透析复性法复性蛋白。利用抑制病毒噬斑法测定重组藏獒犬IFN-γ和IFN-α的生物学活性,二者都具有抗病毒的活性,而且IFN-α抑制VSV的作用强于IFN-γ,二者的抗病毒活性在一定的浓度范围内有作用,在高于或低于这个浓度范围时发挥的效果一般;利用MTS法检测重组藏獒犬IL-18重组蛋白的生物学活性,纯化的重组IL-18具有诱导淋巴细胞增殖的能力,说明表达的蛋白具有生物学活性。第四,通过对总数为128只犬病毒性传染病病例（包括犬细小病毒病、犬冠状病毒病及犬瘟热3类宠物常见病）的IFN治疗组和对照治疗组的比较分析结果显示:IFN治疗组中3类疾病总计67只,治愈45只,平均治愈率67.2%,对照治疗组中3类疾病总计61只,治愈34只,平均治愈率55.7%,使用本实验获得的IFN-α重组蛋白治疗宠物犬病毒性传染病,能显着提高治愈率,有较好的临床治疗病毒性疾病的效果。本研究克隆了藏獒犬IFN-γ、IFN-α和IL-18基因,并应用分子生物学软件对序列进行生物信息学分析;首次成功的表达了3个基因,纯化、复性了重组蛋白,发现IFN-γ、IFN-α和IL-18基因具有较高的生物学活性,可以开发利用;通过藏獒犬IFN-α重组蛋白的临床病毒性犬病的治疗,验证了藏獒犬IFN的抗病毒活性。藏獒犬是中国特有的大型犬种,本研究为犬基因工程生物制品的进一步开发和相关疾病的检测及防治奠定了理论基础。
徐丽[3]（2019）在《从江香猪源poIFN-α2/β/γ的原核与酵母表达及其抗PRRSV活性研究》文中进行了进一步梳理猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV）是影响全球养猪业的一种严重的接触性传染病。PRRSV感染细胞后,会诱导先天性免疫应答和适应性免疫应答,以妊娠母猪生殖障碍、断奶仔猪肺炎、严重的呼吸道症状和生长猪的死亡率增加为主要特征。干扰素（Interferon,IFN）由病原体刺激宿主细胞产生并释放,通过抑制病毒复制并介导相应细胞免疫功能,表现出直接的抗病毒活性。本研究利用分子生物学、基因工程、细胞生物学等实验技术,获取贵州从江香猪源IFN-α2、IFN-β和IFN-γ（CJ-poIFN-α2、CJ-poIFN-β和CJ-poIFN-γ）编码区基因序列,对其核苷酸序列与编码的氨基酸序列进行生物信息学分析,构建携带CJ-poIFN-α2、CJ-poIFN-β和CJ-poIFN-γ基因的原核表达载体与酿酒酵母表达载体,进行CJ-poIFN-α2、CJ-poIFN-β和CJ-poIFN-γ的原核与酵母表达,从mRNA水平和蛋白水平分析酿酒酵母表达的重组蛋白CJ-poIFN-α2、CJ-poIFN-β和CJ-poIFN-γ对PRRSV复制的影响。1.CJ-poIFN-α2/β/γ基因的扩增及其生物信息学分析本研究设计了3对引物特异性扩增CJ-poIFN-α2、CJ-poIFN-β和CJ-poIFN-γ编码区,经RT-PCR获得CJ-poIFN-α2、CJ-poIFN-β和CJ-poIFN-γ基因编码区,将其连接到克隆质粒pUCm-T上,得到重组质粒CJ-poIFN-α2/β/γ-pUCm-T。测序结果显示CJ-poIFN-α2、CJ-poIFN-β和CJ-poIFN-γ基因核苷酸序列长度分别为546、561和501 bp。对获取的基因序列进行生物信息学分析发现:1)CJ-poIFN-α2、CJ-poIFN-β和CJ-poIFN-γ与GenBank中公布的其他物种IFN核苷酸序列分别进行同源性分析,结果显示CJ-poIFN-α2与参考物种IFN-α2核苷酸同源性为69-98.7%,氨基酸同源性为46.1-97.8%,其中CJ-poIFN-α2与猪源IFN-α2（GenBank NO:NM001130219）同源性最高达,与小鼠（GenBank NO:X01969）同源性最低;CJ-poIFN-β与参考物种IFN-β核苷酸同源性为65.2-100%,氨基酸同源性为8.1-100%,其中CJ-poIFN-β梅山猪（GenBank NO:AY687281）和巴马猪（GenBank NO:KJ147517）IFN-β氨基酸同源性最高,与小鼠（GenBank NO:K00020）氨基酸同源性最低;CJ-poIFN-γ与参考物种IFN-γ核苷酸同源性为42.4-99.8%,氨基酸同源性为8.4-93.4%,其中CJ-poIFN-γ与剑白香猪（GenBank NO:JF906510）、成化猪（GenBank NO:AF493993）、藏猪（GenBank NO:AY293733）和梅山猪（GenBank NO:DQ666352）IFN-γ核苷酸同源性最高,与小鼠（GenBank NO:X01969）同源性较低。2)CJ-poIFN-α2、CJ-poIFN-β和CJ-poIFN-γ基因编码蛋白的二级结构主要以α-螺旋及无规则卷曲为主,不含跨膜结构域,有两个信号肽酶切位点。其中CJ-poIFN-α2和CJ-poIFN-β为不稳定蛋白,CJ-poIFN-γ为稳定蛋白。3)CJ-poIFN-α2由181个氨基酸组成,具有22个Thr磷酸位点和1个O-糖基化位点,不含N-糖基化位点;CJ-poIFN-β由187个氨基酸组成,具有47个Thr磷酸位点和3个N-糖基化位点,不含O-糖基化位点;CJ-poIFN-γ由167个氨基酸组成,含有54个Thr磷酸位点、2个N-糖基化位点和3个O-糖基化位点。本研究为丰富对从江香猪的认识,研究CJ-poIFN的生物活性奠定基础。2.CJ-poIFN-α2/β/γ的原核表达及多克隆抗体的制备本研究利用RT-PCR方法获得CJ-poIFN-α2、CJ-poIFN-β和CJ-poIFN-γ基因编码区序列,将其克隆至原核表达质粒pET28a上,获得重组质粒CJ-poIFN-α2/β/γ-pET28a,并转化至大肠埃希菌BL21（DE3）进行诱导表达,利用SDS-PAGE和Western Blotting方法检测携带重组质粒CJ-poIFN-α2/β/γ-pET28a的菌液上清、诱导菌液沉淀及未诱导菌液的表达。取经镍柱纯化的重组蛋白免疫小鼠制备抗CJ-poIFN-γ高免鼠血清,利用ELISA与Western Blotting方法分析高免血清效价及反应性。结果表明:1)在进行SDS-PAGE验证时,重组蛋白CJ-poIFN-α2未见特异性条带;2)携带重组质粒CJ-poIFN-β-pET28a的诱导菌液沉淀样品在约24 kD处有一特异性条带,与预期结果一致,表明重组蛋白CJ-poIFN-β主要以包涵体的形式存在;Western Blotting鉴定结果显示重组蛋白CJ-poIFN-β在预期条带位置可见约24 kD的特异性条带;在进行镍柱纯化时,由于表达量较低,重组蛋白CJ-poIFN-β纯化效果不佳。3)携带重组质粒CJ-poIFN-γ-pET28a的IPTG诱导菌液进行SDS-PAGE结果显示诱导菌液沉淀样品在预期条带位置可见约19.4 kD的特异性条带,表明重组蛋白主要以包涵体形式存在;Western blotting可见约19.4 kD的特异性条带;镍柱纯化结果表明使用400 mmol/L咪唑洗脱效果较好。4)将纯化后的重组蛋白CJ-poIFN-γ以50μg/只的剂量皮下多点免疫小鼠制备抗CJ-poIFN-γ的多克隆抗体,ELISA结果显示抗CJ-poIFN-γ蛋白的高免鼠血清滴度为1:25 600,Western Blotting结果可见约19.4 kD的特异性条带,表明制备的CJ-poIFN-γ鼠源多克隆抗体具有较好的反应性。本研究为进一步研究CJ-poIFN的生物活性、加快从江香猪这一品质资源的有效利用奠定基础。3.CJ-poIFN-α2/β/γ的酿酒酵母表达本研究针对获取的CJ-poIFN-α2、CJ-poIFN-β和CJ-poIFN-γ基因序列设计携带His标签的特异性引物,构建携带CJ-poIFN-α2、CJ-poIFN-β和CJ-poIFN-γ基因的酿酒酵母表达质粒CJ-poIFN-α2/β/γ-pYES2,分别将其转化至INVSc1,经筛选获得阳性菌株CJ-poIFN-α2/β/γ-pYES2-INVSc1;将阳性菌株在SC-U诱导培养基中进行诱导培养,分别在12、24、48、72、96 h收集菌体进行OD600的测定,利用SDS-PAGE和Western Blotting方法及特异性猪源IFN-α2/β/γELISA试剂盒检测重组蛋白的表达。SDS-PAGE结果显示由于酿酒酵母表达的CJ-poIFN-α2、CJ-poIFN-β和CJ-poIFN-γ表达量较低,选取CJ-poIFN-α2/β/γ-pYES2-INVSc1-96 h进行ELISA及Western blotting验证。ELISA结果显示酿酒酵母表达的CJ-poIFN-α2、CJ-poIFN-β和CJ-poIFN-γ在诱导培养96 h后分泌至上清的浓度分别为45.08、15.95和25.63 pg/mL。Western Blotting结果显示酿酒酵母表达的CJ-poIFN-α2、CJ-poIFN-β和CJ-poIFN-γ在43-55 kD处有一特异性条带。本研究为下一步研究酿酒酵母表达的重组蛋白对PRRSV复制的影响奠定基础。4.酿酒酵母表达的CJ-poIFN-α2/β/γ抗PRRSV活性研究本研究将收集的酿酒酵母表达的CJ-poIFN-α2、CJ-poIFN-β和CJ-poIFN-γ菌液上清预处理Marc-145细胞24 h后接种PRRSV,用Reed-Muench法计算酿酒酵母表达的CJ-poIFN-α2、CJ-poIFN-β和CJ-poIFN-γ抗PRRSV的活性;将酿酒酵母表达的CJ-poIFN-α2、CJ-poIFN-β和CJ-poIFN-γ菌液上清预处理Marc-145细胞24 h后接种PRRSV作用24 h,分析酿酒酵母表达的CJ-poIFN-α2、CJ-poIFN-β和CJ-poIFN-γ对PRRSV N基因转录与翻译水平的影响;将酿酒酵母表达的CJ-poIFN-α2、CJ-poIFN-β和CJ-poIFN-γ菌液上清作用PK15细胞24 h后分析酿酒酵母表达的CJ-poIFN对IFN刺激基因OAS和Mx1转录水平的影响。结果表明1)酿酒酵母表达的CJ-poIFN-α2、CJ-poIFN-β和CJ-poIFN-γ分别稀释22.4、22.35和22.21倍可以有效抑制PRRSV的增殖;2)酿酒酵母表达的CJ-poIFN-α2与CJ-poIFN-γ可有效抑制PRRSV N基因的mRNA与翻译水平;3)酿酒酵母表达的CJ-poIFN-γ能有效上调Mx1基因的mRNA水平,酿酒酵母表达的CJ-poIFN-α2能有效上调OAS和Mx1基因的mRNA水平。
徐国[4]（2018）在《猪圆环病毒2型Cap标记蛋白的重组杆状病毒表达研究》文中研究表明猪圆环病毒（Porcine circovirus,PCV）是一种无囊膜的小型单链环状DNA病毒,病毒粒子为17 nm左右。PCV分为猪圆环病毒1型（PCV1）、猪圆环病毒2型（PCV2）和猪圆环病毒3型（PCV3）。与PCV2相关的一系疾病,如断奶仔猪多系统衰竭综合征（PMWS）等称PCVD。PCVD给养猪业造成的危害重大,至今疫苗免疫仍然是防控PCV2的主要手段。国内PCV2疫苗主要为灭活苗,价格偏高,且难以将猪体内已感染的PCV2彻底清除,所诱导产生抗体不能与野毒抗体相区别。因此,研发高效廉价的,所诱导产生的抗体能与野毒抗体相区分的亚单位疫苗具有重要意义。PCV2的ORF2编码233或234个氨基酸残基构成的PCV2 Cap蛋白是PCV2的唯一结构蛋白,也是主要免疫原性蛋白（Mankertz A et al.,1998）,Cap蛋白已被研制成PCV2亚单位疫苗使用。本研究致力于构建能表达携带标记的PCV2 Cap蛋白的重组杆状病毒,所获得的标记蛋白可为PCV2亚单位疫苗的研究提供素材:1.PCV2 GZ-RH1株ORF2生物信息学分析及Flag表位标签的引入为了解PCV2 GZ-RH1株ORF2的分子特征和构建携带Flag表位标签的PCV2全基因克隆质粒,本研究应用生物信息学软件对PCV2 ORF2基因进行分析后,设计特异性引物,通过PCR扩增、TA克隆等技术将Flag标签引至PCV2 ORF2的末端。PCV2 ORF2遗传进化树显示,PCV2的分布时限性与地域性不明显;PCV2 GZ-RH1株基因型属于PCV2b亚型,ORF2较为保守。PCV2 GZ-RH1株的ORF2推导蛋白结果显示,ORF2编码蛋白为亲水性、混合型蛋白,潜在磷酸化位点与现有疫苗毒株差异较大,但蛋白结构与疫苗毒株相似性较高;ORF2编码氨基酸具有精氨酸富集区;PCV2 ORF2基因密码子偏好性较弱,该基因密码子偏好性主要受自然选择压力影响。密码子使用频率分析得出,选择表达系统对ORF2基因进行表达时,昆虫细胞杆状病毒表达系统（Insect cell-baculovirus expression system,IC-BEVS）较理想。经质粒PCR、双酶切鉴定、测序分析结果显示,成功将Flag标签引入至PCV2 GZ-RH1株ORF2的C端,从而构建了pMD19-T-PCV2-Flag重组质粒。本研究对PCV2 GZ-RH1株的ORF2基因及其所编码蛋白进行较深入的预测分析,为后续的研究提供理论依据;构建的pMD19-T-PCV2-Flag质粒为构建携带能表达PCV2 Cap标记蛋白的重组昆虫杆状病毒载体提供素材。2.猪圆环病毒2型Cap标记蛋白的重组杆状病毒表达载体的构建为构建能表达带有标记的PCV2 Cap蛋白的重组昆虫杆状病毒载体,通过克隆技术,分别将pMD19-T-PCV2-Flag、pMD19-T-PCV2-V5质粒上携带标签的ORF2亚克隆至转移载体pFastBacHTA,重组转移载体转化入DH10Bac感受态细胞,生成重组杆粒转染Sf-9昆虫细胞;通过透射电子显微镜观察重组杆状病毒在Sf-9昆虫细胞中的拯救,通过间接免疫荧光抗体（IFA）试验、聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）、免疫印迹试验（Western-blotting）等对IC-BEVS表达的标记蛋白进行检测。结果显示,成功构建出pFastBacHTA-ORF2-V5和pFastBacHTA-ORF2-Flag重组转移载体,在DH10Bac感受态细胞中生成了重组杆粒rBacmid-Cap-V5和rBacmid-Cap-Flag;在Sf-9细胞中拯救出重组杆状病毒rAcMNPV-Cap-V5与rAcMNPV-Cap-Flag。通过IFA试验观察到细胞中的特异荧光,SDS-PAGE凝胶电泳、Western-blotting分析可见30 kDa左右目的条带,表明Cap标记蛋白在昆虫细胞Sf-9中得以表达;同时也表明所表达的标记重组蛋白能对V5抗体和Flag抗体具有良好的反应原性。本研究可为PCV2基因工程亚单位标签疫苗的研制,以及配套鉴别诊断方法的建立奠定坚实的基础。
闫飞虎[5]（2016）在《PPRV病毒样颗粒的构建、制备及免疫原性研究》文中研究表明小反刍兽疫（peste des petits ruminants,PPR）俗称羊瘟,又被称为小反刍兽假性牛瘟,是一种由小反刍兽疫病毒（peste des petits ruminants virus,PPRV）引起的急性或亚急性传染病。世界动物卫生组织（The World Organization for Animal Health,OIE）将其列为必须通报疫病,我国将其列为一类动物疫病。2007年7月在我国西藏阿里地区出现了中国首例小反刍兽疫,2014年我国大面积爆发小反刍兽疫,波及20余省份,给当地养羊业造成巨大经济损失。此外,小反刍兽疫经空气传播,最易感的是小反刍动物,尤其野生小反刍动物不受国界限制,很容易造成全球性蔓延,所以有效的预防显得尤为重要。弱毒疫苗是OIE规定的唯一允许使用的小反刍兽疫病毒疫苗,然而PPRV对热非常敏感,疫苗在保护和运输过程中保持冷链状态相对较为困难。此外,减毒活疫苗还存在毒力返强的风险,这就限制了PPR弱毒疫苗的大规模田间使用,因此迫切需要开发一种安全有效、热稳定性好的疫苗候选。相比弱毒疫苗与灭活疫苗,病毒样颗粒（Virus-like particles,VLPs）疫苗成为安全稳定的疫苗候选者之一,病毒样颗粒是由病毒一个或多个结构蛋白自行装配而成的高度结构化的空心蛋白颗粒。在形态上,VLPs类似于真实的病毒粒子,但是由于缺乏具有感染性的核酸,故无复制和感染能力。虽然病毒样颗粒不具有感染性,但VLPs具有类似于天然病毒的理化性质,能被抗原提呈细胞摄取加工提呈,激发细胞免疫反应和体液免疫应答,具有安全性高和免疫原性好的优点。流感VLPs疫苗、乙型肝炎VLPs疫苗及猪圆环病毒2型VLPs疫苗都已进入临床试验或者已被比准上市。但目前为止,有关小反刍兽疫病毒病毒样颗粒（PPRV VLPs）构建研究的报道较少。因此,本研究利用杆状病毒昆虫细胞表达系统构建生产不同毒株的PPRV VLPs,并对其免疫原性进行研究比较,选取免疫原性好的毒株的病毒样颗粒进行本动物免疫,为开发安全、有效的小反刍兽疫病毒样颗粒候选疫苗奠定基础。第1章:小反刍兽疫M、F和H蛋白的原核表达及其多克隆抗体的制备本研究以PPRV疫苗株Nigeria 75/1株为研究对象,分别针对其M、F和H蛋白的主要抗原表位区设计克隆引物,通过RT-PCR扩增去除跨膜区和信号肽序列而保留主要抗原表位区片段,将编码序列大小分别为1005 bp PPRV M基因片段克隆至原核表达载体p ET-30a（+）中,将编码序列大小分别为1653 bp和1245 bp的PPRV F、H基因片段分别克隆至原核表达载体p GEX-4T-1中,构建重组质粒p ET-30a（+）-M、p GEX-4T-1-F和p GEX-4T-1-H。将各表达质粒转化宿主菌Transetta（DE3）,表达条件经优化后最终确定为0.4m M IPTG和37℃条件下诱导表达4h,经SDS-PAGE分析结果显示重组质粒p ET-30a（+）-M、p GEX-4T-1-F和p GEX-4T-1-H在大肠埃希菌中分别诱导表达出分子质量为61 k D、66 k D和60 k D的重组蛋白,大小与预期相符,主要以不溶性包涵体形式存在。Western blot鉴定结果显示M、F、H重组蛋白均能被绵阳抗PPRV多克隆抗体特异性识别。以经Ni-NTA亲和层析纯化后的M、F和H重组蛋白分别免疫昆明鼠,经3次免疫后采血,分离血清,制备鼠抗PPRV M、F和H蛋白多克隆抗体,为后期鉴定重组杆状病毒奠定了基础。第2章:小反刍兽疫病毒Nigeria 75/1株病毒样颗粒的构建及其免疫原性研究利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统,本研究扩增了Nigeria 75/1株M、F和H基因,构建了含有双目的基因的重组杆状病毒rp FB-2M、rp FB-2F和rp FB-2H。以鼠抗M、H蛋白的主要抗原表位区多克隆抗体与绵羊抗PPRV阳性血清对重组杆状病毒感染细胞进行间接免疫荧光（IFA）鉴定,可见特异性荧光;以三种重组杆状病毒共感染昆虫细胞Sf9的方式组装病毒样颗粒,放大培养后进行病毒样颗粒纯化。电镜下可以到80-100nm左右的病毒样粒子,且表面纤突明显。Western blot检测纯化后样品可见相对分子质量为38k D,59k D和68k D左右的条带,表明基质膜蛋白与两种囊膜糖蛋白成功组装出病毒样颗粒,且免疫小鼠可诱导产生保护性中和抗体。第3章:China/tibet/geg/07-30株PPRV病毒样颗粒的构建及其免疫原性研究利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统,本研究扩增了PPRV China/tibet/geg/07-30株（Gen Bank Access No.FJ905304.1）M、F、H和N基因,构建了含有双目的基因的重组杆状病毒rp FB-2M、rp FB-2F、rp FB-2H和rp FB-2N。以鼠抗M、H蛋白的主要抗原表位区多克隆抗体与绵羊抗PPRV阳性血清对重组杆状病毒感染细胞进行间接免疫荧光（IFA）鉴定,可见特异性荧光;以四种重组杆状病毒共感染昆虫细胞Sf9的方式组装病毒样颗粒,放大培养后进行病毒样颗粒纯化。Western blot检测纯化后样品可见相对分子质量为38k D,59k D,68k D和58k D左右的条带,表明基质膜蛋白、核衣壳蛋白与两种囊膜糖蛋白成功组装出病毒样颗粒,且免疫小鼠和山羊可诱导产生保护性中和抗体。免疫VLPs的小鼠触发显着增多的分泌IFN-γ或IL-4的CD4+T和CD8+T细胞;免疫PPRV弱毒的小鼠触发显着增多的分泌IL-4的CD4+T和CD8+T细胞;VLPs诱导产生强大的特异性Ig G2a抗体反应,倾向于Th1型免疫应答;与之相反,PPRV诱导产生更多的Ig G1抗体反应,倾向于Th2型免疫应答;VLPs促进B细胞和DC募集和/或活化,T淋巴细胞增殖和活化,因此,PPRV VLPs具有开发成为安全有效的新型动物疫苗的潜能。第4章:China/tibet/geg/07-30株PPRV病毒样颗粒在High5细胞中的高效表达及其免疫原性研究以期利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统比较病毒样颗粒在High5细胞和Sf9细胞中的表达量,本研究扩增了PPRV China/tibet/geg/07-30株（Gen Bank Access No.FJ905304.1）M、F和H基因,构建了含有目的基因的重组杆状病毒rp FB-M-F-H。以鼠抗M、H蛋白的主要抗原表位区多克隆抗体与绵羊抗PPRV阳性血清对重组杆状病毒感染细胞进行间接免疫荧光（IFA）鉴定,都可见特异性荧光,表明基质膜蛋白与两种囊膜糖蛋白在两种细胞中得到表达;间接免疫荧光试验、Western blot检测及血凝试验试验结果总体表明High5细胞更能高效的包装病毒样颗粒,产量要高于Sf9细胞。以重组杆状病毒感染昆虫High5细胞和Sf9细胞组装病毒样颗粒,放大培养后进行病毒样颗粒纯化。后期将High5细胞生产的病毒样颗粒免疫小鼠和可诱导产生保护性中和抗体和细胞免疫。
张润祥[6]（2013）在《重组牛IFN-λ3的制备及其与IFN-α/IFN-β/IFN-γ抗病毒活性比较研究》文中提出干扰素（Interferon，IFN）是由动物细胞产生的，具有抗病毒、抗肿瘤及免疫调节等作用的一类细胞因子。IFN分为I型、II型和新发现的III型，III型干扰素又称为IFN-λs，其氨基酸水平和蛋白质功能与I型相近。由于IFN-λs受体组织分布特异性，IFN-λs主要在呼吸道、消化道和皮肤黏膜组织以及上皮细胞或某些肿瘤细胞发挥抗病毒作用，与IFN-α相比，能够有效地降低毒副作用。在我国，奶牛病毒性传染病如口蹄疫（FMD）、牛病毒性腹泻病（BVD）和牛传染性鼻气管炎（IBR）等可通过消化道、呼吸道传播的疫病，至今危害仍比较严峻，因此牛IFN-λs成为继IFN-α和IFN-β后，抗病毒制剂研发的一个方向。为深入研究牛IFN-λs的抗病毒活性及其机制，揭示其用于防治牛病毒病的可行性，本研究利用毕赤酵母分泌表达系统表达了无冗余氨基酸的重组牛IFN-λ3，同时酵母分泌表达了重组牛IFN-α和IFN-β，大肠杆菌表达系统表达了重组牛IFN-β和IFN-γ，深入研究了各重组干扰素的抗病毒活性，比较了IFN-λ3与I型和II型干扰素单独或联合应用抗病毒活性的异同，主要研究内容如下：1.首先在毕赤酵母表达系统实现了无冗余氨基酸重组牛IFN-λ3的可溶性表达。参考酵母密码子使用偏好性，同时考虑自由能和二级结构等要素，将已知的牛IFN-λ3（boIFN-λ3）基因序列优化成适合酵母表达的最优序列，然后利用重叠延伸PCR技术将设计的相互重叠20bp左右的14条寡核苷酸融合，获得boIFN-λ3基因和及其等位基因命名为boIFN-λ3*（1个基因差异使得成熟肽第18位氨基酸不同）。通过酶切连接的方式，成功构建酵母分泌表达载体pPICZαA-boIFN-λ3和pPICZαA-boIFN-λ3*。在毕赤酵母表达系统中通过一系列的筛选鉴定，如阳性重组酵母菌的鉴定，高表达酵母菌株的筛选，诱导表达条件的优化等最终表达了重组boIFN-λ3和boIFN-λ3*蛋白，表达量均可达1.2g/L，均以糖基化蛋白（23kDa大小，占总蛋白70%左右）和非糖基化蛋白（18kDa大小，占总蛋白15%左右）2种形式表达。经硫酸铵盐析和阳离子交换层析获得了纯化蛋白，重组蛋白均具有良好的抗原性，同时制备了抗boIFN-λ3*多抗。在MDBK-VSV系统测定重组boIFN-λ3和boIFN-λ3*蛋白的生物学效价分别为2.39±0.15×106U/mg/ml和2.15±0.40×106U/mg/ml。理化特性方面，重组蛋白均对胰酶敏感，对热较为不敏感（63℃），对酸碱部分敏感（pH2活性下降2倍），可被特异性抗体中和。从重组蛋白的表达、纯化、糖基化分析、理化特性、生物学活性和致细胞毒性等综合分析，重组蛋白boIFN-λ3和boIFN-λ3*没有区别。2.表达纯化了重组牛IFN-α/IFN-β/IFN-γ并初步测定了它们的生物学活性。为比较重组boIFN-λ3与I型和II型IFN的抗病毒活性，酵母分泌表达系统表达了重组牛IFN-α和IFN-β，大肠杆菌系统表达纯化了重组牛IFN-β和IFN-γ，测定它们的生物学活性分别为1.50±0.98×107、1.25±0.38×104、2.44±0.91×103和0.81±0.21×105U/mg/ml。在MDBK-VSV系统中4种重组干扰素抗病毒效价大小排序为boIFN-α>boIFN-λ3> boIFN-γ>boIFN-β。在EBK和MDBK细胞上利用MTT法测定4种重组干扰素的细胞毒性，结果显示，重组boIFN-λ3和其他IFNs单独或联合应用致细胞毒性均较小。3.重组boIFN-λ3和boIFN-α/boIFN-β/boIFN-γ诱导Mx1蛋白和ISRE启动子活性的研究。经过Western blot检测重组boIFN-λ3在4种上皮细胞源细胞（EBK、BT、MDBK和BMEC）中均能够诱导产生Mx1蛋白。采用双荧光素酶报告基因系统，通过检测ISRE报告基因的表达水平来间接反映干扰素的生物活性。结果显示不同浓度的重组IFNs诱导启动子表达均呈一定程度的剂量依赖性，重组boIFN-λ3和boIFN-γ诱导报告基因的表达水平呈时间依赖性，48h达到较高水平；而boIFN-α和boIFN-β能够快速的诱导报告基因表达，干扰素作用12h即达到较高的水平，且维持到48h。联合应用时部分组合比单独应用时诱导ISRE活性高。因此各IFNs刺激产生的ISRE启动子活性的差异可能是重组boIFN-λ3与其他IFNs协同抗病毒活性的机理之一。4.比较研究了重组boIFN-λ3和重组boIFN-α/boIFN-β/boIFN-γ抗IBRV、FMDV和BVDV的研究。通过TCID50法测定抗IBRV和FMDV活性，抗cpBVDV采用噬斑减数法，抗ncpBVDV采用半定量RT-PCR法。结果显示重组boIFN-λ3和其他3种重组IFNs均具有抗IBRV和FMDV的活性，且呈一定程度的剂量和时间依赖性。其中抗FMDV活性较强，抗IBRV活性较弱。重组boIFN-λ3可条件性的抑制cpBVDV和ncpBVDV的增殖，即在先孵育干扰素后感染病毒时，重组boIFN-λ3可抑制BVDV增殖，反之则没有作用。5.重组boIFN-λ3和boIFN-α/boIFN-β/boIFN-γ协同抗病毒的研究。通过测定干扰素作用后的病毒-细胞混悬液的TCID50，结果显示重组boIFN-λ3抗IBRV时和boIFN-γ协同作用强，抗FMDV时，boIFN-λ3在EBK和BT细胞上均显示出和boIFN-α/boIFN-β明显的协同作用，提示在临床应用时可以联合应用重组boIFN-λ3和其他干扰素。推测协同机制可能与ISRE启动子活化水平及干扰素刺激基因（ISGs）的表达等有关。6. ncpBVDV持续性细胞感染是否影响重组boIFN-λ3抗病毒活性的研究。ncpBVDV（HLJ-11）感染MDBK细胞后在不同浓度重组boIFN-λ3和重组boIFN-α压力筛选下传代8次，通过半定量RT-PCR检测BVDV核酸，结果显示在干扰素压力下，病毒可以耐受干扰素，造成细胞持续性感染，而此种状态下的MDBK细胞仍能感染VSV，且不影响重组boIFN-λ3在此细胞上发挥抗VSV活性，因此这种细胞是耐受BVDV同时对IFN敏感的细胞。另一方面，ncpBVDV预先感染MDBK细胞不影响boIFN-λ3和其他IFNs在此细胞上发挥抗VSV和IBRV的作用。因此，牛IFN-λ3蛋白的研制及其与I型和II型干扰素抗病毒活性的深入比较研究为进一步了解牛IFN-λs的生物学功能提供了理论基础并为抗病毒制剂的制备提供了物质材料。
李公美[7]（2013）在《吉林白鹅α/γIFN原核表达、抗病毒活性及其核酸疫苗免疫佐剂作用的研究》文中进行了进一步梳理由于干扰素具有良好的广谱抗病毒活性和有效的免疫调节功能,对于研发有效的抗病毒生物制剂及增强疫苗效果的佐剂具有重要的意义。本研究利用基因工程技术,以吉林白鹅α/γ干扰素基因（JGIFN-α/γ）为研究对象,对其进行了克隆、表达及抗病毒活性研究。同时为了进一步研究JGIFN-γ作为佐剂的免疫增强作用,成功构建了带有分子免疫佐剂JGIFN-γ的GPV-VP3基因疫苗并对雏鹅进行了免疫,为研发高效的鹅细小病毒基因疫苗奠定了基础,本研究具体进行了以下几方面的工作：1、吉林白鹅α干扰素成熟肽原核表达及抗病毒活性的研究参照已克隆得到的JGIFN-α完整的ORF基因序列设计了一对特异性引物,克隆得到了编码α干扰素的成熟肽基因（mJGIFN-a）。利用pET28a （+）作为原核表达载体,成功构建了吉林白鹅α干扰素基因的原核表达质粒pET-mJGIFN-a。将该重组表达质粒转化入E.coli Rossetta菌中进行了表达,经IPTG诱导、SDS-PAGE和western-blot分析表明获得了分子量为22ku的包涵体蛋白。将包涵体蛋白经Ni-IMAC亲和层析法纯化及稀释透析复性后,得到了与预期结果一致nJGIFN-a重组蛋白。采用微量细胞病变抑制法分析mJGIFN-a重组蛋白的抗病毒活性,表明其抗病毒活性为7.9×102U/mL,比活性为1.3×103U/mg。同时通过FQ-PCR方法研究动态检测抗鹅细小病毒（GPV）的生物活性,结果发现该重组蛋白能够抑制GPV的复制,具有明显的抗病毒活性,为制备应用于临床上的抗病毒生物制剂研究提供了科学依据。2、吉林白鹅γ干扰素基因序列分析、原核表达及抗病毒活性采用RT-PCR的方法从吉林白鹅外周血单核细胞中扩增得到了Y干扰素基因（JGIFN-γ）,构建了重组克隆质粒pMD-JGIFN-γ。利用生物信息学软件及在线分析软件对JGIFN-γ基因的核酸及氨基酸序列进行了分析。分析13个不同动物的相关基因结果表明JGIFN-γ与同为水禽的鸭、鹅的核苷酸和氨基酸同源性均高于90%,在进化树上位于同一分支。JGIFN-γ蛋白含有4个潜在的疏水区、3个N-糖基化位点、10个磷酸化位点。对其亚细胞定位预测结果为大部分蛋白分布于在细胞核内,其余分别在线粒体、细胞质、质膜上、内质网上、高尔基氏体及细胞外,为进一步研究γ干扰素蛋白的功能特性提供了理论依据。二级结构预测结果显示该肽链主要由α-螺旋组成,包括4个抗原指数较高的抗原表位,表明γ干扰素具有良好的抗原性,为进一步研究其作为分子佐剂提供了理论依据。同时成功的构建了原核表达质粒pET-JGIFN-γ,获得了JGIFN-γ重组蛋白,将该重组蛋白经Ni-IMAC亲和纯化及稀释透析复性后,采用微量细胞病变抑制发分析其抗病毒活性,结果表明其抗病毒活性为1.9×102U/mL,比活性为4.3×102U/mg,为研究γ干扰素蛋白的生物学活性提供了科学依据。3、吉林白鹅IFN-γ及其与VP3融合基因核酸疫苗的制备与表达研究通过重叠延伸PCR （SOE-PCR）技术得到包含了缺失TAA终止密码子的JGIFN-γ基因和缺失了ATG起始密码子的VP3的融合基因JGIFN-γ-VP3,两个基因之间由高亲水性氨基酸Gly-Gly-Gly-Ser编码的核苷酸连接起来。分别将JGIFN-γ和JGIFN-γ-VP3融合基因通过基因重组技术正向插入到pVAX1CMV启动子下游BamHI和HindⅢ酶切位点之间,成功构建了真核重组表达质粒pVAX-JGIFN-γ和pVAX-JGIFN-γ-VP3。利用脂质体介导法将其转入Vero细胞中,通过间接免疫荧光技术和RT-PCR技术证实JGIFN-γ基因和JGIFN-γ-VP3融合基因在Vero细胞中获得了表达,为进一步研究γ干扰素基因作为基因疫苗的分子佐剂奠定了基础。4、GIFNγ-VP3真核表达质粒对雏鹅的免疫研究为研究真核重组表达质粒pVAX-JGIFN-γ+pVAX-VP3/pVAX-JGIFNγ-VP3免疫调节特性,将不同剂量pVAX-JGIFN-γ-VP3质粒和不同剂量pVAX-JGIFN-γ质粒与pVAX-VP3质粒联合使用免疫28日龄鹅。同时设pVAX-VP3质粒免疫组、小鹅瘟弱毒疫苗、pVAX1、生理盐水对照组。对不同时间点鹅外周血淋巴细胞增殖试验的结果表明,pVAX-JGIFN-γ-VP3基因免疫组细胞免疫水平高于pVAX-JGIFN-γ+pVAX-VP3基因疫苗免疫组,同类疫苗中且呈现剂量相关性。分子佐剂基因疫苗免疫组显着高于pVAX-VP3基因疫苗免疫组但显着低于GPV弱毒疫苗组（P<0.05）。间接ELISA方法检测鹅体内IgG动态变化规律结果表明,pVAX-JGIFN-γ-VP3和pVAX-JGIFN-γ+pVAX-VP3所诱导的体液免疫的抗体水平,明显高于pVAX-VP3单基因疫苗免疫组（P<0.05）,但显着低于GPV弱毒疫苗组（P≤0.05）。同时采用微量血清中和抗体试验检测了各组疫苗免疫后所诱导的中和抗体水平结果表明,各基因疫苗和GPV弱毒株均能较长时间诱导雏鹅产生针对GPV的中和抗体,含分子佐剂GPV-VP3基因疫苗的中和抗体水平比不含佐剂的GPV-VP3基因疫苗组高；而注射pVAX1和生理盐水的对照组均不能保护GPV对鹅成纤维细胞的感染,说明了DNA基因疫苗和GPV弱毒疫苗免疫所诱导的中和抗体均在一定程度上可以保护GEF不被GPV感染。
汪正华[8]（2013）在《蛋白质谷氨酰胺酶基因的合成、表达及性质研究》文中研究指明大多数食品蛋白因含丰富的谷氨酰胺残基,而导致其溶解度较低,低溶解度会影响乳化性、发泡性和凝胶性等功能性质,大大限制了在食品工业上的应用。蛋白质的脱酰胺作用被公认为提高溶解度的最有前景的途径,已经成为国内外研究的热点。蛋白质谷氨酰胺酶（Protein-glutaminase, PG）是引起脱酰胺作用的一种新型水解酶,最早在金黄棒状杆菌（Chryseobacterium proteolyticum）中发现,该酶可有效改善酪蛋白、小麦蛋白、米谷蛋白等食品蛋白的溶解度,提高乳化性、凝胶性等功能性质,在食品工业中具有十分广泛的应用前景。本课题利用基因工程技术,采用大肠杆菌和枯草芽孢杆菌两种表达系统,对蛋白质谷氨酰胺酶进行重组表达,得到有生物学活性的PG酶,并对该酶进行性质研究,为今后PG酶的研究和开发提供了参考。本课题研究的主要内容包括以下三个方面：1、蛋白质谷氨酰胺酶基因的人工合成对PG全长基因序列进行优化,优化后设计成24条相互重叠的寡核苷酸片段,每条片段大约60bp,且重叠部分大约20bp。通过重叠延伸PCR反应将这24条寡核苷酸片段拼接起来,得到一条全长为982bp的PG全长基因。合成后将长片段克隆至pUC19-T载体上,进行序列分析,结果表明由Assembly PCR组装成的长片段基因在第724位碱基处多出一个胸腺嘧啶（T）,发生了移码突变。再次设计两对引物,通过重叠延伸PCR对该序列进行定点诱变,经测序分析,获得了序列完全正确的PG全长基因。2、蛋白质谷氨酰胺酶在大肠杆菌表达系统中的表达与活性检测以pUC19-T-PG为模板,PCR扩增出PG成熟肽序列,克隆至原核表达载体pET32a（+）上,转化大肠杆菌BL21（DE3）,得到基因工程菌。通过IPTG和乳糖自诱导两种方式表达重组蛋白,结果表明重组蛋白主要以包涵体形式表达,乳糖自诱导表达途径的蛋白产量是IPTG诱导的5.3倍。通过降低诱导温度和共表达分子伴侣两种策略,以期实现重组蛋白的可溶性表达,结果表明低温对可溶性的提高有一定的作用,而分子伴侣影响甚微。收集包涵体,经变性、复性后获得活性PG,通过Ni离子亲和层析对复性后的PG酶进行纯化。将纯化的PG酶与底物Cbz-Gln-Gly进行孵育反应,结果表明,PG可有效水解Cbz-Gln-Gly谷氨酰胺残基上的氨酰基,释放出氨；酶学性质的研究表明,PG酶的最适反应温度为40℃,最适作用pH为6.0。3、蛋白质谷氨酰胺酶在枯草芽孢杆菌表达系统中的表达与活性检测在本章节中,构建了两种新型的大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭载体pHPW和pCW。利用重叠延伸PCR技术将强启动子p43序列和中性蛋白酶信号肽nprB序列进行无缝连接,得到p43-nprB片段,将其克隆至pHP13中,得到穿梭载体pHPW。以pUC19-T-PG为模板,PCR扩增出PG成熟肽序列,克隆到pHPW中,得到重组表达载体pHPW-PG。再将pHPW-PG转化枯草芽孢杆菌DB403,获得基因工程菌pHPW-PG/DB403。发酵表达并提取PG粗酶,用SDS-PAGE检测PG酶的表达情况,结果表明,穿梭载体pHPW可有效将PG酶分泌于细胞外。用二肽Cbz-Gln-Gly溶液作为反应底物检测PG酶活性,表明PG粗酶可有效脱去二肽中谷氨酰胺残基的氨酰基,释放出氨；用小麦蛋白、酪蛋白和面筋作为酶解底物,结果显示PG粗酶能提高溶解度。本实验构建了另一种新型的穿梭载体——pCW,该载体带有低温诱导型启动子des和中温α淀粉酶信号肽SamyQ。将PG酶成熟肽基因克隆至穿梭载体pCW中,转化DB403,得到基因工程菌pCW-PG/DB403,在25℃环境条件下,发酵表达外源蛋白。经SDS-PAGE验证,得到了较为单一的蛋白条带,说明降低培养温度可抑制DB403自身蛋白的分泌,而启动子des依旧可以启动外源蛋白的分泌表达,证实pCW具有低温诱导的功能。提取PG粗酶,用二肽Cbz-Gln-Gly和酪蛋白溶液作为酶解底物,检测PG酶的活性,结果表明PG粗酶可有效脱去二肽中谷氨酰胺残基的氨酰基,释放出氨；酶解酪蛋白的实验表明PG粗酶可提高酪蛋白的溶解度。以上结果表明,本课题构建的两种新型穿梭载体pHPW和pCW,均具有分泌表达外源基因的功能。通过功能性实验,验证了这两种载体表达的PG酶均具有一定的生物学活性。pHPW和pCW的构建,为外源基因在枯草芽孢杆菌中的表达提供了新的途径,尤其是低温诱导型载体pCW,更显示出一定的应用前景。本实验构建的两种基因工程菌pHPW-PG/DB403和pCW-PG/DB403,均能表达有活性的PG酶,为今后该酶的研究和开发提供了参考。
蔡家利,户国达,孙加燕,尹忠宝,张存亮,陈文毫[9]（2013）在《重组猪IFNα的构建及原核可溶性表达研究》文中提出使用原核表达系统可溶性表达猪α-干扰素,并进行纯化和鉴定。根据Gene Bank中报道的猪α-干扰素成熟肽基因序列设计引物,以猪肝脏细胞基因组DNA为模板,用PCR方法扩增猪α-干扰素成熟肽基因,并将其定向克隆到原核表达载体pET32a+中,转化大肠杆菌DH5a。阳性克隆经PCR鉴定、双酶切鉴定以及测序鉴定后,转入大肠杆菌BL21进行诱导表达。对表达产物进行SDS-PAGE分析、镍柱亲和层析纯化、Western-blot鉴定。结果表明:成功构建了猪α-干扰素原核表达载体pET32a+-poIFN-α;表达产物经SDS-PAGE分析,在相对分子质量约3.8×104的位置出现了目的蛋白条带,与预期相符;Western-blot鉴定显示有特异性条带出现。实现了重组猪α-干扰素的可溶性表达,获得了纯度较高的重组猪α-干扰素,为进一步研究其药物作用奠定了基础。
崔子寅[10]（2012）在《具抗病毒活性无冗余氨基酸牛α干扰素（A亚型）表达策略研究》文中研究表明干扰素（Interferon, IFN）是由机体特定细胞产生的一类具有抗病毒、抗肿瘤、调节免疫功能等多种生物活性的分泌型糖蛋白,是机体防御系统的重要组成部分。在众多干扰素类型中,干扰素α的广谱抗病毒能力最为显着。体外表达的重组牛α干扰素（Bovine Interferon-α, BoIFN-α）蛋白可以抑制水泡性口炎病毒（VSV）、口蹄疫病毒（FMDV）、牛病毒性腹泻病毒（BVDV）:和副流感病毒（PIV）等病毒的增殖和复制。至今为止,大肠杆菌表达系统和巴斯德毕赤酵母表达系统是表达重组牛α干扰素的普遍系统。然而,重组牛α干扰素在大肠杆菌表达系统中多以无生物学活性的包涵体形式存在,在毕赤酵母表达系统中多存在蛋白表达不稳定、产量低等问题。因此,探索出一套可以稳定直接表达具有生物学活性无冗余氨基酸的重组牛α干扰素的方法就更具生产与应用价值。本研究综合多种有利于直接表达具有活性重组蛋白的条件创建了三种具抗病毒活性牛α干扰素表达策略,即大肠杆菌周质分泌表达策略、大肠杆菌内含肽融合标签表达策略和巴斯德毕赤酵母分泌表达策略。前两种表达策略利用大肠杆菌表达系统,以原有pWL-BoIFN-α质粒为模板,PCR获得经过遗传密码子优化后的牛α干扰素A亚型基因,分别与信号肽基因和内含肽基因无缝融合,构建了pET-22b-pelB-BoIFN-α、pMal-c2X-SDI-BoIFN-α、pColdⅢ-SDI-BoIFN-α等一系列表达载体,最终实现具抗病毒活性的牛α干扰素A亚型蛋白在大肠杆菌表达系统中的活性表达。巴斯德毕赤酵母分泌表达策略,以新鲜牛肝脏提取的牛基因组为模板,PCR获得成熟肽天然牛α干扰素A亚型基因,将此基因连接入载体pPICZaA中,成功构建毕赤酵母分泌型表达载体pPICZaA-BoIFN-α,实现牛α干扰素A亚型重组蛋白在真核毕赤酵母表达系统中的高效具活性分泌表达。三种具抗病毒活性表达策略共获得了四种活性牛α干扰素蛋白,通过细胞病变抑制法,在MDBK细胞上检测其对VSV和BVDV的抗病毒活性,并且对四种活性蛋白的存在形式、表达量、抗VSV活性、抗BVDV活性和培养成本等进行对比,得出巴斯德毕赤酵母表达系统表达牛α干扰素更适于工业化的开发和大规模生产,为研制和工业化生产牛抗病毒干扰素制剂做出了有意义的探索。
二、Primary Purification of Co-expressed Soluble and Insoluble Alpha-interferon 2b from Recombinant E. coli（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、Primary Purification of Co-expressed Soluble and Insoluble Alpha-interferon 2b from Recombinant E. coli（论文提纲范文）
（1）多氯联苯全细胞生物传感器的研究以及几丁质酶在毕赤酵母GS115的高效表达（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 多氯联苯概述 |
| 1.1.1 多氯联苯理化性质 |
| 1.1.2 多氯联苯的危害 |
| 1.2 PCBs的生物降解途径 |
| 1.3 联苯双加氧酶研究进展 |
| 1.3.1 联苯双加氧酶 |
| 1.3.2 研究进展 |
| 1.4 XylS/Pm调控系统及其研究进展 |
| 1.4.1 XylS/Pm调控系统 |
| 1.4.2 XylS/Pm的研究进展 |
| 1.5 多氯联苯全细胞生物传感器 |
| 1.5.1 全细胞生物传感器 |
| 1.5.2 多氯联苯全细胞生物传感器研究进展 |
| 1.6 本课题研究意义 |
| 第2章 材料与方法 |
| 2.1 实验材料与仪器 |
| 2.1.1 实验所用菌株 |
| 2.1.2 质粒 |
| 2.1.3 培养基及抗生素 |
| 2.1.4 引物 |
| 2.1.5 酶与生化试剂 |
| 2.1.6 主要仪器设备 |
| 2.2 方法与步骤 |
| 2.2.1 DNA的酶切 |
| 2.2.2 DNA产物的回收 |
| 2.2.3 载体的构建 |
| 2.2.4 大肠杆菌感受态细胞的制备及转化 |
| 2.2.5 大肠杆菌重组子PCR鉴定 |
| 2.2.6 枯草芽孢杆菌感受态的制备 |
| 2.2.7 定点突变技术 |
| 2.2.8 饱和突变技术 |
| 2.2.9 突变体的筛选 |
| 2.2.10 PCBs降解率的测定 |
| 2.3 计算机模拟 |
| 2.3.1 Fireprot设计突变位点 |
| 2.3.2 结构模拟 |
| 2.3.3 分子对接 |
| 第3章 结果与分析 |
| 3.1 氯苯甲酸传感途径的构建 |
| 3.1.1 氯苯甲酸传感途径表达载体的构建 |
| 3.1.2 氯苯甲酸传感途径最优宿主的选择 |
| 3.1.3 氯苯甲酸传感途径对不同苯甲酸的感应能力 |
| 3.2 PCBs好氧降解为氯苯甲酸途径的构建 |
| 3.2.1 PCBs好氧降解途径表达载体的构建 |
| 3.2.2 好氧降解途径对PCBs的代谢 |
| 3.2.3 Cbx菌株对PCBs的感应 |
| 3.3 联苯双加氧酶Bph A1 分子改造 |
| 3.3.1 联苯双加氧酶T335A/F336M双突变体的构建 |
| 3.3.2 基于Fire Prot的分子改造 |
| 3.4 XylS的分子改造 |
| 3.4.1 通过I-TASSER模拟XylS结构 |
| 3.4.2 XylS与三氯苯甲酸的分子对接 |
| 3.4.3 A111 单点饱和突变体库的构建及筛选 |
| 3.4.4 F3Y/I50T/F96L/E195G/M196T五突变体的构建 |
| 3.4.5 Cb3x5 菌株对PCBs的响应 |
| 3.5 氯苯甲酸传感菌株在传代过程中不稳定问题 |
| 3.6 E.coli/ B.subtilis/ B.velezensis/P.putida对 PCBs的耐受性 |
| 3.7 B.subtilis SCK6 中构建PCBs生物传感器 |
| 3.7.1 SCK6 中构建PCBs好氧降解途径 |
| 3.7.2 SCK6 中构建氯苯甲酸传感途径 |
| 3.8 讨论与展望 |
| 第4章 几丁质酶在毕赤酵母GS115 中的表达 |
| 4.1 引言 |
| 4.1.1 几丁质 |
| 4.1.2 几丁质酶 |
| 4.1.3 提高异源蛋白在毕赤酵母中的表达策略 |
| 4.1.4 本课题研究意义 |
| 4.2 实验材料与仪器 |
| 4.2.1 实验菌株 |
| 4.2.2 质粒 |
| 4.2.3 培养基 |
| 4.2.4 引物 |
| 4.2.5 主要溶液 |
| 4.2.6 酶与生化试剂 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 T_5核酸外切酶法构建表达载体 |
| 4.3.2 T_4DNA聚合酶处理片段 |
| 4.3.3 毕赤酵母表达载体的构建 |
| 4.3.4 p GAP-HAC1/ERV29/GOG5/SEC16/TRM1 的构建 |
| 4.3.5 毕赤酵母GS115 感受态的制备及转化 |
| 4.3.7 毕赤酵母GS115 重组子的筛选 |
| 4.3.8 毕赤酵母GS115 重组几丁质酶菌株摇瓶诱导表达 |
| 4.3.9 SDS-PAGE检测 |
| 4.3.10 Bradford法检测蛋白质浓度 |
| 4.3.11 ChiA酶活测定 |
| 4.3.12 毕赤酵母高密度发酵 |
| 4.3.13 ChiA水解高浓度胶体几丁质 |
| 4.3.14 ChiA联合Bs Nag Z水解得到Glc NAc |
| 4.3.15 ChiA水解产物促进水稻小麦的生长 |
| 4.4 结果与分析 |
| 4.4.1 几丁质酶表达载体的构建 |
| 4.4.2 ChiA在毕赤酵母中摇瓶诱导表达 |
| 4.4.3 ChiA与分子伴侣共表达 |
| 4.4.4 ChiA5L发酵罐高密度发酵 |
| 4.4.5 ChiA水解不同浓度的胶体几丁质 |
| 4.4.6 ChiA联合Bs Nag Z水解胶体几丁质得到Glc NAc |
| 4.4.7 不同水解产物对水稻和小麦种子萌发的影响 |
| 4.5 讨论与分析 |
| 附录 |
| 参考文献 |
| 硕士研究生期间主要成果介绍 |
| 致谢 |
（2）藏獒犬IFN-γ,IFN-α和IL-18基因克隆、表达及产物活性鉴定（论文提纲范文）
| 摘要 |
| SUMMARY |
| 缩略语表 |
| 第一章 犬干扰素研究进展 |
| 1 IFN概述 |
| 1.1 IFN分类 |
| 1.2 犬IFN理化特性及基因组成 |
| 1.3 IFN的空间结构及受体研究 |
| 1.4 IFN生物学活性及作用机制 |
| 2 犬IFN基因工程研究 |
| 2.1 犬Ⅰ型IFN基因工程研究 |
| 2.2 犬Ⅱ型IFN基因工程研究 |
| 2.3 犬Ⅲ型IFN基因工程研究 |
| 2.4 犬长效IFN研究 |
| 3 犬IFN临床应用 |
| 3.1 治疗犬病毒性传染病 |
| 3.2 治疗犬皮肤性疾病 |
| 3.3 治疗眼科及其他疾病 |
| 4 犬IFN应用展望 |
| 第二章 白细胞介素18研究进展 |
| 1 IL-18概述 |
| 1.1 IL-18的发现、结构、特性 |
| 1.2 IL-18受体及信号传导途径 |
| 1.3 IL-18结合蛋白 |
| 2 IL-18生物学作用 |
| 2.1 IL-18抗肿瘤作用 |
| 2.2 IL-18抗感染作用 |
| 2.3 IL-18免疫调节作用 |
| 3 IL-18与临床疾病的关系 |
| 3.1 IL-18与自身免疫性疾病 |
| 3.2 IL-18与心血管系统疾病的关系 |
| 3.3 IL-18与神经系统疾病的关系 |
| 3.4 IL-18与肿瘤疾病的关系 |
| 3.5 IL-18与糖尿病等其他疾病的关系 |
| 4 IL-18应用展望 |
| 5 本研究的目的及意义 |
| 第三章 藏獒犬IFN-γ和 IFN-α基因克隆与序列分析 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 试验结果 |
| 2.1 淋巴细胞的体外刺激活化 |
| 2.2 RT-PCR扩增藏獒犬IFN-γcDNA |
| 2.3 重组质粒的酶切及PCR鉴定 |
| 2.4 藏獒犬IFN-γ序列测定及分析 |
| 2.5 藏獒犬IFN-α序列测定及分析 |
| 3 讨论 |
| 第四章 藏獒犬IFN-γ和 IFN-α基因的表达、纯化及活性鉴定 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 试验结果 |
| 2.1 藏獒犬pET-30a-IFN-γ和 pET-30a-IFN-α重组表达质粒的鉴定 |
| 2.2 藏獒犬pET-30a-IFN-γ和 pET-30a-IFN-α重组蛋白Western bloting分析 |
| 2.3 藏獒犬pET-30a-IFN-γ和 pET-30a-IFN-α重组蛋白纯化分析 |
| 2.4 藏獒犬IFN-γ抗病毒活性检测 |
| 2.5 藏獒犬IFN-α抗病毒活性检测 |
| 2.6 藏獒犬IFN-α抗病毒临床应用 |
| 3 讨论 |
| 第五章 藏獒犬IL-18基因克隆、表达及生物学活性鉴定 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 试验结果 |
| 2.1 藏獒犬IL-18基因的克隆 |
| 2.2 藏獒犬IL-18基因序列测定及分析 |
| 2.3 藏獒犬IL-18基因比较分析及进化分析 |
| 2.4 pET-30a-IL-18 重组质粒的鉴定 |
| 2.5 pET-30a-IL-18 重组蛋白表达及Western bloting分析 |
| 2.6 pET-30a-IL-18 重组蛋白纯化结果 |
| 2.7 藏獒犬IL-18基因生物学活性鉴定 |
| 3 讨论 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
| 攻读博士学位期间发表论文 |
| 导师简介1 |
| 导师简介2 |
（3）从江香猪源poIFN-α2/β/γ的原核与酵母表达及其抗PRRSV活性研究（论文提纲范文）
| 课题来源 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略词(Abbreviations) |
| 文献综述 |
| 1.PRRSV的研究进展 |
| 1.1 PRRSV的发现 |
| 1.2 PRRSV的结构 |
| 1.3 PRRSV的易感动物 |
| 1.4 PRRSV的传播方式 |
| 1.5 PRRS的临床症状 |
| 1.6 PRRSV的细胞受体 |
| 1.7 PRRSV的免疫应答 |
| 1.7.1 PRRSV抑制宿主细胞IFN的生成 |
| 1.7.2 PRRSV蛋白参与抑制IFN的生成 |
| 1.8 PRRSV的防治 |
| 2.IFN的研究进展 |
| 2.1 IFN的发现 |
| 2.2 IFN的产生 |
| 2.3 IFN的分类 |
| 2.4 Ⅰ型IFN |
| 2.4.1 Ⅰ型IFN的组成 |
| 2.4.2 Ⅰ型IFN的信号传导 |
| 2.5 Ⅱ型IFN |
| 2.5.1 Ⅱ型IFN的组成 |
| 2.5.2 Ⅱ型IFN的信号传导 |
| 2.6 IFN的主要刺激基因 |
| 2.6.1 黏病毒对抗蛋白 |
| 2.6.2 2',5'-寡腺苷酸合成酶 |
| 2.7 IFN抗病毒活性的研究 |
| 试验研究 |
| 第一章 CJ-poIFN-α2/β/γ基因的克隆及生物信息学分析 |
| 1.材料 |
| 1.1 试验动物、载体 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要仪器 |
| 2.方法 |
| 2.1 重组质粒p UCm-T-CJ-poIFN-α2/β/γ的构建 |
| 2.1.1 引物的设计与合成 |
| 2.1.2 样品的采集 |
| 2.1.3 RNA提取 |
| 2.1.4 反转录合成c DNA |
| 2.1.5 CJ-poIFN-α2/β/γ基因的PCR |
| 2.1.6 目的片段纯化 |
| 2.1.7 连接与转化 |
| 2.2 CJ-poIFN-α2/β/γ基因的生物信息学分析 |
| 2.2.1 IFN-α2/β/γ基因的参考序列信息 |
| 2.2.2 CJ-poIFN-α2/β/γ编码蛋白理化性质的分析 |
| 2.2.3 CJ-poIFN-α2/β/γ基因同源性分析 |
| 2.2.4 CJ-poIFN-α2/β/γ编码蛋白二级结构预测 |
| 2.2.5 CJ-poIFN-α2/β/γ编码蛋白磷酸化及糖基化位点预测 |
| 2.2.6 CJ-poIFN-α2/β/γ编码蛋白序列信号肽预测 |
| 2.2.7 CJ-poIFN-α2/β/γ编码蛋白跨膜结构域预测 |
| 3.结果 |
| 3.1 CJ-poIFN-α2/β/γ PCR结果 |
| 3.2 CJ-poIFN-α2/β/γ序列分析结果 |
| 3.2.1 CJ-poIFN-α2/β/γ编码蛋白理化性质分析结果 |
| 3.2.2 CJ-poIFN-α2/β/γ同源性及系统进化树分析结果 |
| 3.2.3 CJ-poIFN-α2/β/γ基因编码蛋白质二级结构的预测结果 |
| 3.2.4 CJ-poIFN-α2/β/γ基因编码蛋白磷酸化位点的预测结果 |
| 3.2.5 CJ-poIFN-α2/β/γ基因编码蛋白N-糖基化位点的预测结果 |
| 3.2.6 CJ-poIFN-α2/β/γ基因编码蛋白O-糖基化位点的预测结果 |
| 3.2.7 CJ-poIFN-α2/β/γ基因编码蛋白信号肽的预测结果 |
| 3.2.8 CJ-poIFN-α2/β/γ编码蛋白跨膜结构域的预测结果 |
| 4.讨论 |
| 第二章 CJ-poIFN-α2/β/γ的原核表达及多克隆抗体的制备 |
| 1.材料 |
| 1.1 试验动物、载体、菌株 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要仪器 |
| 2.方法 |
| 2.1 CJ-poIFN-β/γ原核表达载体的构建及鉴定 |
| 2.1.1 引物设计 |
| 2.1.2 PCR |
| 2.1.3 原核表达重组质粒的构建 |
| 2.2 重组蛋白的诱导表达、纯化及鉴定 |
| 2.2.1 重组蛋白诱导表达及其SDS-PAGE验证 |
| 2.2.2 重组蛋白的Western blotting鉴定 |
| 2.3 CJ-poIFN-γ鼠源多克隆抗体的制备 |
| 2.3.1 重组蛋白CJ-poIFN-γ的纯化及鉴定 |
| 2.3.2 BCA法测定重组蛋白CJ-poIFN-γ的浓度 |
| 2.3.3 动物免疫与血清收集 |
| 2.3.4 ELISA方法检测高免血清的效价 |
| 2.3.5 Western blotting方法鉴定高免血清的反应性 |
| 3.结果 |
| 3.1 CJ-poIFN-α2/β/γ原核表达载体构建的结果 |
| 3.2 重组原核表达蛋白的SDS-PAGE与Western blotting检测结果 |
| 3.2.1 携带重组质粒CJ-poIFN-α2-p ET28a的鉴定结果 |
| 3.2.2 携带重组质粒CJ-poIFN-β-p ET28a的鉴定结果 |
| 3.2.3 携带重组质粒CJ-poIFN-γ-p ET28a的鉴定结果 |
| 3.3 抗CJ-poIFN-γ高免血清的制备结果 |
| 3.3.1 BCA法测定重组蛋白浓度的结果 |
| 3.3.2 ELISA方法检测高免血清效价的结果 |
| 3.3.3 Western blotting方法检测高免血清反应性的结果 |
| 4.讨论 |
| 4.1 CJ-poIFN-α2 的原核表达 |
| 4.2 CJ-poIFN-β/γ的原核表达 |
| 4.3 抗CJ-poIFN-γ高免血清的制备 |
| 第三章 CJ-poIFN-α2/β/γ的酿酒酵母表达 |
| 1.材料 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要仪器 |
| 2.方法 |
| 2.1 CJ-poIFN-α2/β/γ酿酒酵母真核表达载体的构建 |
| 2.1.1 引物设计与PCR |
| 2.1.2 目的片段的纯化 |
| 2.1.3 p YES2质粒提取 |
| 2.1.4 酶切与连接 |
| 2.1.5 重组质粒转化 |
| 2.1.6 重组质粒的筛选 |
| 2.2 重组质粒转化酿酒酵母INVSc1 |
| 2.2.1 酿酒酵母INVSc1感受态细胞的制备 |
| 2.2.2 重组质粒的转化 |
| 2.2.3 转化子PCR鉴定 |
| 2.3 酿酒酵母表达的CJ-poIFN-α2/β/γ的诱导表达与鉴定 |
| 2.3.1 酿酒酵母表达的CJ-poIFN-α2/β/γ的诱导表达 |
| 2.3.2 酿酒酵母表达的CJ-poIFN-α2/β/γ的鉴定 |
| 3.结果 |
| 3.1 CJ-poIFN-α2/β/γ酿酒酵母真核表达载体的构建结果 |
| 3.1.1 重组质粒CJ-poIFN-α2/β/γ-p YES2构建结果 |
| 3.1.2 重组质粒转化酿酒酵母菌株INVSc1的结果 |
| 3.2 酿酒酵母表达的CJ-poIFN-α2/β/γ诱导表达的结果 |
| 3.2.1 不同时间段菌液OD600的结果 |
| 3.2.2 不同时间段菌液PCR结果 |
| 3.2.3 酿酒酵母表达的CJ-poIFN-α2/β/γ SDS-PAGE结果 |
| 3.2.4 酿酒酵母表达的CJ-poIFN-α2/β/γ Western blotting结果 |
| 3.2.5 酿酒酵母表达的CJ-poIFN-α2/β/γ ELISA结果 |
| 4.讨论 |
| 4.1 酿酒酵母表达的重组蛋白的诱导培养条件 |
| 4.2 酿酒酵母细胞的裂解 |
| 4.3 酿酒酵母真核表达载体 |
| 第四章 酿酒酵母表达的CJ-poIFN-α2/β/γ抗PRRSV活性研究 |
| 1.材料 |
| 1.1 主要材料 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要仪器 |
| 2.方法 |
| 2.1 引物设计 |
| 2.2 Marc-145、PK15细胞的培养 |
| 2.2.1 Marc-145、PK15的复苏 |
| 2.2.2 Marc-145、PK15的传代 |
| 2.2.3 Marc-145、PK15的冻存 |
| 2.3 酿酒酵母表达的CJ-poIFN-α2/β/γ抑制PRRSV的活性测定 |
| 2.4 酿酒酵母表达的CJ-poIFN-α2/β/γ对PRRSV N m RNA水平的影响 |
| 2.4.1 RNA的提取 |
| 2.4.2 反转录 |
| 2.4.3 q-PCR检测 |
| 2.5 酿酒酵母表达的CJ-poIFN-α2/β/γ对PRRSV N蛋白水平的影响 |
| 2.6 酿酒酵母表达的CJ-poIFN-α2/β/γ的ELISA检测 |
| 2.7 酿酒酵母表达的CJ-poIFN-α2/β/γ对OAS、Mx1 m RNA水平的影响 |
| 3.结果 |
| 3.1 酿酒酵母表达的CJ-poIFN-α2/β/γ抗PRRSV活性测定的结果 |
| 3.2 酿酒酵母表达的CJ-poIFN-α2/β/γ对PRRSV N m RNA水平影响的结果 |
| 3.3 酿酒酵母表达的CJ-poIFN-α2/β/γ对PRRSV N蛋白水平影响结果 |
| 3.4 酿酒酵母表达的CJ-poIFN-α2/β/γ ELISA检测结果 |
| 3.5 酿酒酵母表达的CJ-poIFN-α2/β/γ对OAS、Mx1 m RNA水平影响的结果 |
| 4.讨论 |
| 4.1 CJ-poIFN抑制PRRSV活性的测定 |
| 4.2 酿酒酵母表达的CJ-poIFN对PRRSV复制的影响 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 附录一 发表文章 |
| 附录二 各种培养基、溶液及试剂的配制 |
| 致谢 |
（4）猪圆环病毒2型Cap标记蛋白的重组杆状病毒表达研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 文献综述 |
| 1 猪圆环病毒研究进展 |
| 1.1 病原学 |
| 1.2 流行病学 |
| 1.3 PCVD的防治及疫苗研究状况 |
| 1.3.1 商品化PCV2疫苗 |
| 1.3.2 新型疫苗的研发 |
| 2 昆虫细胞杆状病毒表达系统 |
| 2.1 杆状病毒载体 |
| 2.1.1 杆状病毒 |
| 2.1.2 杆状病毒载体的构建 |
| 2.2 昆虫细胞培养 |
| 2.3 昆虫细胞杆状病毒表达系统的应用 |
| 3 V5与Flag表位标签概述 |
| 4 研究目的及意义 |
| 第二章 PCV2 ORF2基因的生物信息学分析及Flag表位标签的引入 |
| 1 材料 |
| 1.1 PCV2基因组核苷酸序列 |
| 1.2 生物信息学软件及网络数据库 |
| 1.3 菌株、毒株及主要试剂 |
| 1.4 实验主要仪器设备 |
| 2 方法 |
| 2.1 特异性引物 |
| 2.2 PCV2 GZ-RH1株ORF2基因分析 |
| 2.3 PCV2 GZ-RH1株ORF2基因编码的氨基酸分析 |
| 2.4 PCV2 GZ-RH1株的ORF2基因密码子偏好性分析 |
| 2.5 pMD19-T-PCV2质粒的构建及鉴定 |
| 2.5.1 病毒DNA的提取 |
| 2.5.2 感受态细胞的制备 |
| 2.5.3 pMD19-T-PCV2质粒的构建 |
| 2.6 pMD19-T-PCV2-Flag质粒的构建及鉴定 |
| 3 结果 |
| 3.1 PCV2 GZ-RH1株ORF2基因的核苷酸序列分析 |
| 3.2 PCV2 GZ-RH1株ORF2基因的核苷酸及氨基酸同源性分析 |
| 3.3 PCV2 GZ-RH1株ORF2基因构建的系统进化树分析 |
| 3.4 PCV2 GZ-RH1株ORF2编码的蛋白预测分析 |
| 3.4.1 ORF2编码的Cap蛋白基本特性分析 |
| 3.4.2 ORF2编码的Cap蛋白潜在磷酸化位点 |
| 3.4.3 ORF2编码的蛋白基序和结构域分析 |
| 3.4.4 PCV2编码的Cap蛋白结构预测分析 |
| 3.5 PCV2 GZ-RH1株ORF2基因密码子偏爱性分析 |
| 3.6 pMD19-T-PCV2质粒的构建 |
| 3.7 pMD19-T-PCV2-Flag质粒的构建 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第三章 携带标记的PCV2 Cap蛋白的重组杆状病毒表达载体的构建 |
| 1 材料 |
| 1.1 毒株、质粒和细胞 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 实验主要仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 V5和Flag标记的Cap蛋白的结构预测与引物设计 |
| 2.2 标记PCV2 Cap蛋白的重组杆状病毒表达载体的构建策略 |
| 2.3 重组转移载体的构建及鉴定 |
| 2.3.1 ORF2-V5、ORF2-Flag的T克隆 |
| 2.3.2 pFastBacHTA-ORF2-V5与pFastBacHTA-ORF2-Flag的构建及鉴定 |
| 2.4 杆粒rBacmid-Cap-V5和rBacmid-Cap-Flag的制备 |
| 2.5 Sf-9细胞的培养 |
| 2.6 细胞转染及病毒粒子收集 |
| 2.7 昆虫杆状病毒粒子的观察 |
| 2.8 感染杆状病毒的Sf-9细胞的IFA检测 |
| 2.9 重组标记蛋白表达的Western-blotting检测 |
| 3 结果 |
| 3.1 V5和Flag标记的Cap蛋白的结构预测 |
| 3.2 重组转移载体的构建及鉴定 |
| 3.2.1 ORF2-V5、ORF2-Flag的T克隆 |
| 3.2.2 pFastBacHTA-ORF2-V5与pFastBacHTA-ORF2-Flag的构建及鉴定 |
| 3.3 rBacmid-Cap-V5和rBacmid-Cap-Flag的制备 |
| 3.4 细胞转染及病毒粒子收集 |
| 3.5 重组杆状病毒的透射电子显微镜观察 |
| 3.6 感染杆状病毒的Sf-9细胞的IFA检测 |
| 3.7 Western-blotting试验结果 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 附录一 攻读硕士学位期间所获成果 |
| 致谢 |
（5）PPRV病毒样颗粒的构建、制备及免疫原性研究（论文提纲范文）
| 英文缩写词表 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一篇 文献综述 |
| 第一章 小反刍兽疫及小反刍兽疫病毒概述 |
| 1 小反刍兽疫病毒简论 |
| 2 病理学 |
| 3 流行病学 |
| 4 小反刍兽疫的诊断技术 |
| 5 小反刍兽疫的防控 |
| 第二章 病毒样颗粒概述 |
| 1 病毒样颗粒的分类 |
| 2 病毒样颗粒的表达系统 |
| 3 病毒样颗粒的免疫原性 |
| 4 小结 |
| 第二篇 研究内容 |
| 第一章 小反刍兽疫病毒M、F、H蛋白的原核表达及多克隆抗体的制备 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 2.1 PPRV M蛋白多克隆抗体制备 |
| 2.2 PPRV F蛋白多克隆抗体制备 |
| 2.3 PPRV H蛋白多克隆抗体制备 |
| 3 结果 |
| 3.1 PPRV M蛋白多克隆抗体的制备 |
| 3.2 PPRV F蛋白多克隆抗体的制备 |
| 3.3 PPRV H蛋白多克隆抗体的制备 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第二章 小反刍兽疫病毒Nigeria 75/1 株病毒样颗粒的构建及其免疫原性研究 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第三章 小反刍兽疫病毒tibet/geg/07-30株病毒样颗粒的构建及其免疫原性研究 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第四章 PPRV病毒样颗粒的高效表达研究 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 导师简介 |
| 作者简介 |
| 攻读学位期间发表学术论文 |
| 致谢 |
（6）重组牛IFN-λ3的制备及其与IFN-α/IFN-β/IFN-γ抗病毒活性比较研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 1.1 IFN-α、IFN-β和 IFN-γ概述 |
| 1.2 IFN-λs（III 型干扰素）研究进展 |
| 1.2.1 基因及蛋白结构 |
| 1.2.2 表达和调节 |
| 1.2.3 IFN-λs 的受体 |
| 1.2.4 信号转导 |
| 1.2.5 抗病毒 |
| 1.2.6 抗肿瘤活性 |
| 1.2.7 免疫调节活性 |
| 1.3 牛干扰素研究进展 |
| 1.4 利用毕赤酵母表达外源蛋白的研究 |
| 1.4.1 毕赤酵母及其他常用表达系统简介 |
| 1.4.2 毕赤酵母可溶性表达影响因素 |
| 1.4.3 利用毕赤酵母表达干扰素的研究 |
| 1.5 目的与意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 质粒、宿主菌 |
| 2.1.2 细胞、病毒、培养基、血清 |
| 2.1.3 酶、抗体、生化试剂和耗材 |
| 2.1.4 主要仪器和设备 |
| 2.1.5 试剂配制 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 牛 IFN-λ3（boIFN-λ3）在毕赤酵母中的分泌表达 |
| 2.2.2 重组牛 IFN-α/IFN-β/IFN-γ的表达 |
| 2.2.3 重组牛 IFN-λ3/IFN-α/IFN-β/IFN-γ生物学活性初步测定 |
| 2.2.4 重组牛 IFN-λ3 的理化特性分析 |
| 2.2.5 重组牛 IFN-λ3 和 IFN-α/IFN-β/IFN-γ的细胞毒性检测 |
| 2.2.6 重组牛 IFN-λ3 和 IFN-α/IFN-β/IFN-γ比较对 Mx1 蛋白和 ISRE 活性的影响 |
| 2.2.7 重组牛 IFN-λ3 和 IFN-α/IFN-β/IFN-γ抗病毒活性比较研究 |
| 2.2.8 ncpBVDV 持续性细胞感染对重组牛 IFN-λ3 抗病毒活性影响 |
| 2.2.9 统计学方法 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 牛 IFN-λ3 在毕赤酵母中的分泌表达 |
| 3.1.1 牛 IFN-λ3 的基因优化 |
| 3.1.2 牛 IFN-λ3 PCR 扩增 |
| 3.1.3 重组表达载体 pPICZαA-boIFN-λ3 的构建和鉴定 |
| 3.1.4 重组 boIFN-λ3 酵母菌株的筛选鉴定 |
| 3.1.5 高表达重组酵母菌株的筛选 |
| 3.1.6 诱导表达条件的优化 |
| 3.1.7 重组蛋白 boIFN-λ3 和 boIFN-λ3*的 Western blot 分析 |
| 3.1.8 重组蛋白 boIFN-λ3 和 boIFN-λ3*的纯化 |
| 3.1.9 重组蛋白 boIFN-λ3 和 boIFN-λ3*的糖基化分析 |
| 3.1.10 抗 boIFN-λ3 多克隆抗体的制备 |
| 3.3 重组牛 IFN-α/IFN-β/IFN-γ的表达 |
| 3.3.1 重组 boIFN-β的表达 |
| 3.3.2 重组 boIFN-α的表达 |
| 3.3.3 重组 boIFN-γ的表达 |
| 3.4 重组牛 IFN-λ3/IFN-α/IFN-β/IFN-γ生物学活性初步测定 |
| 3.5 重组牛 IFN-λ3 理化特性分析 |
| 3.6 重组牛 IFN-λ3 和 IFN-α/IFN-β/IFN-γ的细胞毒性检测 |
| 3.6.1 重组 boIFN-λ3 的细胞毒性检测 |
| 3.6.2 重组 boIFN-α/IFN-β/IFN-γ细胞毒性检测 |
| 3.7 牛 IFN-λ3 可刺激细胞产生 Mx1 蛋白并活化 ISRE |
| 3.7.1 牛 IFN-λ3 刺激多种牛源细胞产生 Mx1 蛋白 |
| 3.7.2 牛 IFN-λ3 和 boIFN-α/IFN-β/IFN-γ均能够诱导 ISRE 启动子活性 |
| 3.8 重组牛 IFN-λ3 和 boIFN-α/IFN-β/IFN-γ均具有抗 IBRV/FMDV 和 BVDV 活性 |
| 3.8.1 重组牛 IFN-λ3 和 IFN-α/IFN-β/IFN-γ均具有抗 IBRV 活性 |
| 3.8.2 重组牛 IFN-λ3 和 boIFN-α/IFN-β/IFN-γ均具有抗 FMDV 活性 |
| 3.8.3 重组 boIFN-λ3 条件性的抑制 cp 型和 ncp 型 BVDV 增殖 |
| 3.9 ncpBVDV 持续性细胞感染不影响重组牛 IFN-λ3 抗病毒活性 |
| 3.9.1 boIFN-λ3 压力筛选下 ncpBVDV 仍能建立持续性细胞感染状态 |
| 3.9.2 细胞感染 ncpBVDV 后不影响 boIFN-λ3 抗其他病毒活性 |
| 4 讨论 |
| 4.1 酵母分泌表达和纯化 |
| 4.2 重组牛 IFN-λ3 的理化特性和生物活性 |
| 4.3 牛 IFN-λ3 与 boIFN-α/IFN-β/IFN-γ抗病毒活性比较分析 |
| 4.4 牛 IFN-λ3 与 boIFN-α/IFN-β/IFN-γ协同抗病毒研究 |
| 4.5 ncpBVDV 持续性细胞感染与 IFN-λ3 抗病毒的关系 |
| 5 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间发表的学术论文 |
（7）吉林白鹅α/γIFN原核表达、抗病毒活性及其核酸疫苗免疫佐剂作用的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一篇 文献综述 |
| 第一章 干扰素的研究进展 |
| 1.1 干扰素分类及结构 |
| 1.2 干扰素作用机制 |
| 1.3 干扰素的生物学活性 |
| 1.4 禽类IFN的研究进展 |
| 第二章 鹅细小病毒研究进展 |
| 2.1 鹅细小病毒分子生物学研究进展 |
| 2.2 小鹅瘟免疫防治的研究进展 |
| 第二篇 研究内容 |
| 第一章 吉林白鹅α干扰素成熟肽基因的克隆表达及抗病毒活性的研究 |
| 1.1 材料与方法 |
| 1.2 结果 |
| 1.3 讨论 |
| 1.4 小结 |
| 第二章 吉林白鹅γ干扰素基因序列分析、原核表达及抗病毒活性测定 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 吉林白鹅IFN-γ及其与VP3融合基因的真核表达 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 第四章 JGIFN-VP3真核表达质粒对雏鹅的免疫研究 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.2 结果 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 中英文缩略语 |
| 作者简介 |
| 致谢 |
（8）蛋白质谷氨酰胺酶基因的合成、表达及性质研究（论文提纲范文）
| 论文摘要 |
| Abstract |
| 第一章 蛋白质谷氨酰胺酶的研究进展 |
| 1 研究背景 |
| 1.1 酪蛋白 |
| 1.2 小麦蛋白 |
| 1.3 大米蛋白 |
| 2 脱酰胺作用 |
| 2.1 化学脱酰胺 |
| 2.2 酶解脱酰胺 |
| 3 蛋白质谷氨酰胺酶的研究概况 |
| 3.1 蛋白质谷氨酰胺酶的发现 |
| 3.2 蛋白质谷氨酰胺酶的基因及氨基酸序列 |
| 3.3 蛋白质谷氨酰胺酶的空间结构 |
| 3.4 蛋白质谷氨酰胺酶的生物学活性 |
| 4 本课题的研究意义 |
| 第二章 蛋白质谷氨酰胺酶基因的人工合成 |
| 前言 |
| 1 材料 |
| 1.1 菌株和质粒 |
| 1.2 试剂与药品 |
| 1.3 主要仪器和设备 |
| 1.4 计算机分析软件 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 蛋白质谷氨酰胺酶基因序列的优化 |
| 2.2 蛋白质谷氨酰胺酶基因寡核苷酸片段的设计 |
| 2.3 重叠延伸PCR法合成PG基因 |
| 2.4 PG基因的克隆与测序 |
| 2.5 定点突变PCR |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 PG全长基因的人工合成 |
| 3.2 PG全长基因的鉴定 |
| 3.3 定点突变PCR的鉴定 |
| 4 讨论 |
| 第三章 蛋白质谷氨酰胺酶在大肠杆菌表达系统中的表达与活性检测 |
| 前言 |
| 1 材料 |
| 1.1 菌种和质粒 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要仪器和设备 |
| 1.4 培养基 |
| 1.5 计算机分析软件 |
| 1.6 常用试剂 |
| 2 方法与步骤 |
| 2.1 重组表达载体pET32a-matPG的构建 |
| 2.2 基因工程菌pET32a-matPG/BL21的构建 |
| 2.3 基因工程菌pET32a-matPG/BL21的诱导表达 |
| 2.4 重组蛋白的可溶性鉴定 |
| 2.5 诱导温度和分子伴侣对重组蛋白可溶性的影响 |
| 2.6 乳糖自诱导与IPTG诱导对菌体密度和重组蛋白表达率的比较 |
| 2.7 蛋白质谷氨酰胺酶的表达与纯化 |
| 2.8 蛋白质谷氨酰胺酶活性的测定 |
| 2.9 温度和pH值对蛋白质谷氨酰胺酶酶活的影响 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 蛋白质谷氨酰胺酶成熟肽序列的扩增 |
| 3.2 重组表达载体pET32a-matPG的鉴定 |
| 3.3 重组蛋白的诱导表达及western blotting分析 |
| 3.4 诱导温度和分子伴侣对重组蛋白可溶性的影响 |
| 3.5 乳糖自诱导与IPTG诱导对菌体密度和重组蛋白表达率的比较 |
| 3.6 重组蛋白的分离纯化 |
| 3.7 蛋白质谷氨酰胺酶活性的测定 |
| 3.8 温度和pH值对PG酶酶活的影响 |
| 4 讨论 |
| 第四章 蛋白质谷氨酰胺酶在枯草芽孢杆菌表达系统中的表达与活性检测 |
| 前言 |
| 第一节 大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭载体pHPW的构建及PG酶的表达与活性检测 |
| 1 材料 |
| 1.1 菌种和质粒 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要仪器和设备 |
| 1.4 培养基 |
| 1.5 计算机分析软件 |
| 2 方法与步骤 |
| 2.1 大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭载体pHPW的构建 |
| 2.2 大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭载体pHPW的功能检测 |
| 2.3 蛋白质谷氨酰胺酶的表达与活性检测 |
| 2.3.1 重组表达载体pHPW-PG的构建 |
| 2.3.2 基因工程菌pHPW-PG/DB403的构建 |
| 2.3.3 蛋白质谷氨酰胺酶的制备 |
| 2.3.4 蛋白质谷氨酰胺酶的活性检测 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 基因片段的扩增 |
| 3.2 大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭载体pHPW的鉴定 |
| 3.3 大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭载体pHPW的功能检测 |
| 3.4 蛋白质谷氨酰胺酶的表达与活性检测 |
| 3.4.1 重组表达载体pHPW-PG的鉴定 |
| 3.4.2 蛋白质谷氨酰胺酶的表达与检测 |
| 3.4.3 蛋白质谷氨酰胺酶的活性检测 |
| 第二节 低温诱导型大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭载体pCW的构建及PG酶的表达与活性检测 |
| 1 材料 |
| 1.1 菌种和质粒 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要仪器和设备 |
| 1.4 培养基 |
| 1.5 计算机分析软件 |
| 2 方法与步骤 |
| 2.1 DNA片段的设计与合成 |
| 2.2 低温诱导型大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭载体pCW的构建 |
| 2.3 蛋白质谷氨酰胺酶的表达与活性检测 |
| 2.3.1 重组表达载体pCW-PG的构建 |
| 2.3.2 基因工程菌pCW-PG/DB403的构建 |
| 2.3.3 蛋白质谷氨酰胺酶的制备 |
| 2.3.4 蛋白质谷氨酰胺酶的活性检测 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 质粒pHP13和DNA片段des-SamyQ鉴定 |
| 3.2 低温诱导型大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭载体pCW的鉴定 |
| 3.3 蛋白质谷氨酰胺酶在pCW中的表达与活性检测 |
| 3.3.1 重组表达载体pCW-PG的鉴定 |
| 3.3.2 蛋白质谷氨酰胺酶的表达与制备 |
| 3.3.3 蛋白质谷氨酰胺酶的活性检测 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
（9）重组猪IFNα的构建及原核可溶性表达研究（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 载体与菌株 |
| 1.1.2 工具酶及其他材料 |
| 1.1.3 抗体 |
| 1.2 PCR扩增IFN-α |
| 1.3 重组质粒pET32a-IFN-α的构建 |
| 1.4 工程菌的构建 |
| 1.5 rpoIFN-α的诱导表达 |
| 1.6 rpoIFN-α的纯化 |
| 1.7 Western-blot鉴定 |
| 2 结果 |
| 2.1 重组质粒pET32a-IFN-α的鉴定 |
| 2.1.1 PCR鉴定 |
| 2.1.2 双酶切鉴定 |
| 2.1.3 测序结果与分析 |
| 2.2 PoIFNα的表达 |
| 2.3 PoIFNα的纯化结果 |
| 3 讨论 |
（10）具抗病毒活性无冗余氨基酸牛α干扰素（A亚型）表达策略研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 引言 |
| 1.1 干扰素概述 |
| 1.1.1 干扰素的来源与发现 |
| 1.1.2 干扰素的分类与特点 |
| 1.1.3 干扰素的功能与应用 |
| 1.2 干扰素α概述 |
| 1.2.1 干扰素α的结构特点 |
| 1.2.2 干扰素α的生物学活性 |
| 1.2.3 干扰素α的抗病毒机理 |
| 1.3 牛α干扰素研究概况 |
| 1.4 重组蛋白的具活性表达 |
| 1.4.1 重组蛋白在大肠杆菌中的具活性表达 |
| 1.4.2 重组蛋白在巴斯德毕赤酵母中的表达 |
| 1.5 研究的目的与意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 质粒、宿主菌、病毒 |
| 2.1.2 细胞、培养基、血清 |
| 2.1.3 酶和生化试剂 |
| 2.1.4 主要仪器和设备 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 牛α干扰素A亚型在大肠杆菌周质分泌系统中的活性表达与鉴定 |
| 2.2.2 牛α干扰素A亚型在大肠杆菌内含肽融合标签系统中的活性表达与鉴定 |
| 2.2.3 牛α干扰素A亚型在巴斯德毕赤酵母分泌系统中的活性表达与鉴定 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 牛α干扰素A亚型在大肠杆菌周质分泌系统中的活性表达与鉴定 |
| 3.1.1 周质分泌型表达载体的构建 |
| 3.1.2 周质分泌型表达载体的蛋白表达与鉴定 |
| 3.1.3 VSV和BVDV在MDBK细胞上的TCID_(50) |
| 3.1.4 周质分泌表达系统蛋白抗病毒活性测定 |
| 3.1.5 牛α干扰素A亚型的多克隆抗体的效价检测 |
| 3.1.6 周质分泌表达系统蛋白的抗病毒活性阻断分析 |
| 3.2 牛α干扰素A亚型在大肠杆菌内含肽融合标签系统中的活性表达与鉴定 |
| 3.2.1 大肠杆菌内含肽麦芽糖结合蛋白表达载体的活性表达与鉴定 |
| 3.2.2 大肠杆菌内含肽冷激表达载体的活性表达与鉴定 |
| 3.3 牛α干扰素A亚型在巴斯德毕赤酵母分泌系统中的活性表达与鉴定 |
| 3.3.1 牛全基因组的提取 |
| 3.3.2 牛α干扰素A亚型基因的扩增 |
| 3.3.3 含有BoIFN-α基因的毕赤酵母表达载体的构建 |
| 3.3.4 重组毕赤酵母的PCR鉴定 |
| 3.3.5 重组酵母蛋白表达量的比较 |
| 3.3.6 重组酵母优势菌株的诱导表达 |
| 3.3.7 重组毕赤酵母的表达蛋白的Western blot鉴定 |
| 3.3.8 重组毕赤酵母的表达蛋白的抗病毒活性检测 |
| 3.3.9 重组毕赤酵母的表达蛋白的抗病毒活性阻断分析 |
| 4 讨论 |
| 4.1 牛α干扰素A亚型基因的克隆 |
| 4.2 无冗余氨基酸牛α干扰素A亚型的获得 |
| 4.3 内含肽融合与自我剪切机制 |
| 4.4 真核分泌表达载体的构建 |
| 4.5 表达蛋白的糖基化影响 |
| 4.6 牛α干扰素A亚型在三种表达策略中的比较 |
| 5 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士学位期间发表的学术论文 |
四、Primary Purification of Co-expressed Soluble and Insoluble Alpha-interferon 2b from Recombinant E. coli（论文参考文献）
- [1]多氯联苯全细胞生物传感器的研究以及几丁质酶在毕赤酵母GS115的高效表达[D]. 宋文. 湖北大学, 2021(02)
- [2]藏獒犬IFN-γ,IFN-α和IL-18基因克隆、表达及产物活性鉴定[D]. 宋世斌. 甘肃农业大学, 2020(01)
- [3]从江香猪源poIFN-α2/β/γ的原核与酵母表达及其抗PRRSV活性研究[D]. 徐丽. 贵州大学, 2019(09)
- [4]猪圆环病毒2型Cap标记蛋白的重组杆状病毒表达研究[D]. 徐国. 贵州大学, 2018(05)
- [5]PPRV病毒样颗粒的构建、制备及免疫原性研究[D]. 闫飞虎. 中国人民解放军军事医学科学院, 2016(02)
- [6]重组牛IFN-λ3的制备及其与IFN-α/IFN-β/IFN-γ抗病毒活性比较研究[D]. 张润祥. 东北农业大学, 2013(08)
- [7]吉林白鹅α/γIFN原核表达、抗病毒活性及其核酸疫苗免疫佐剂作用的研究[D]. 李公美. 吉林农业大学, 2013(11)
- [8]蛋白质谷氨酰胺酶基因的合成、表达及性质研究[D]. 汪正华. 华东师范大学, 2013(12)
- [9]重组猪IFNα的构建及原核可溶性表达研究[J]. 蔡家利,户国达,孙加燕,尹忠宝,张存亮,陈文毫. 重庆理工大学学报(自然科学), 2013(02)
- [10]具抗病毒活性无冗余氨基酸牛α干扰素（A亚型）表达策略研究[D]. 崔子寅. 东北农业大学, 2012(03)