一、苏云金芽孢杆菌Cry1C毒素对昆虫细胞的毒力研究（论文文献综述）
黄慧敏,曾远婷,王磊[1]（2021）在《苏云金芽孢杆菌及其伴孢晶体杀虫剂研究进展》文中研究表明如今,我国经济发展迅速,农林业发展愈发注重生态效益;生物农药由于其高效、广谱、环保及生物安全等优势,广泛受到研究人员的关注,且在农林业中得到广泛应用。目前,关于苏云金芽孢杆菌的研究已有100多年的历史,其芽孢形成过程中产生一种蛋白晶体被称为伴孢晶体,是常用的生物杀虫农药。本文对苏云金芽孢杆菌及其伴孢晶体在杀虫上的应用研究进展进行了综述。
张洪涛[2]（2020）在《二化螟Cry1Ab耐受品系及田间种群对Bt蛋白的敏感性研究》文中进行了进一步梳理二化螟Chilo suppressalis（Walker）是水稻上重要的蛀茎害虫之一,每年给我国水稻生产造成严重损失。随着生物技术的发展,转Bt抗虫水稻的研发为水稻害虫防治提供了有效途径,但同时也存在一些问题,其中靶标害虫对Bt作物的抗性演化是制约其可持续应用的重要因素之一,也是转基因抗虫作物商业化应用之前生态安全评价重点关注的内容之一。目前,靶标害虫二化螟对Bt水稻的抗虫风险还尚未明确,而抗性风险的明确是建立在靶标害虫对Bt作物/Bt蛋白敏感性明确的基础上。基于此,本研究系统开展了Cry1Ab敏感和耐受品系在Bt水稻上的存活及二化螟田间种群对Cry1Ab蛋白的敏感性监测,明确了二化螟田间种群对Cry1Ab蛋白的初始抗性基因频率,为Bt水稻的生态安全性评价和制定预防性的抗性治理策略提供重要科学数据和理论依据。具体结果如下:采用离体生测法,系统评价了二化螟Cry1Ab耐受及敏感品系初孵幼虫在不同生育期的Bt水稻（cry1Ab品系、cry1C品系、cry1Ab+cry1C品系）上取食7 d的存活情况。结果表明:（1）通过ELISA,分别测定了三种Bt水稻中Bt杀虫蛋白的表达量,发现Cry1Ab蛋白在cry1Ab和cry1Ab+cry1C抗虫水稻中的表达量随生育期的变化而显着下降,而Cry1C蛋白在cry1C和cry1Ab+cry1C水稻中的表达量呈现先降低后升高的趋势;（2）二化螟Cry1Ab敏感品系在不同生育期的cry1Ab、cry1Ab+cry1C和cry1C抗虫水稻上取食7 d的死亡率均为100%,且在分蘖期的三种Bt水稻上的完全致死时间分别为2 d、3 d和4 d;拔节期为2d、3d、和5d;孕穗期分别为2d、2d、4d;（3）二化螟Cry1Ab耐受品系在不同生育期的cry1C和cry1Ab+cry1C水稻上取食7 d,存活率均降为0,但在cry1Ab水稻上,其存活率显着增高,且在孕穗期cry1Ab水稻上的存活率为23.61%,显着高于分蘖和拔节期。由此说明,二化螟Cry1Ab耐受品系对cry1Ab水稻产生了一定的适应性,而对转cry1C、cry1Ab+cry1C水稻仍保持高度敏感,且二化螟Cry1Ab耐受品系与Cry1C蛋白可能不存在交互抗性;（4）蛋白表达量和幼虫死亡率的相关分析结果表明,Cry1Ab蛋白的表达量与二化螟幼虫的死亡率呈正相关关系,说明转cry1Ab水稻中Cry1Ab杀虫蛋白的表达量决定了其杀虫效果。采用F2代检测法,对广西兴安和福建福州的二化螟田间种群分别进行Cry1Ab杀虫蛋白的初始抗性基因频率监测。结果表明,对广西兴安的172个二化螟单雌家系进行了检测,发现该地区有3个单雌家系可能为耐受品系（#108,#127,#144）,估测该地区初始抗性等位基因频率约为0.0057;对福建福州185个单雌家系进行了检测,发现3个单雌家系可能为耐受家系（#4,#161,#179）,估测该地区初始抗性等位基因频率约为0.0053。与之前已报道的其他地区的二化螟初始抗性基因频率相比,没有显着升高,说明广西兴安、福建福州地区的二化螟田间种群的抗性初始基因频率仍保持在较低水平,对Cry1Ab蛋白仍保持高度敏感状态。
张斌武[3]（2019）在《苏云金芽胞杆菌Cry毒素蛋白抗蚜活性评价及其作用机理研究》文中研究指明苏云金芽胞杆菌（Bacillus thuringiensis,Bt）在其芽胞形成阶段产生的Cry毒素,是一类对多种农林害虫具有特异杀虫活性的毒素蛋白。cry基因已被广泛用于构建抗虫转基因作物,成为农业生产中防治鳞翅目、鞘翅目等Cry靶标昆虫的一种有效途径。随着这些转基因作物种植面积日益增大,对Cry不敏感的蚜虫占据了Cry靶标昆虫的原有生存空间,从次要害虫逐渐升格为主要害虫。目前控制蚜虫主要采用化学法,这与扩大转基因作物减少化学农药使用的目的背道而驰。因此,探究蚜虫对Cry毒素蛋白不敏感的原因,揭示Cry抗蚜机理具有重要的理论意义与应用前景。首先,本研究对不同Cry毒素的抗蚜活性进行评价。在大肠杆菌中表达了不同的Cry毒素:Cry1Ab1、Cry2Ab12、Cry7Ab4、Cry-related（一种Cry41同源蛋白,迄今抗蚜活性最高的Cry蛋白）和SCAN2-2（Cry46同源蛋白）,并构建了cry2Ab12转基因烟草、cry-related转基因烟草、cry-related+Tma12双价转基因烟草（Tma12编码一种蕨类植物来源的几丁质酶）。利用膜囊法和叶圆片法分别考察Cry毒素及转基因烟草对桃蚜（Myzus persicae）的毒性水平,结果表明,Cry1Ab1蛋白对桃蚜基本没有毒性,SCAN2-2对桃蚜显示出较高的毒性,cry2Ab12转基因烟草对桃蚜低毒,cry-related转基因烟草及cry-related+Tma12双价转基因烟草均显示出较高抗蚜活性。此外,降落在双价转基因植株上的有翅蚜,全部死亡且没有发现其后代为害。其次,本研究采用Pull-down及LC-MS/MS技术,从桃蚜全虫匀浆上清中分离鉴定了Cry1Ab1、Cry7Ab4、Cry2Ab12、Cry-related、Cry1F及Vip3Aa的结合蛋白。结果表明,所有Cry毒素都存在与细胞吞噬相关的结合蛋白,这可能意味着Cry蛋白能够通过胞吞作用进入蚜虫细胞;所有Cry毒素都没有出现钙粘蛋白（CAD）及碱性磷酸酶（ALP）之类的结合蛋白（CAD和ALP是鳞翅目昆虫识别Cry的常见受体）,这可能是Cry毒素对蚜虫低毒的原因;桃蚜Cathepsin-B及桃蚜共生菌来源的ATP-dependent-6-phosphofructokinase是Cry-related独有的结合蛋白,这可能是Cry-related抗蚜活性最高的原因。利用String数据库,对结合蛋白进行蛋白互作网络预测,结果显示部分Cry作用于蚜虫的分子过程涉及了MAPK、Hippo或Wnt通路。最后,本研究考察Cry-related与Cathepsin-B的体外互作,探讨Cathepsin-B在Cry-related抗蚜过程中的作用。在大肠杆菌中克隆表达了桃蚜Cathepsin-B蛋白,利用免疫印迹分析法证实Cry-related与Cathepsin-B二者体外可直接互作,这进一步表明Cry-related对蚜虫毒性最强可能是通过其与Cathepsin-B的互作来实现的。本研究还测定了Cathepsin-B的酶学性质,发现它是一个典型的半胱氨酸蛋白酶。半胱氨酸蛋白酶在细胞凋亡中起着重要作用,Cry-related属于能诱发细胞凋亡的抗癌晶体蛋白,所以,Cry-related与Cathepsin-B二者的互作,可能协同诱导细胞发生恶性凋亡。分子对接结果表明,Cry-related与Cathepsin-B的结合,封闭了Cathepsin-B的活性位点,这表明Cry-related还可能影响到蚜虫正常的蛋白降解,进而影响了蚜虫的生长发育。据此,本研究提出了Cry抗蚜机理假说:蚜虫的CAD、ALP与其他昆虫的存在显着差异,导致多数Cry毒素无法与其常见受体发生结合,因此对蚜虫不敏感,而Cry-related可以通过与Cathepsin-B的互作,诱发蚜虫细胞发生恶性凋亡或是影响蛋白降解利用进而发挥了抗蚜作用,Cry-related还可通过与共生菌来源的ATP-dependent-6-phosphofructokinase发生互作,影响蚜虫的生长发育,从而起到抗蚜作用。本研究结果,可为如何提高Cry抗蚜活性提供理论基础,对应用Cry有效防控蚜虫为害具有重要意义。
刘磊磊[4]（2019）在《受体介导的三种灰翅夜蛾属昆虫对Bt毒素敏感性差异分子机制的研究》文中研究表明苏云金芽孢杆菌Bacillus thuringiensis是全球应用较广的微生物农药,其产生的伴孢晶体毒素Cry毒素可以直接用于防控农业害虫;或者将Bt基因转入农作物中,可以有效减少化学杀虫剂的使用。由于Bt毒素对人体无害、对环境友好,使得Bt生物农药在农业害虫防控中广泛长期应用。斜纹夜蛾Spodoptera litura,甜菜夜蛾Spodoptera exigua和草地贪夜蛾Spodoptera frugiperda是世界各地对农业作物有严重危害的三种灰翅夜蛾属Spodoptera（Noctuidae）迁飞能力较强的杂食性昆虫。通过检测这三种昆虫对Bt毒素敏感性差异,从分子水平探究导致这种差异的原因,为有效防控和治理农业害虫提供一定的理论支持。1 三种灰翅夜蛾属昆虫对Bt毒素敏感性分析不同鳞翅目昆虫对Bt毒素敏感性不同,其原因是由于Bt毒素活化过程介导的敏感性差异或毒素与受体蛋白结合过程介导的敏感性差异。通过实验检测三种灰翅夜蛾属昆虫对Cry毒素的敏感性,用40 μg/g的Cry1Ac毒素处理斜纹夜蛾S.litura、甜菜夜蛾S.exigua和草地贪夜蛾S.frugiperda二龄幼虫七天后,结果发现,其存活率分别是96.43%、72.73%和0,三种昆虫对Cry1Ac毒素敏感性存在显着差异（p<0.05）。用40 μg/g的Cry1Ca毒素处理这三种昆虫二龄幼虫七天后,其存活率分别是48.21%,47.27%和3.63%,表明斜纹夜蛾和甜菜夜蛾对Cry1Ca毒素敏感性无差异,这两种昆虫对Cry1Ca毒素敏感性明显低于草地贪夜蛾（p<0.05）。综合分析体重变化和存活率,结果显示,斜纹夜蛾和甜菜夜蛾对Cry1Ca毒素敏感性明显强于Cry1Ac毒素（p<0.05）,草地贪夜蛾对Cry1Ac和Cry1Ca毒素都比较敏感。2 ABC转运蛋白和钙黏蛋白基因的克隆与生物信息学分析Bt毒素与毒素受体蛋白结合的不同是昆虫对Bt毒素产生敏感差异的主要原因,Bt毒素对鳞翅目昆虫产生毒性的过程中,ABCC2转运蛋白和钙黏蛋白是两类重要的毒素受体蛋白。我们从灰翅夜蛾属昆虫中肠或细胞系中分别克隆受体基因,构建pie2-SlABCC2-GFP、pie2-SeABCC2-GFP和pie2-SfABCC2-GFP三种表达质粒。分别将构建的质粒转染至Hi5细胞,结果发现,这三种昆虫ABCC2转运蛋白均主要定位在细胞膜上。斜纹夜蛾,甜菜夜蛾和草地贪夜蛾ABCC2基因分别编码1344、1343和1345个氨基酸残基,其分子量大小分别为150.15 kDa,149.74 kDa和150.25 kDa,且三种不同ABCC2蛋白序列高度保守,一致性达97.42%,均为12次跨膜蛋白。分别从斜纹夜蛾和甜菜夜蛾幼虫中肠克隆SlCAD和SeCAD基因,通过基因合成获得SfCAD基因,分别构建钙黏蛋白表达质粒,转染至Hi5细胞,结果发现SlCAD、SeCAD和SfCAD蛋白都主要定位在细胞膜上。斜纹夜蛾、甜菜夜蛾和草地贪夜蛾钙黏蛋白基因分别编码1757、1739和1734个氨基酸残基,分子大小分别是197.47 kDa、196.45 kDa和195.50 kDa,三种昆虫钙黏蛋白序列一致性为83.92%。3 ABCC2转运蛋白与Cadherin的协同作用为检测三种灰翅夜蛾属昆虫ABCC2转运蛋白和钙黏蛋白是否可以作为Cry毒素特异性受体,将构建的真核细胞表达质粒分别转染至Hi5细胞,测得Cry1Ac毒素对转染pie2-S1ABCC2-GFP、pie2-SeABCC2-GFP 和 pie2-SfABCC2-GFP 的 Hi5 细胞 EC50 分别是 4.198μg/mL、0.092 μg/mL 和 0.064 μg/mL;而 Cry1Ac 毒素对转染 pie2-SlCAD-GFP、pie2-SeCAD-GFP和pie2-SfCAD-GFP的Hi5细胞无毒性,因此从细胞水平上看,这三种昆虫单独表达钙黏蛋白的都不能作为Cry1Ac毒素受体。用Cry1Ca处理表达这六种蛋白的Hi5细胞,结果发现处理组与对照组病变率无明显差异,因此从细胞水平上看,三种灰翅夜蛾属昆虫单独表达的ABCC2转运蛋白或钙黏蛋白都不能作为Cry1Ca毒素受体。pie2-HaABCC2-GFP和pie2-HaCAD-GFP共转染至Hi5细胞,细胞对Cry1Ac毒素敏感性分别是单独转染pie2-HaABCC2-GFP和单独转染pie2-HaCAD-GFP的6.41倍和541.88倍,由此可见,棉铃虫ABCC2和CAD共同表达能增强Hi5细胞对Cry1Ac毒素的敏感性,即共转染pie2-HaABCC2-GFP和pie2-HaCAD-GFP有较强的协同作用;将斜纹夜蛾、甜菜夜蛾和草地贪夜蛾三种昆虫ABCC2和钙黏蛋白分别共同表达于Hi5细胞,结果显示,三种昆虫ABCC2和CAD共同表达并不能提高Hi5细胞对Cry1Ac和Cry1Ca毒素的敏感性。因此,三种灰翅夜蛾属昆虫ABCC2转运蛋白和钙黏蛋白在Hi5细胞中共同表达,对Cry1Ac和Cry1Ca毒素均没有协同作用。4三种灰翅夜蛾属昆虫对Cry1Ac敏感性差异分子机制苏云金芽孢杆菌通过与幼虫中肠刷状缘膜的蛋白受体结合,形成膜穿孔从而发挥其毒性。斜纹夜蛾和草地贪夜蛾都是灰翅夜蛾属昆虫,斜纹夜蛾对Cry1Ac毒素相对不敏感,而草地贪夜蛾对Cry1Ac毒素敏感,然而不同昆虫种群对Cry1Ac毒素的敏感性差异机制尚不明确。基于两种昆虫对Cry1Ac毒素敏感性差异,本文分析了 Cry1Ac毒素蛋白受体S1ABCC2和SfABCC2氨基酸序列,发现它们有很高的一致性。我们在Hi5细胞分别表达斜纹夜蛾SlABCC2蛋白和草地贪夜蛾SfABCC2蛋白,结果发现表达SfABCC2蛋白的细胞对Cry1Ac的敏感性是表达S1ABCC2蛋白的细胞对Cry1Ac敏感性的65.59倍。本文通过对斜纹夜蛾和草地贪夜蛾ABCC2片段替换、点突变和缺失,证实了草地贪夜蛾ABCC2转运蛋白上Q125氨基酸残基和斜纹夜蛾ABCC2转运蛋白上E125氨基酸残基是影响表达ABCC2受体的Hi5细胞对Cry1Ac敏感性差异的关键氨基酸。同样将棉铃虫上对应关键氨基酸Q122点突变,结果发现,表达HaABCC2Q122-GFP的细胞对Cry1Ac毒素的敏感性要比表达HaABCC2E122-GFP的细胞强。位于ABCC2蛋白loop1区域上的Q125或E125可能是Cry1Ac毒素的重要结合位点,这些结果表明,ABCC2上loopl区域单个氨基酸多态性是影响不同鳞翅目种群对Cry1Ac毒素敏感性差异的主要原因之一。
王婧[5]（2019）在《杀蚊卵菌贵阳腐霉几丁质酶基因及CRN效应子的功能研究》文中提出贵阳腐霉菌（Pythium guiyangense）是我国贵阳医学院苏晓庆教授发现的一株特异性侵染蚊虫的病原卵菌,具有灭蚊持效期长、杀蚊范围广、菌种易于制备和对非靶标生物安全等优点,可作为蚊虫生物防治的潜在菌种。前期的研究发现,贵阳腐霉可以通过体表和肠道两条途径进行侵染,并在侵染过程中分泌降解酶,如蛋白酶、几丁质酶和酯酶等来降解昆虫体壁。一些研究中认为,除了蛋白酶以外,几丁质酶在许多病原菌中也会参与侵染,是影响病原菌毒力的关键因子。在植物中,寄主植物受到病原菌侵染会诱导几丁质酶的产生,几丁质酶对真菌孢子的萌发具有抑制作用,进而增强植物的抗病性。植物种子萌发可导致几丁质酶释放到周围介质,并抑制真菌的生长繁殖。在昆虫中,几丁质酶会影响昆虫蜕皮,生长发育,昆虫病原卵菌中的几丁质酶能催化寄主表皮和围食膜的几丁质生成N-乙酰氨基葡糖胺,从而帮助病原菌成功侵染寄主。然而,几丁质酶的全基因组分布、进化和生物学功能在卵菌中却鲜有报道。本研究采用生物信息学和实验方法,系统地研究了蚊虫病原卵菌——贵阳腐霉的几丁质酶基因GH18。从贵阳腐霉基因组中共鉴定出3对GH18几丁质酶基因,它们分布在3个不同的系统发育簇中,与植物病原卵菌的基因组序列一致。进一步的转录分析显示,Pgchi1/2在发育阶段高表达,而Pgchi3/4和Pgchi5/6在感染阶段表达上调。利用遗传转化基因沉默技术对几丁质酶基因的生物学功能分析表明,Pgchi1/2沉默后,菌丝形态发生改变,游动孢子的产量减少,但不影响毒力。然而,Pgchi3/4和Pgchi5/6基因沉默后不仅调节氧化应激反应,而且导致蚊子幼虫感染率下降。综上所述,本研究对贵阳腐霉的几丁质酶家族进行了较为全面的阐述,揭示了贵阳腐霉几丁质酶家族在蚊虫病原菌的发育、应激反应、毒力等方面的多种作用,为蚊虫病原菌几丁质酶分子机制的研究提供了有价值的信息。病原菌在侵染寄主的过程中,为了能躲避寄主的免疫反应,成功侵入并定殖,病原菌会分泌效应子（effector）干扰植物的免疫反应。近年来对于卵菌胞内效应子的研究取得了重大突破,主要包括RxLR效应子和CRN效应子（Crinkling and Necrosis）两大类。其中CRN效应子是为数不多的高度保守的蛋白,在腐霉、霜霉、白锈等卵菌中广为存在。它首次在致病疫霉（Phytophthora infestans）中被发现,因会引起细胞皱缩和坏死而命名。对CRN效应子的研究主要集中在植物病原卵菌中,在蚊虫病原卵菌中研究的还较少。前期生物信息学分析发现,贵阳腐霉中鉴定到28个CRN效应子。利于已建立了Sf9细胞系毒性评价体系,筛选到了 5个毒性效应子（PgCRN31,PgCRN33,PgCRN37,PgCRN40和PgCRN44）。本研究中首先建立了 C6/36细胞系毒性评价体系,对筛选出的5个效应子进行毒性验证,结果表明PgCRN31和PgCRN33对C6/36细胞也有显着毒性。为了深入研究CRN效应子的作用机制,综合分析后,选择对两种细胞均有显着毒性的PgCRN31作为下一步研究对象。在C6/36细胞中表达GFP-PgCRN31,通过免疫沉淀、非胶条鉴定和生物信息学分析,筛选到了8个候选基因。
远万里[6]（2018）在《Bt毒素诱导的细胞自噬及其机制的研究》文中认为苏云金芽胞杆菌（Bαcillus thuringiensis）产生的Bt毒素蛋白,可以杀死多种农业害虫。活化的苏云金杆菌晶体毒素不仅作用于靶昆虫的中肠细胞,还作用于某些培养的昆虫细胞系。活化的晶体毒素通过寡聚化在刷状缘膜上形成孔隙来杀死中肠细胞,但是还不清楚低浓度毒素对细胞的其它影响。探究Bt毒素毒杀昆虫细胞所发生的一系列生理生化反应,有助于提高Bt毒素对害虫的防治能力,丰富细菌毒理学的理论。研究表明,自噬在天然免疫防御系统中起着关键作用（抵抗细胞内病原体的自噬也被称为异种自噬）。细胞自噬的研究近来已经涉及到针对各种成孔毒素（pore forming toxin,PFT）的反应,但是如何引发这个过程尚不明确,这种现象的生理学意义也尚不清楚。本论文致力于研究低浓度的活化Cry1 Ac和Cry1Ca毒素对培养的昆虫和哺乳动物的细胞自噬的影响,探究自噬在昆虫细胞对Bt毒素抗性中的作用。所有试验的昆虫细胞（Hi5,Sl-HP和Sf9）都对活化的Cry1Ca毒素敏感,但只有Sl-HP细胞对活化的Cry1Ac毒素敏感。活化的Cry1Ac和Cry1Ca毒素对哺乳动物细胞293T均无毒害性。本研究发现Cry1Ca毒素增强Hi5,S1-HP和Sf9细胞的自噬水平,而Cry1Ac毒素只促进S1-HP细胞的自噬（P<0.05）。在Hi5细胞中过表达Cry1Ac的受体HaCadherin和HaABCC2后,活化的Cry1 Ac也提高了 Hi5细胞的自噬水平。但是活化的Cry1Ac和Cry1Ca毒素不影响293T细胞的自噬水平。这表明毒素对自噬的诱导需要毒素受体的介导,与细胞对毒素的敏感性呈正相关。本实验通过使用四种自噬抑制剂（Baf、CQ、ConA、3-MA）处理Hi5细胞后,Western blot分析发现Baf、CQ、ConA三种自噬抑制剂处理能够抑制Cry1Ca毒素促使的Atg8向Atg8-PE的转换,并且能够使细胞对该毒素的敏感性下降。通过干扰Hi5细胞自噬相关基因Atg5或Atg13后,发现Hi5细胞对Cry1Ca毒素的敏感性下降。因此,自噬在介导Cry1Ca毒素对Hi5细胞的毒力方面起着重要作用。本研究使用Jnk、P38、PI3K抑制剂处理三种昆虫细胞（Hi5、S1-HP和Sf9）,能够抑制Cry1Ca毒素增强细胞的自噬水平,但结果表明Jnk抑制剂处理后三种昆虫细胞对Cry1Ca、Cry1Ac毒素的敏感性下降最为明显。然后,在S1-HP细胞中沉默SlJnk基因后细胞对毒素的敏感性下降,这与使用Jnk抑制剂的效果相同。这表明Cry1Ac和Cry1Ca毒素诱导的昆虫细胞自噬水平增强能够被经典的自噬抑制剂阻断,依赖于Atg5和Atg13,Jnk信号途径在这个过程中起着重要作用,自噬在一定程度上影响细胞对毒素的敏感性。该昆虫细胞自噬诱导和阻断体系的建立对深入探究昆虫细胞的自噬分子机制具有十分重要的意义,将促进昆虫发育生物学和害虫防治的相关研究。
公玲玲[7]（2017）在《棉铃虫ABC转运蛋白ABCG1的基因克隆和功能分析》文中指出长期种植转苏云金芽孢杆菌Bacillus thuringiensis（Bt）基因作物使一些靶标害虫产生了Bt抗性,有人研究发现ABCG亚家族基因中的white（ABCG1）基因表达下调能够使小菜蛾Plutella xylostella产生Cry1Ac抗性,我们推测棉铃虫Helicoverpa armigera的ABCG1基因（HaABCG1）表达下调可能与棉铃虫对Cry1Ac毒素的抗性有关,即棉铃虫HaABCG1蛋白可能介导棉铃虫Cry1Ac抗性。首先,我们克隆并分析棉铃虫HaABCG1的开放阅读框（open reading frame,ORF）;然后从棉铃虫体内和体外两方面分别研究ABCG1基因与Cry1Ac毒素的关系,通过构建含HaABCG1基因的表达载体检测HaABCG1蛋白在TnH5细胞中的亚细胞定位;通过细胞毒力实验验证棉铃虫HaABCG1蛋白与Cry1Ac毒素的关系;利用RNAi技术验证棉铃虫HaABCG1表达下调是否会降低棉铃虫对Cry1Ac毒素的敏感性。结果发现:1棉铃虫HaABCG1基因的克隆表达及蛋白序列分析棉铃虫HaABCG1基因的ORF由1 896个核苷酸组成,编码蛋白含631个氨基酸残基,分子质量约69.63 kDa,等电点是8.76。棉铃虫HaABCG1蛋白没有信号肽和O-糖基化位点,有4个N-糖基化位点,一个细胞质基质核酸结合域（nucleotide binding domain,NBD）,一个含有6个α-螺旋的跨膜区（transmembrane domain,TMD）和ABC转运家族的特征性标记结构,这些均与ABCG亚家族的特征相符合。2棉铃虫HaABCG1基因的进化树分析对来自不同物种的37条蛋白序列构建进化树,分析表明,ABCG家族蛋白序列和ABCA1蛋白序列能够明显区别开来;昆虫ABCG1与非昆虫ABCG1具有很高的相似性,与昆虫ABCG4蛋白序列的相似性高于ABCG5蛋白序列和ABCG8蛋白序列。3 HaABCG1-GFP融合蛋白的亚细胞定位以及HaABCG1介导Bt毒素穿孔的细胞毒力功能验证构建带有GFP标签的棉铃虫真核表达质粒pEGFP-N1/HaABCG1,HaABCG1-GFP融合蛋白在TnH5细胞内表达,借助荧光显微镜观察其在细胞中的定位,HaABCG1主要分布在TnH5细胞的核膜和内质网膜上。HaABCG1-GFP融合蛋白在TnH5昆虫细胞表达24 h后,当处理细胞的Cry1Ac,Cry2Aa,Cry1Ca和Cry1Fa这4种毒素处理1 h后,TnH5细胞同阴性对照一样几乎没有发生病变,而表达HaABCC2-GFP和HaCad-GFP的阳性对照细胞膨胀破裂,即HaABCG1不是Cry1Ac,Cry2Aa,Cry1Ca和Cry1Fa 4种毒素的受体。4基于RNAi和生物测定的棉铃虫HaABCG1基因功能验证干扰72 h后,一部分棉铃虫幼虫用于提取RNA,反转录并进行实时荧光定量;另一部分幼虫用于生物测定实验,在含0.05μg/mL Cry1Ac的饲料上饲养3 d。对照组和实验组者的死亡率没有显着性差异;在干扰效率高于40%时,对照组和处理组幼虫的体重都有所下降,对照组注射无RNase水的幼虫体重的减少量大于注射siABCG1的;通过方差分析结果看出,对照组和处理组幼虫的体重变化没有显着性差异。通过体内和体外两个方面的实验我们总结出,棉铃虫HaABCG1基因的表达下调与棉铃虫对Cry1Ac的抗性不相关,棉铃虫的HaABCG1不是Cry1Ac毒素的受体。这是首次报道ABCG1基因不参与棉铃虫的Cry1Ac抗性。
陆秀青[8]（2016）在《苏云金芽胞杆菌Cry1类原毒素C端区域的功能研究》文中提出苏云金芽胞杆菌（Bacillusthuringiensis,简称Bt）是当前世界上应用最为广泛的微生物杀虫剂,其杀虫活性主要来源于伴胞晶体。有研究表明,苏云金芽胞杆菌Cry1类原毒素C端区域对于Bt杀虫晶体的形成具有重要作用,研究原毒素C端区域的功能,对提高杀虫晶体蛋白的产量,增强Bt杀虫晶体蛋白的溶解性及杀虫毒力具有重要意义。有研究表明,在昆虫中肠道的碱性环境中,Cry1Ac菱形晶体的溶解能力明显高于Cry2Aa方形晶体。为了增强Cry2Aa原毒素的溶解能力,本研究利用Cry2Aa原毒素的N-端与Cry1Ac的C-端区域构建了融合蛋白,分析融合蛋白的表达情况及杀虫毒力。从Bt4.0718高毒力菌株中分别扩增cry1Ac和cry2Aa基因,利用Red/ET同源重组技术构建cry2Aa与cry1Ac的C-端区域编码序列形成的融合基因,将含该融合基因的表达载体转化至Bt无晶体突变株XBU001中。对重组菌株进行相差显微镜和扫描电镜观察,并对表达产物进行SDS-PAGE分析和质谱鉴定。进一步对融合蛋白的碱溶性、胰酶激活特性及对棉铃虫（Helicoverpa armigera）的毒力进行分析测定。结果表明,重组菌株能产生不定形的伴胞晶体并表达130 kDa的融合蛋白。在pH 10.5的环境下,融合晶体蛋白和Cry1Ac晶体蛋白均可溶解出80%的原毒素,而Cry2Aa晶体蛋白只能溶解出10%的原毒素,且融合蛋白能够被胰蛋白酶正常激活。此外,当Cry1Ac/Cry2Aa晶体蛋白按不同的比例组合时,对棉铃虫的毒力显示出增强效果,而Cry1Ac/Cry2Aa-1Ac则具有明显的协同活性。由此我们得出结论,Cry1Ac原毒素的C-端区域能够增强Cry2Aa晶体的溶解性及其在昆虫中肠道的毒力。130～140 kDa的Cry1类原毒素非毒性C-端区域中富含半胱氨酸（Cys）残基,研究者普遍认为这些Cys残基对原毒素组装形成晶体具有重要作用。本研究前期基础已成功构建有HD73菌株的cry1Ac基因C-端区域14个Cys单点突变以及逐一叠加突变的Bt菌株。为了更深入研究非毒性区域Cys残基的功能,对所有突变菌株进行扫描电镜观察,发现所有突变菌株依然能形成典型的菱形晶体。对野生Cry1Ac蛋白及C-端Cys残基全部突变的Cry1Ac蛋白溶解性和胰酶稳定性分析发现,C-端全部突变的Cry1Ac蛋白在pH 7.5时就可少量的溶解,而野生的Cry1Ac蛋白要在pH 9.5时才能溶解,说明突变后提高了 Cry1Ac蛋白在偏中性pH值中的溶解度,同时还发现突变型晶体蛋白对胰蛋白酶更加敏感,容易在短时间内降解成毒性片段。研究野生Cry1Ac和C-端全部突变的Cry1Ac晶体蛋白对枞色卷蛾中肠细胞系CF203/2.5活性和细胞增殖影响,将两种晶体蛋白毒素以不同浓度梯度作用CF203/2.5细胞48h后,通过倒置显微镜观察发现,与对照相比,两种毒素对细胞都具有毒性,可以发现细胞聚集成团,细胞生长受到抑制、数量变少,形成很多细胞碎片。同时,利用MTT实验来检测蛋白对CF203/2.5细胞增殖的影响。结果显示,随着两种蛋白浓度的提高,细胞毒性也逐渐增强,呈现浓度依赖性,野生Cry1Ac和C-端全部突变的Cry1Ac蛋白浓度为54 μg/mL时,死亡率分别是69%、82%,说明突变后毒性有明显的提高。综上,我们得出这样的一个结论:Cry1Ac的C-端对晶体形成具有重要作用,但是不一定依赖于Cys残基,这与以前的报道不同。本论文的研究有助于阐明Cry1类原毒素C端非毒性区域的功能,对构建苏云金芽胞杆菌高效杀虫工程菌提供理论依据。
宋萍[9]（2012）在《苏云金芽胞杆菌分离鉴定及对马铃薯二十八星瓢虫特异活性菌株研究》文中进行了进一步梳理苏云金芽胞杆菌（Bt）是世界上研究最多应用范围最广的杀虫微生物,杀虫活性物质包括Cry和Cyt两大类蛋白,在害虫生物防治中发挥了重要作用,但是也暴露了一些弊端,如杀虫谱窄、昆虫易产生抗性等问题,所以进一步分离特异活性或者高活性的野生菌株,鉴定其基因型,为害虫防治提供更多的基因资源。本论文针对含有cry7类基因的苏云金芽胞杆菌野生菌株进行了鉴定和评价,从中筛选出了对马铃薯二十八星瓢虫特异活性的新菌株,针对这一新菌株生物学特性、蛋白型、基因型以及作用机理等方面进行了一系列的研究,主要内容和结果如下。1.利用醋酸钠筛选法并经基因型分析,从河北省土壤中分离筛选出了56株含有cry7基因的Bt菌株。在这些菌株中,10株菌同时含有cry7基因和其他cry基因,46株菌只含有单一cry7基因。大部分Bt菌株表达130kDa蛋白,仅有BQZ-12菌株产生80kDa和70kDa蛋白,BQZ-8菌株产生130kDa和80kDa蛋白。通过生物活性测定得到一株对马铃薯二十八星瓢虫幼虫具有特异杀虫活性野生菌Bt WZ-9。2. WZ-9菌株在胞晶分离期产生菱形伴胞晶体,蛋白分子量为130kDa,对马铃薯二十八星瓢虫2龄幼虫的LC50值为0.209 mg/mL。基因型鉴定结果表明该菌只含有单一的cry7基因,序列分析显示该基因与cry7Ab1同源性达到99%,被Bt命名委员会命名为cry7Ab3（登录号ABX 24522）。3.为了明确Cry7Ab3蛋白的杀虫活性,从Bt WZ-9菌株中克隆了cry7Ab3基因,该基因在大肠杆菌BL21和Bt无晶体突变株HD73 cry-中都能正确表达130kDa蛋白,其表达产物对马铃薯二十八星瓢虫2龄幼虫都具有较高毒力,LC50值分别为0.460 mg/mL和0.205 mg/mL,cry7Ab3基因在转Bt无晶体突变株HD73-Cry7Ab3中形成的晶体（0.86μm×1.23μm）比野生菌产生的晶体（0.73μm×1.00μm）略大一些。这些结果证实了cry7Ab3基因编码蛋白发挥杀虫作用。4.为明确Cry7Ab3蛋白最短活性区序列,利用特异性引物分别克隆表达不同长度的cry7Ab3基因片段,E. coli Cry7Ab3-1（Met1-Phe657）、E. coli Cry7Ab3-2（ Met1-Phe626 ）、E. coli Cry7Ab3-3 （ Asn30-Phe657 ）和E. coli Cry7Ab3-4（Lys87-Phe657）,并测定了表达产物对马铃薯二十八星瓢虫2龄幼虫的毒力。结果表明E. coli Cry7Ab3-1表达的75kDa蛋白毒力最高,LC50值为0.114mg/mL,可以确定Met1-Phe657为Cry7Ab3蛋白的最短活性区。5.分别利用胰蛋白酶和马铃薯二十八星瓢虫中肠蛋白酶液体外酶解130kDa的Cry7Ab3原毒素（质量比为100:1）,均得到75kDa的酶解产物。与相同浓度的原毒素相比,75kDa的酶解产物对马铃薯二十八星瓢虫2龄幼虫具有较高杀虫毒力。对马铃薯二十八星瓢虫幼虫中肠组织病理学研究表明,3龄幼虫取食Cry7Ab3原毒素蛋白3d后,中肠细胞严重破坏,细胞间出现明显孔洞,幼虫表现出活动缓慢,取食量下降的现象。取食5d后,中肠组织完全被破坏,幼虫开始死亡。通过Ligand blotting技术,检测到马铃薯二十八星瓢虫中肠BBMV上存在分子量为220kDa的Cry7Ab3毒素结合受体,经质谱分析鉴定该受体蛋白为钙粘蛋白。本论文创新之处在于发现了对马铃薯二十八星瓢虫幼虫特异活性的Cry7Ab3蛋白,构建了转cry7Ab3基因的Bt工程菌,明确了Cry7Ab3蛋白最短活性区为75kDa的Met1-Phe657蛋白片段以及Cry7Ab3毒素的作用靶标是马铃薯二十八星瓢虫幼虫中肠组织上的BBMV,初步确定了其在中肠BBMV上结合蛋白可能是钙粘蛋白。这些研究结果为更好地应用Cry7Ab3蛋白防治马铃薯二十八星瓢虫提供了理论基础。
李雪,马玉超,李煦,于慧敏,张建[10]（2012）在《苏云金芽孢杆菌伴孢晶体的研究进展》文中研究指明伴胞晶体是苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis,简称Bt）在芽孢形成过程中产生的一种蛋白晶体。作为生物杀虫农药之一,伴胞晶体/Bt由于具有高效、广谱、环保及生物安全等优势,在农林业中得到广泛应用。介绍了伴胞晶体的最新分类、命名情况,综述了其结构、杀虫机理及应用方面的研究进展,并对Bt生物农药的发展前景进行了展望。
二、苏云金芽孢杆菌Cry1C毒素对昆虫细胞的毒力研究（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、苏云金芽孢杆菌Cry1C毒素对昆虫细胞的毒力研究（论文提纲范文）
（1）苏云金芽孢杆菌及其伴孢晶体杀虫剂研究进展（论文提纲范文）
| 1 苏云金芽孢杆菌发现与命名 |
| 2 苏云金杆菌分类发展史 |
| 2.1 苏云金杆菌的分类 |
| 2.2 苏云金芽孢杆菌伴孢晶体编码基因的命名 |
| 3 苏云金芽孢杆菌的杀虫功能 |
| 4 苏云金芽孢杆菌伴孢晶体蛋白的应用和杀虫相关产品 |
| 5 苏云金芽孢杆菌相关杀虫剂的发展前景 |
（2）二化螟Cry1Ab耐受品系及田间种群对Bt蛋白的敏感性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 主要符号对照表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 转基因作物的研究进展 |
| 1.2.1 转基因作物的应用现状 |
| 1.2.2 我国转Bt水稻的研究进展 |
| 1.2.3 转Bt水稻靶标害虫生物学特性研究 |
| 1.2.4 转基因作物潜在的生态安全性 |
| 1.3 Bt蛋白的研究进展 |
| 1.3.1 Bt蛋白的基本概况 |
| 1.3.2 Bt蛋白的结构 |
| 1.3.3 Bt蛋白的作用机理 |
| 1.3.4 昆虫对Bt蛋白的抗性演化 |
| 1.4 害虫对转Bt抗虫作物的抗性监测 |
| 1.5 抗性治理策略 |
| 1.5.1 高剂量/庇护所策略 |
| 1.5.2 基因叠加策略 |
| 1.6 本研究目的与意义 |
| 第二章 二化螟Cry1Ab耐受品系在Bt水稻上的敏感性研究 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 供试材料 |
| 2.1.2 主要试剂耗材及仪器设备 |
| 2.1.3 转Bt水稻不同生育期Bt蛋白表达量测定 |
| 2.1.4 转Bt水稻不同生育期离体叶片生测 |
| 2.1.5 数据处理与分析 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 不同生育期的转Bt水稻叶片蛋白表达量 |
| 2.2.2 二化螟Cry1Ab耐受和敏感品系在Bt水稻上的存活情况 |
| 2.2.3 Bt水稻中Cry1Ab杀虫蛋白表达量与二化螟死亡率的相关性 |
| 2.3 讨论 |
| 第三章 二化螟田间种群对Cry1Ab蛋白的初始抗性基因频率检测 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 供试材料 |
| 3.1.2 主要试剂耗材及仪器设备 |
| 3.2 实验方案 |
| 3.2.1 生物测定确定区分剂量 |
| 3.2.2 单雌系建立及继代饲养 |
| 3.2.3 F_2代筛选 |
| 3.2.4 数据处理与分析 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 区分剂量的确定 |
| 3.3.2 F_2代检测 |
| 3.3.3 抗性基因频率估算 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 全文结论 |
| 4.1 全文结论 |
| 4.2 不足与展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（3）苏云金芽胞杆菌Cry毒素蛋白抗蚜活性评价及其作用机理研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第1章 引言 |
| 1.1 蚜虫概述 |
| 1.1.1 桃蚜的特征 |
| 1.1.2 蚜虫共生菌 |
| 1.1.3 蚜虫的危害 |
| 1.2 苏云金芽孢杆菌 |
| 1.2.1 苏云金芽孢杆菌的研究概况 |
| 1.2.2 Bt杀虫晶体蛋白的分类 |
| 1.2.3 Cry毒素蛋白的结构 |
| 1.2.4 3D-Cry毒素的结构及穿孔模型 |
| 1.2.5 Cry蛋白在细胞内的作用机理 |
| 1.2.6 Cry毒素的结合蛋白 |
| 1.3 蚜虫防治研究进展 |
| 1.3.1 化学防控 |
| 1.3.2 生物防控 |
| 1.3.3 Bt防控蚜虫 |
| 1.3.4 抗蚜Bt蛋白的改造 |
| 1.4 课题研究的目的及意义 |
| 1.4.1 课题的研究目的 |
| 1.4.2 课题的研究意义 |
| 第2章 Cry蛋白抗蚜活性的评价 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 供试昆虫 |
| 2.1.2 转基因烟草 |
| 2.1.3 实验质粒 |
| 2.1.4 主要试剂及仪器 |
| 2.1.5 实验所需培养基 |
| 2.1.6 主要溶液配制 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 载体的构建 |
| 2.2.2 Cry1Ab1活性区的表达及纯化 |
| 2.2.3 Cry2Ab12活性区的表达及纯化 |
| 2.2.4 Cry7Ab4活性区的表达及纯化 |
| 2.2.5 Cry-related的表达及纯化 |
| 2.2.6 SCAN2-2的表达及纯化 |
| 2.2.7 转基因烟草目的基因的鉴定 |
| 2.2.8 不同的Cry蛋白对蚜虫毒力的测定(膜囊法) |
| 2.2.9 不同毒力Cry蛋白对蚜虫毒力的测定(叶圆片法) |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 不同Cry蛋白的表达及纯化 |
| 2.3.2 转基因烟草目的基因的鉴定 |
| 2.3.3 不同毒力的Cry蛋白抗蚜活性的评价 |
| 2.3.4 小结与讨论 |
| 第3章 Cry结合蛋白的分离、鉴定及其互作蛋白网络分析 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 供试昆虫 |
| 3.1.2 主要试剂及溶液配制 |
| 3.1.3 主要仪器和器材 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 蚜虫匀浆的提取 |
| 3.2.2 蚜虫匀浆Cry毒素结合蛋白的Pull-down essay |
| 3.2.3 SDS-PAGE电泳分析Pull-down essay |
| 3.2.4 SDS-PAGE凝胶的银染 |
| 3.2.5 蛋白条带的LS-MS/MS鉴定 |
| 3.2.6 Cry毒素与其结合蛋白的生物信息学分析 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 Cry1Ab1在桃蚜体内结合蛋白的分离与鉴定 |
| 3.3.2 Cry2Ab12在桃蚜体内的结合蛋白的分离与鉴定 |
| 3.3.3 Cry7Ab4在桃蚜体内的结合蛋白的分离与鉴定 |
| 3.3.4 Cry-related在桃蚜体内的结合蛋白的分离与鉴定 |
| 3.3.5 Cry1F在桃蚜体内的结合蛋白的分离与鉴定 |
| 3.3.6 Vip3Aa在桃蚜体内的结合蛋白的分离与鉴定 |
| 3.3.7 Cry结合蛋白的相关作用途径网络分析 |
| 3.3.8 小结与讨论 |
| 第4章 Cry-related与其结合蛋白Cathepsin-B的互作研究 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 实验质粒 |
| 4.1.2 主要试剂及仪器 |
| 4.1.3 主要溶液配制 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 Cathepsin-B的生物信息学分析 |
| 4.2.2 Cathepsin-B蛋白的表达与纯化 |
| 4.2.3 Cathepsin-B的酶学性质研究 |
| 4.2.4 Cathepsin-B与 Cry-related的互作验证 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 Cathepsin-B蛋白的表达与纯化 |
| 4.3.2 Cathepsin-B的酶学性质研究 |
| 4.3.3 Cathepsin-B与Cry-related的互作验证 |
| 4.3.5 Cathepsin-B与Cry-related的互作分析 |
| 4.3.6 小结与讨论 |
| 第5章 结论与展望 |
| 5.1 结论 |
| 5.2 展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录 |
（4）受体介导的三种灰翅夜蛾属昆虫对Bt毒素敏感性差异分子机制的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 苏云金芽孢杆菌 |
| 1.1.1 苏云金芽孢杆菌的发现 |
| 1.1.2 Bt毒素的命名和分类 |
| 1.1.3 Bt杀虫晶体蛋白的结构与功能 |
| 1.1.4 晶体蛋白毒素的作用机理 |
| 1.2 Bt晶体蛋白毒素受体研究概况 |
| 1.2.1 ABC转运蛋白(ABC Transporter) |
| 1.2.2 钙黏蛋白(Cadhrin) |
| 1.2.3 氨肽酶N(Aminopeptidase N) |
| 1.2.4 碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase) |
| 1.3 毒素受体的协同作用 |
| 1.4 鳞翅目昆虫对Bt毒素敏感性差异 |
| 1.4.1 Bt毒素的活化介导的敏感性差异 |
| 1.4.2 Bt毒素与受体蛋白的结合不同导致的昆虫对毒素的敏感性差异 |
| 1.5 研究目的与意义 |
| 第二章 三种灰翅夜蛾属昆虫对Bt毒素敏感性分析 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.1.1 原毒素与饲料成分 |
| 2.1.2 供试昆虫及来源 |
| 2.1.3 主要器具及常用仪器 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 饲料配制流程 |
| 2.3.2 敏感性测定方法 |
| 2.3.3 数据统计分析 |
| 2.4 结果与分析 |
| 2.4.1 斜纹夜蛾Spodoptera litura对Cry毒素敏感性分析 |
| 2.4.2 甜菜夜蛾Spodoptera exigua对Cry毒素敏感性分析 |
| 2.4.3 草地贪夜蛾Spodoptera frugiperda对Cry毒素敏感性检测 |
| 2.4.4 Cry毒素对三种灰翅夜蛾属Spodoptera (Noctuidae)昆虫毒力比较 |
| 2.5 讨论与小结 |
| 第三章 ABC转运蛋白和钙黏蛋白基因的克隆与生物信息学分析 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 实验材料 |
| 3.2.1 昆虫细胞系和培养基 |
| 3.2.2 质粒和菌株 |
| 3.2.3 DNA克隆常用试剂 |
| 3.2.4 常用溶液的配制 |
| 3.2.5 细胞培养基及配制 |
| 3.2.6 主要引物及序列 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 昆虫组织或细胞系总RNA的提取 |
| 3.3.2 cDNA的合成 |
| 3.3.3 PCR产物的回收和纯化 |
| 3.3.4 连接产物的转化 |
| 3.3.5 质粒的抽提 |
| 3.3.6 同源重组法无缝克隆 |
| 3.4 结果与分析 |
| 3.4.1 斜纹夜蛾Spodoptera litura ABCC2和钙黏蛋白表达质粒的构建 |
| 3.4.2 甜菜夜蛾Spodoptera exigua ABCC2和钙黏蛋白表达质粒的构建 |
| 3.4.3 草地贪夜蛾Spodoptera frugiperda ABCC2和钙黏蛋白表达质粒的构建 |
| 3.4.4 三种灰翅夜蛾属昆虫ABCC2和钙黏蛋白的亚细胞定位 |
| 3.4.5 ABCC2和CAD蛋白氨基酸序列分析 |
| 3.4.6 ABCC2转运蛋白和Cadherin进化树的构建 |
| 3.4.7 ABCC2转运蛋白和Cadherin三维结构的预测分析 |
| 3.4.8 ABCC2转运蛋白跨膜区预测 |
| 3.4.9 CAD信号肽和重复区预测 |
| 3.5 讨论与小结 |
| 第四章 ABCC2转运蛋白与cadherin的协同作用分析 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 实验材料 |
| 4.2.1 昆虫细胞系和培养基 |
| 4.2.2 活化的Cry毒素 |
| 4.2.3 质粒与菌株 |
| 4.2.4 主要试剂 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 细胞转染 |
| 4.3.2 显微镜观察 |
| 4.3.3 瞬时表达的Hi5细胞对Cry1Ac毒素的EC_(50)测定 |
| 4.3.4 瞬时表达的Hi5细胞对Cry1Ca毒素敏感性测定 |
| 4.3.5 数据处理与分析 |
| 4.4 结果与分析 |
| 4.4.1 棉铃虫Helicoverpa armigera ABCC2转运蛋白和Cadherin的协同作用分析 |
| 4.4.2 瞬时表达不同ABCC2或CAD蛋白后Hi5细胞对Cry1Ac毒素的敏感性分析 |
| 4.4.3 瞬时表达不同ABCC2或CAD蛋白后Hi5细胞对Cry1Ca毒素的敏感性比较 |
| 4.4.4 Hi5细胞共同表达的ABCC2与钙黏蛋白对Cry1Ac毒素协同作用分析 |
| 4.4.5 Hi5细胞共同表达ABCC2与钙黏蛋白对Cry1Ca毒素协同作用比较 |
| 4.5 讨论与小结 |
| 第五章 三种灰翅夜蛾属昆虫对Cry1Ac毒素敏感性差异分子机制 |
| 5.1 前言 |
| 5.2 实验材料 |
| 5.2.1 昆虫来源以及细胞系 |
| 5.2.2 毒素与试剂 |
| 5.2.3 蛋白抗体与试剂 |
| 5.2.4 实验主要溶液配制 |
| 5.2.5 主要引物 |
| 5.3 实验方法 |
| 5.3.1 不同物种ABCC2蛋白介导的细胞对Cry1Ac毒素敏感性比较 |
| 5.3.2 S1ABCC2和SfABCC2蛋白质氨基酸序列分析 |
| 5.3.3 介导Hi5细胞对Cry1Ac毒素敏感性差异的SlABCC2和SfABCC2蛋白相关区域分析 |
| 5.3.4 不同ABCC2蛋白的片段替换 |
| 5.3.5 影响表达SlABCC2和SfABCC2蛋白的细胞对Cry1Ac敏感性差异关键氨基酸区域 |
| 5.3.6 ABCC2单个氨基黢残基位点突变的细胞对CrylAc毒素敏感性的分析 |
| 5.3.7 ABCC2蛋白免疫印迹试验 |
| 5.3.8 ABCC2突变体介导的细胞对Cry1Ac毒素敏感性的显微观察 |
| 5.3.9 ABCC2突变体介导的细胞对Cry1Ac毒素敏感性的测定 |
| 5.3.10 数据分析与作图 |
| 5.4 结果与分析 |
| 5.4.1 受体介导的细胞对Cry1Ac毒素敏感性差异的潜在关键氨基酸残基区域位点的确定 |
| 5.4.2 关键区域单个氨基酸点突变介导的Hi5细胞对Cry1Ac敏感性分析 |
| 5.4.3 受体片段互换对蛋白的表达水平没有显着影响 |
| 5.4.4 野生型和突变体ABCC2转运蛋白的亚细胞定位 |
| 5.4.5 ABCC2氨基酸残基片段替换突变体介导的Cry1Ac毒素的EC_(50)分析 |
| 5.4.6 鳞翅目昆虫ABCC2差异关键氨基酸位点突变对Cry1Ac的EC_(50)影响 |
| 5.5 讨论与小结 |
| 第六章 总结 |
| 论文创新点 |
| 不足与展望 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间发表的学位论文 |
| 致谢 |
（5）杀蚊卵菌贵阳腐霉几丁质酶基因及CRN效应子的功能研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文献综述 |
| 1 蚊虫病原菌的研究进展 |
| 1.1 杀蚊病原菌研究的重要性 |
| 1.2 常见蚊虫病原菌的类群 |
| 1.2.1 蚊虫病原细菌 |
| 1.2.2 蚊虫病原真菌 |
| 1.2.3 蚊虫病原卵菌 |
| 1.3 蚊虫病原真菌的侵染过程 |
| 1.4 贵阳腐霉的前期研究进展 |
| 1.4.1 游动孢子通过幼虫体表侵染 |
| 1.4.2 菌丝通过幼虫肠道侵染 |
| 2 几丁质酶的研究进展 |
| 2.1 常见的几丁质酶分布及种类 |
| 2.2 几丁质酶功能的多样性 |
| 2.3 几丁质酶的抑菌机制 |
| 2.4 几丁质酶在生物防治中的应用 |
| 2.4.1 几丁质酶在真菌病害防治中的应用 |
| 2.4.2 几丁质酶在细菌防治中的应用 |
| 2.4.3 几丁质酶在害虫防治中的应用 |
| 3 CRN效应子的研究进展 |
| 3.1 植物病原卵菌CRN效应子 |
| 3.2 蚊虫病原卵菌CRN效应子 |
| 第二章 杀蚊卵菌贵阳腐霉几丁质酶基因的功能研究 |
| 1 材料方法 |
| 1.1 供试菌株 |
| 1.2 试剂及培养基的配制 |
| 1.3 淡色库蚊的饲养 |
| 1.4 贵阳腐霉基因组的提取 |
| 1.5 载体构建和质粒提取 |
| 1.6 PEG介导的贵阳腐霉遗传转化体系 |
| 1.7 贵阳腐霉沉默转化子的验证 |
| 1.7.1 DNA验证 |
| 1.7.2 qRT-PCR验证 |
| 1.8 GH18基因功能研究 |
| 1.8.1 GH18基因在各个阶段的转录水平 |
| 1.8.2 GH18基因沉默转化子及贵阳腐霉野生型表型观察 |
| 1.8.3 GH18基因沉默转化子及贵阳腐霉野生型毒力水平分析 |
| 2 结果分析 |
| 2.1 贵阳腐霉菌中几丁质酶基因GH18的生信分析及鉴定 |
| 2.2 GH18基因的系统发育和结构分析 |
| 2.3 GH18在侵染阶段转录水平 |
| 2.4 GH18基因沉默转化子的获得 |
| 2.5 Pgchi1/2是菌丝形态和游动孢子产生所必需的 |
| 2.6 Pgchi3/4和Pgchi5/6是调节氧化应激反应所必需的 |
| 2.7 Pgchi3/4和lPgchi5/6是重要的毒性因子 |
| 3 讨论 |
| 第三章 C6/36细胞系毒性筛选体系建立和贵阳腐霉PgCRN31作用靶标筛选 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 供试细胞与菌株 |
| 1.2 试剂及培养基 |
| 1.3 效应子基因的载体构建 |
| 1.4 无内毒素质粒提取 |
| 1.5 贵阳腐霉CRN效应子对C6/36细胞的毒性评估 |
| 1.5.1 C6/36细胞的培养 |
| 1.5.2 C6/36细胞的转染 |
| 1.5.3 细胞毒性检测 |
| 1.6 Western Blot |
| 1.7 PgCRN31互作靶标筛选 |
| 2 结果分析 |
| 2.1 建立贵阳腐霉效应子对C6/36细胞的毒性评价体系 |
| 2.2 贵阳腐霉CRN效应子的毒性评价 |
| 2.3 贵阳腐霉PgCRN31互作靶标筛选 |
| 2.3.1 C6/36细胞中GFP-PgCRN31的表达 |
| 2.3.2 C6/36细胞中GFP-PgCRN31的富集和免疫沉淀 |
| 2.3.3 非胶条鉴定结果的生物信息学分析 |
| 3 讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 论文发表情况 |
| 致谢 |
（6）Bt毒素诱导的细胞自噬及其机制的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一部分 前言 |
| 1.1 细胞自噬的意义 |
| 1.2 自噬的途径 |
| 1.3 Bt毒素毒杀昆虫的作用机制 |
| 1.4 Bt毒素与细胞自噬的关系及调控机制 |
| 1.4.1 Bt毒素与细胞自噬 |
| 1.4.2 宿主对Bt毒素反应的机制 |
| 1.5 本课题研究的意义 |
| 第二部分 实验材料 |
| 2.1 细胞培养基和细胞系 |
| 2.2 质粒与菌株 |
| 2.3 引物及序列 |
| 2.4 主要的药品和试剂 |
| 2.5 主要实验仪器和型号 |
| 2.6 实验中所用的溶液配制 |
| 2.6.1 常用溶液配制 |
| 2.6.2 蛋白凝胶电泳相关溶液的配制 |
| 2.6.3 Tricine-PAGE凝胶的配制 |
| 2.6.4 Western Blot(免疫印迹)相关的溶液 |
| 2.7 常用培养基的配制 |
| 2.7.1 昆虫细胞培养基的制备 |
| 2.7.2 LB培养基的配制 |
| 第三部分 实验方法 |
| 3.1 OMEGA试剂盒提质粒 |
| 3.2 OMEGA试剂盒PCR产物胶回收 |
| 3.3 OMEGA试剂盒酶切产物纯化回收 |
| 3.4 脂质体(FuGENEHD)转染昆虫细胞(六孔板) |
| 3.5 Western Blot(蛋白免疫印迹) |
| 3.6 dsRNA的合成 |
| 3.7 cDNA的合成 |
| 3.8 细胞免疫荧光 |
| 3.9 显微观察法,Cry1Ca/Cry1Ac毒素对细胞的毒力分析 |
| 3.10 荧光定量PCR检测干扰效率 |
| 3.11 双分子荧光互补技术探索蛋白之间的相互作用 |
| 3.12 Pull down技术探索Jnk与Atg8蛋白的相互作用 |
| 第四部分 实验结果 |
| 4.1 Cry毒素对Hi5/Sl-HP/Sf9细胞的毒力 |
| 4.2 Cry毒素诱导昆虫细胞自噬 |
| 4.2.1 Cry1Ca对多种细胞自噬的诱导 |
| 4.2.2 Cry1Ac毒素处理Hi5/Sl-HP/Sf9/293T细胞后对自噬的诱导 |
| 4.2.3 Cry1Ac毒素受体HaABCC2和Cadherin介导的毒力及渗透压变化对自噬的影响 |
| 4.3 超表达GFP-Atg8后,毒素处理细胞 |
| 4.3.1 超表达GFP-Atg8,Cry毒素处理S1-HP细胞后自噬的增强 |
| 4.3.2 超表达GFP-Atg8,Cry毒素处理Hi5细胞后观察对自噬的影响 |
| 4.3.3 超表达GFP-Atg8,Cry1Ca毒素处理Sf9细胞后自噬增强 |
| 4.3.4 Cry毒素处理Sl-HP细胞,免疫荧光的方法观察毒素对细胞自噬的影响 |
| 4.4 自噬抑制剂对Cry1Ca毒素诱导细胞自噬的影响 |
| 4.4.1 自噬抑制剂抑制Cry1Ca毒素处理Hi5细胞后的自噬 |
| 4.4.2 Baf/CQ/ConA三种自噬抑制剂处理Hi5细胞,细胞对Cry1Ca毒素的敏感性下降 |
| 4.5 自噬相关基因对Cry毒素毒力的影响 |
| 4.5.1 合成Hi5Atg8/Atg5/Atg13dsRNA干扰自噬基因 |
| 4.5.2 干扰Hi5Atg8/Atg5/Atg13后Cry1Ca毒素对细胞的毒力的影响 |
| 4.6 Jnk/P38/PI3K信号抑制剂处理细胞毒素毒力的影响 |
| 4.6.1 Jnk/P38/PI3K信号抑制剂抑制Cry1Ca毒素诱导Hi5细胞自噬的发生 |
| 4.6.2 Jnk/P38/PI3K三种信号抑制剂处理后,Hi5细胞对Cry1Ca毒素的敏感性变化 |
| 4.6.3 Jnk/P38/PI3K三种信号抑制剂处理后,Sl-HP细胞对Cry1Ca毒素的敏感性变化 |
| 4.6.4 Jnk/P38/PI3K三种信号抑制剂处理后,Sl-HP细胞对Cry1Ac毒素的敏感性变化 |
| 4.6.5 三种信号抑制剂处理后,Sf9细胞Cry1Ca毒素的敏感性变化 |
| 4.7 干扰SlJnk对毒素诱导细胞自噬和细胞对毒素的敏感性的影响 |
| 4.7.1 SlJnkdsRNA的合成和干扰效率检测 |
| 4.7.2 干扰SlJnk对Cry1Ca毒素诱导细胞自噬 |
| 4.7.3 干扰SlJnk对Cry1Ca毒素毒力的影响 |
| 4.8 SlJnk-GFP重组质粒的构建及蛋白在Sl-HP细胞中的定位 |
| 4.8.1 pIE2-EGFP-N1-SlJnk真核表达质粒的构建 |
| 4.8.2 SlJnk-GFP蛋白在细胞中的定位 |
| 4.8.3 SlJnk-GFP蛋白与内源性Atg8在Sl-HP细胞中的共定位 |
| 4.8.4 双分子荧光技术探索SlJnk与Atg8的相互作用 |
| 4.8.5 双分子荧光技术探索SlJnk与Atg1的相互作用 |
| 4.9 Pull down技术探索Jnk与Atg8的相互作用 |
| 4.9.1 以Atg8作为诱饵蛋白的Pull down实验 |
| 4.9.2 以Jnk作为诱饵蛋白的Pull down |
| 第五部分 讨论 |
| 5.1 Cry毒素诱导细胞自噬的发生 |
| 5.2 自噬调节昆虫细胞对Cry毒素的敏感性 |
| 5.3 Cry毒素通过Jnk信号途径诱导昆虫细胞自噬 |
| 本论文的创新之处 |
| 参考文献 |
| 硕士期间合作发表论文 |
| 致谢 |
（7）棉铃虫ABC转运蛋白ABCG1的基因克隆和功能分析（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 1 前言 |
| 1.1 转基因作物的种植 |
| 1.2 Bt毒蛋白的种类及结构 |
| 1.2.1 Bt毒蛋白的分类 |
| 1.2.2 Bt毒蛋白Cry毒素的结构 |
| 1.3 Cry毒素的作用机制 |
| 1.3.1 穿孔模型 |
| 1.3.2 信号通路模型 |
| 1.4 靶标害虫Bt抗性产生因素 |
| 1.4.1 生化水平 |
| 1.4.2 分子水平 |
| 1.5 ABC蛋白转运家族 |
| 1.5.1 ABC蛋白的结构域功能 |
| 1.5.2 ABCG蛋白亚家族 |
| 1.6 本研究的目的与意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 供试昆虫以及饲养条件 |
| 2.1.2 实验所用试剂以及出产公司 |
| 2.2 实验仪器 |
| 2.3 各种培养基以及溶液的配制 |
| 2.3.1 细胞培养基以及转染溶液的配制 |
| 2.3.2 昆虫细胞以及培养方法 |
| 2.3.3 研究中用到的菌体和质粒 |
| 2.4 实验方法 |
| 2.4.1 棉铃虫总RNA的提取、cDNA第一链的合成 |
| 2.4.2 HaABCG1基因的生物信息学分析 |
| 2.4.3 系统树的构建 |
| 2.4.4 PCR引物和探针的设计与合成 |
| 2.4.5 RNAi与实时荧光定量PCR |
| 2.4.6 目的基因的扩增及克隆 |
| 2.4.7 供体质粒pEGFP-N1/HaABCG1的构建 |
| 2.4.8 昆虫细胞的培养以及重组质粒转染细胞 |
| 2.4.9 HaABCG1蛋白的亚细胞定位 |
| 2.4.10 HaABCG1介导不同Bt毒素毒力的细胞功能验证 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 HaABCG1基因的克隆及蛋白序列分析 |
| 3.1.1 HaABCG1基因的PCR扩增及克隆鉴定 |
| 3.1.2 分析蛋白序列 |
| 3.2 HaABCG1基因的进化树分析 |
| 3.3 构建昆虫细胞表达载体 |
| 3.4 HaABCG1-GFP融合蛋白的亚细胞定位 |
| 3.5 HaABCG1介导几种Bt毒素的细胞毒力功能验证 |
| 3.6 RNAi和生物测定分析HaABCG1基因功能 |
| 4 讨论 |
| 4.1 ABCG1基因不介导Cry1Ac毒素的毒力 |
| 4.1.1 棉铃虫ABCG1不是Cry1Ac毒素的受体 |
| 4.1.2 HaABCG1基因的下调表达与Cry1Ac毒素的关系 |
| 4.2 HaABCG1与其他Bt蛋白之间的关系 |
| 4.3 ABCG1的变异与其他靶标害虫的关系 |
| 5 结论 |
| 6 参考文献 |
| 7 致谢 |
| 8 硕士期间发表的文章 |
（8）苏云金芽胞杆菌Cry1类原毒素C端区域的功能研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 绪论 |
| 1 苏云金芽胞杆菌简介及应用 |
| 2 杀虫晶体蛋白 |
| 2.1 杀虫晶体蛋白的分类 |
| 2.2 杀虫晶体蛋白的结构及作用机理 |
| 2.2.1 杀虫晶体蛋白的结构解析 |
| 2.2.2 杀虫晶体蛋白的杀虫机理 |
| 2.2.3 Bt功能基因间的融合表达 |
| 2.2.4 杀虫晶体蛋白的协同增效作用 |
| 3 杀虫晶体蛋白C-端结构的功能研究 |
| 4 杀虫蛋白对昆虫细胞毒性的研究 |
| 5 立题依据和意义 |
| 第二章 苏云金芽胞杆菌原毒素C-端区域对Cry2Aa晶体形成及毒力的影响研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 菌株及质粒 |
| 1.1.2 培养基 |
| 1.1.3 抗生素及其使用终浓度 |
| 1.1.4 DNA引物合成及测序 |
| 1.1.5 试剂 |
| 1.1.6 仪器设备 |
| 1.2 研究方法 |
| 1.2.1 菌株培养条件及保藏方法 |
| 1.2.2 Bt基因组DNA的提取 |
| 1.2.3 PCR扩增 |
| 1.2.4 PCR产物纯化 |
| 1.2.5 酶切及连接体系 |
| 1.2.6 DNA胶回收 |
| 1.2.7 大肠杆菌感受态细胞制备 |
| 1.2.8 DNA转化 |
| 1.2.9 质粒DNA的提取 |
| 1.2.10 Red/ ET同源重组 |
| 1.2.11 融合表达质粒的构建 |
| 1.2.12 电转化XBU001 |
| 1.2.13 菌落PCR鉴定 |
| 1.2.14 重组菌株的显微镜观察 |
| 1.2.15 发酵产物的SDS-PAGE分析 |
| 1.2.16 杀虫晶体蛋白的溶解性及胰酶激活分析 |
| 1.2.17 胶内酶解及质谱鉴定 |
| 1.2.18 协同生物活性测定 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 XBU/pCry2Aa-1Ac表达菌株的构建 |
| 2.1.1 pCry2Aa-1Ac质粒的构建 |
| 2.1.2 XBU/pCry2Aa-1Ac菌株的鉴定 |
| 2.2 工程菌株的相差显微镜和扫描电镜观察 |
| 2.3 Bt融合表达工程菌株的SDS-PAGE分析 |
| 2.3.1 融合蛋白的SDS-PAGE分析及质谱鉴定 |
| 2.3.2 融合蛋白的溶解性及胰酶激活分析 |
| 2.4 工程菌株的协同生物活性测定 |
| 3 讨论 |
| 第三章 Cry1Ac原毒素C-端区域Cys残基的功能研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 Bt菌株 |
| 1.1.2 细胞菌株 |
| 1.1.3 培养基与抗生素 |
| 1.1.4 试剂 |
| 1.1.5 仪器设备 |
| 1.2 研究方法 |
| 1.2.1 菌株培养条件 |
| 1.2.2 细胞培养 |
| 1.2.3 工程菌株培养与扫描电镜观察 |
| 1.2.4 晶体蛋白的溶解性和胰酶稳定性分析 |
| 1.2.5 晶体蛋白对CF203/2.5细胞的作用的影响 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 Bt工程菌株的伴胞晶体的扫描电镜观察 |
| 2.2 野生及突变Cry1Ac的溶解性和胰酶稳定性分析 |
| 2.3 野生及突变Cry1Ac对极色卷蛾中肠细胞活性和细胞增殖影响 |
| 3 讨论 |
| 第四章 结论和展望 |
| 1 结论 |
| 2 展望 |
| 参考文献 |
| 缩略表(中英文对照) |
| 攻读硕士学位期间撰写和发表的论文 |
| 课题受资助的基金项目 |
| 致谢 |
（9）苏云金芽胞杆菌分离鉴定及对马铃薯二十八星瓢虫特异活性菌株研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 引言 |
| 1.1 苏云金芽胞杆菌生物学特性及Bt 菌株的分离鉴定 |
| 1.1.1 苏云金芽胞杆菌生物学特性 |
| 1.1.2 苏云金芽胞杆菌分离鉴定 |
| 1.2 苏云金芽胞杆菌杀虫毒素 |
| 1.2.1 Cry 杀虫晶体蛋白命名 |
| 1.2.2 编码Cry 杀虫晶体蛋白基因的鉴定方法 |
| 1.2.3 Cry 杀虫晶体蛋白结构与功能 |
| 1.2.4 Cry 杀虫晶体蛋白作用机理 |
| 1.3 对鞘翅目昆虫有活性的Bt 杀虫毒素及其应用 |
| 1.3.1 对叶甲类害虫高毒力的Cry 毒素 |
| 1.3.2 对蛴螬类害虫高毒力的Cry 毒素 |
| 1.3.3 对光肩星天牛的研究进展 |
| 1.4 本研究选题的目的和意义 |
| 第二章 含cry7 类基因的菌株分离筛选及生物学鉴定 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 材料 |
| 2.1.2 方法 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 含cry7 基因的菌株筛选 |
| 2.2.2 培养特性及晶体形状观察 |
| 2.2.3 基因型分析 |
| 2.2.4 蛋白型分析 |
| 2.2.5 生物活性 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 对马铃薯二十八星瓢虫特异杀虫活性的Bt WZ-9 菌株研究 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 材料 |
| 3.1.2 研究方法 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 Bt WZ-9 菌株形态与生长特性 |
| 3.2.2 Bt WZ-9 杀虫活性 |
| 3.2.3 Bt WZ-9 菌晶体蛋白SDS-PAGE 分析 |
| 3.2.4 Bt WZ-9 基因型 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 第四章 Bt cry7Ab3 基因的克隆和原核表达 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 材料 |
| 4.1.2 研究方法 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.2.1 cry7Ab3 基因克隆和序列分析 |
| 4.2.2 Cry7Ab3 蛋白氨基酸的序列组成分析 |
| 4.2.3 cry7Ab3 基因原核表达 |
| 4.2.4 Cry7Ab3 原核表达蛋白纯化 |
| 4.2.5 多克隆抗体效价 |
| 4.2.6 原核表达Cry7Ab3 蛋白生物活性 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 结论 |
| 第五章 Bt 工程菌构建 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 材料 |
| 5.1.2 研究方法 |
| 5.2 结果与分析 |
| 5.2.1 穿梭表达载体构建 |
| 5.2.2 工程菌构建 |
| 5.2.3 工程菌Bt HD73-Cry7Ab3 蛋白 SDS-PAGE 检测 |
| 5.2.4 晶体形状观察 |
| 5.2.5 工程菌生长特性 |
| 5.2.6 工程菌遗传稳定性 |
| 5.2.7 工程菌晶体蛋白提取和定量 |
| 5.2.8 工程菌的生物活性测定 |
| 5.3 讨论 |
| 5.4 小结 |
| 第六章 Cry7Ab3 蛋白最短活性区的研究 |
| 6.1 材料与方法 |
| 6.1.1 实验材料 |
| 6.1.2 研究方法 |
| 6.2 结果与分析 |
| 6.2.1 不同长度cry7Ab3 基因片段的克隆和检测 |
| 6.2.2 不同长度cry7Ab3 基因片段的表达 |
| 6.2.3 不同Cry7Ab3 蛋白片段的生物活性测定 |
| 6.3 讨论 |
| 6.4 小结 |
| 第七章 Cry7Ab3 毒素对马铃薯二十八星瓢虫作用机理的研究 |
| 7.1 材料与方法 |
| 7.1.1 材料 |
| 7.1.2 方法 |
| 7.2 结果与分析 |
| 7.2.1 胰蛋白酶酶解Cry7Ab3 原毒素结果 |
| 7.2.2 胃蛋白酶酶解Cry7Ab3 原毒素结果 |
| 7.2.3 马铃薯二十八星瓢虫中肠蛋白酶酶解Cry7Ab3 原毒素结果 |
| 7.2.4 Bt Cry7Ab3 原毒素蛋白体外酶解后活性变化 |
| 7.2.5 Cry7Ab3 原毒素对马铃薯二十八星瓢虫中肠组织影响 |
| 7.2.6 Cry7Ab3 活性毒素蛋白纯化及抗体制备 |
| 7.2.7 Cry7Ab3 活性毒素结合受体检测 |
| 7.3 讨论 |
| 7.4 小结 |
| 全文结论 |
| 创新点 |
| 问题与展望 |
| 参考文献 |
| 在读期间发表的学术论文 |
| 作者简历 |
| 致谢 |
（10）苏云金芽孢杆菌伴孢晶体的研究进展（论文提纲范文）
| 1 Bt毒素的分类和基因型的命名 |
| 1.1 Bt毒素的分类 |
| 1.2 Bt伴孢晶体编码基因的命名 |
| 2 伴孢晶体的蛋白结构和杀虫机理 |
| 2.1 伴孢晶体的蛋白结构 |
| 2.2 杀虫晶体蛋白的作用机理 |
| 3 Bt/杀虫蛋白的应用 |
| 3.1 野生菌株直接工业化生产 |
| 3.2 构建基因工程菌株 |
| 3.3 构建Cry毒素蛋白转基因植物 |
| 4 Bt生物农药的发展前景 |
四、苏云金芽孢杆菌Cry1C毒素对昆虫细胞的毒力研究（论文参考文献）
- [1]苏云金芽孢杆菌及其伴孢晶体杀虫剂研究进展[J]. 黄慧敏,曾远婷,王磊. 广东化工, 2021(10)
- [2]二化螟Cry1Ab耐受品系及田间种群对Bt蛋白的敏感性研究[D]. 张洪涛. 中国农业科学院, 2020
- [3]苏云金芽胞杆菌Cry毒素蛋白抗蚜活性评价及其作用机理研究[D]. 张斌武. 华侨大学, 2019(01)
- [4]受体介导的三种灰翅夜蛾属昆虫对Bt毒素敏感性差异分子机制的研究[D]. 刘磊磊. 华中师范大学, 2019
- [5]杀蚊卵菌贵阳腐霉几丁质酶基因及CRN效应子的功能研究[D]. 王婧. 南京农业大学, 2019(08)
- [6]Bt毒素诱导的细胞自噬及其机制的研究[D]. 远万里. 华中师范大学, 2018(01)
- [7]棉铃虫ABC转运蛋白ABCG1的基因克隆和功能分析[D]. 公玲玲. 山东农业大学, 2017(02)
- [8]苏云金芽胞杆菌Cry1类原毒素C端区域的功能研究[D]. 陆秀青. 湖南师范大学, 2016(01)
- [9]苏云金芽胞杆菌分离鉴定及对马铃薯二十八星瓢虫特异活性菌株研究[D]. 宋萍. 河北农业大学, 2012(08)
- [10]苏云金芽孢杆菌伴孢晶体的研究进展[J]. 李雪,马玉超,李煦,于慧敏,张建. 安徽农业科学, 2012(10)