一、兔晶状体皮质吸出后FGF-R1mRNA在细胞增殖中的作用（论文文献综述）
令狐绍容[1]（2020）在《Hsp47在兔眼晶状体超声乳化术后囊膜组织中的表达特征》文中指出目的:研究Hsp47（Heat Shock Protein-47）在幼兔眼后发性白内障（Posterior capsular opacification,PCO）囊膜组织中的表达特征,探索Hsp47在兔眼PCO发生发展中对囊膜组织纤维化的作用,为后期在体调控Hsp47以防治PCO提供新策略和理论依据。方法:6周龄健康白色幼兔36只（雌雄不限）随机分为正常对照组（6只）和实验组（30只）。实验组分5亚组,即幼兔右眼晶状体超声乳化摘除于术后即刻、12小时、5天、1月、3月,术后观察并记录囊膜混浊情况,在相应时间点处死后留存晶状体囊膜组织。正常对照组不进行手术处理;6周龄幼兔直接处死后摘除眼球置于冰块上,晶状体前囊膜撕5.0mm囊口,剪除角膜,虹膜,离断悬韧带,取晶状体囊膜组织留存。剪取前囊至后囊（2×6mm）条形囊膜,予4%甲醛固定用于HE染色,Masson染色观察囊膜组织纤维化的表达情况。余囊膜组织用QRT-PCR法和Western-Boltting法检测各组兔眼囊膜组织中Hsp47、I型胶原、a-平滑肌肌动蛋白（alpha-smooth muscle actin,a-SMA）、基质金属蛋白酶-2（Matrix Metalloproteinase 2,MMP2）、蛋白酶抑制因子-2（Tissue Inhibitors of Metalloproteinase,TIMP-2）的mRNA及蛋白表达水平。结果（1）HE染色及Masson染色后见正常对照组晶状体囊膜结构完整,上皮细胞呈线状整齐排列,形态一致,大小均一,细胞核呈杆状。术后即刻可见细胞水肿,胞质淡染疏松;术后12小时晶体上皮细胞胞质淡染疏松,细胞间隙增大;术后第5天,晶体上皮细胞增生,部分开始疏松,脱落;术后1月,晶体上皮细胞脱落,变形,细胞间有散在胶原组织;术后3月,晶体上皮细胞不同程度萎缩,脱落,细胞间见大量胶原组织,囊膜内表面基底膜见不连续胶原纤维沉积。（2）IHC检测正常对照组Ⅰ型胶原和Hsp47的表达均呈弱阳性;实验组Ⅰ型胶原和Hsp47的表达均呈阳性,且术后5天后,Hsp47和I型胶原表达均呈增加趋势。（3）QRT-PCR检测:Hsp47、I型胶原mRNA在正常对照组及实验组的总体比较差异存在统计学意义（Hsp47 F=14.792,P=0.000;I型胶原F=50.302,P=0.000）。其中正常对照组Hsp47较实验组各亚组比较存在统计学差异（P<0.05）;而Ⅰ型胶原mRNA的表达仅术后3月存在统计学差异（P<0.05）,其余亚组与正常对照组比较,差异没有统计学意义（P>0.05）。a-SMA mRNA的相对表达量为:在正常对照组及实验组的总体比较差异存在统计学意义（a-SMA F=31.224,P=0.000）,正常对照组较实验组中个亚组比较存在差异统计学差异（P<0.05）。MMP-2、TIMP-2 mRNA在正常对照组及实验组的总体比较差异存在统计学意义（MMP-2 F=23.315,P=0.000;TIMP-2 F=19.437,P=0.000）,正常对照组较实验组中个亚组比较存在差异统计学差异（P<0.05）。（4）Western-Blot检测:Hsp47蛋白表达水平:正常对照组,术后即刻、12h、5天、1月、3月分别是:774.46±51.40、598.67±34.11、393.75±36.49、1675.22±66.97、1492±69.81、1113.01±45.12。I型胶原蛋白表达水平分别是:882.57±63.6、574.27±27.49、311.11±63.61、2521.91±25.67、1719.3±36.59、1155.53±7.46。实验组与正常对照组Hsp47、I型胶原蛋白总体比较差异存在统计学意义（Hsp47 F=177.524,P=0.000,I型胶原F=343.08,P=0.000）。Hsp47和I型胶原蛋白分别在术后各时间点表达量均存在统计学差异（P<0.05）;在术后第5天,Hsp47、I型胶原蛋白表达量均达最高值。a-SMA蛋白表达水平各组依次是403.14±87.79、658.23±37.93、671.72±9.3、2098.01±62.3、1729.716±52.59、1330.24±33.89,正常对照组较实验组比较,差异存在统计学意义（P<0.05）。MMP-2蛋白表达水平分别是:556.57±15.12、943.54±76.83、1148.81±52.82、2058.69±35.68、1708.43±28.33、1277.84±65.2,实验组与正常对照组比较,存在统计学差异（P<0.05）。正常对照组与实验组不同时点MMP-2蛋白总体比较,存在统计学差异（F=436.385,P=0.000）。TIMP-2蛋白表达水平各组依次是1367.57±12.68、843.60±30.28、569.84±41.529、1614.24±4.74、269.71±13.76、746.01±44.04,实验组与正常对照组比较,存在统计学差异（P<0.05）。正常对照组与实验组TIMP-2蛋白总体比较存在统计学差异（F=386.421,P=0.000）。（5）经Pearson双变量相关性分析检验:兔晶状体超声乳化术后囊膜组织中Hsp47与I型胶原的mRNA相对表达量间呈高度正相关（P<0.05,r=0.960）。Hsp47与I型胶原的蛋白表达量呈高度正相关（P<0.05,r=0.933）。结论:1.Hsp47在兔眼正常晶状体囊膜组织以及PCO囊膜组织中均有表达,但是PCO中表达明显增高。PCO中Hsp47与I型胶原在mRNA和蛋白水平表达均呈高度正相关。且随时间变化,二者表达趋势吻合。2.术后早期（5天左右）是幼兔PCO发生的关键时间节点,该结论为临床干预PCO发生发展的最佳时机提供理论依据。3.MMP-2参与PCO发生发展的全过程,MMP-2持续高表达是机体受损伤修复刺激,加之细胞外基质尤其是Ⅰ型胶原增多调控其继续增高,二者共同作用的结果。
罗雪兰[2]（2017）在《27nt-miRNA对eNOS表达/活性调节及NO生成、血管新生的影响及相关机制研究》文中研究指明目的:本课题组前期研究显示,27nt-miRNA由内皮型NOS（eNOS）的第4内含子27碱基重复序列产生,并负性调控eNOS的转录水平和蛋白表达水平。本研究进一步探讨27nt-miRNA对eNOS表达、活性的调节及代谢产物NO的生成、血管新生的影响及相关分子机制研究:1)研究27nt-miRNA对血管内皮细胞eNOS基因表达的调节及其相关分子调控机制;2)明确27nt-miRNA对血管内皮细胞eNOS活性及其代谢产物NO生成的影响及其分子机制;3)阐明27nt-miRNA对细胞增殖、迁移和管腔形成的影响及其相关分子机制,为分子水平治疗心血管疾病提供理论依据。方法:1)构建27nt-miRNA野生型与突变型基因序列的高表达质粒,使用X-treme GENE HP DNA脂质体进行转染,根据所染的质粒将人脐静脉内皮细胞（Human umbilical vein endothelial cells,HUVECs）分为:空白质粒对照组（Control group）、野生型27-nt-miRNA质粒组（Wt-27-ntmiRNA组）和突变型27-nt-miRNA质粒组（Mut-27-nt-miRNA组）。2)检测27nt-miRNA对eNOS基因表达的影响:将空白质粒、Wt-27-ntmiRNA质粒和Mut-27-nt-miRNA质粒转染入HUVECs。应用RT-PCR实验检测eNOS mRNA和核转录因子AP-1 mRNA转录水平的改变;应用免疫细胞化学实验（Immunocytochemistry）和免疫印迹实验（western blotting）检测eNOS蛋白和核转录因子AP-1蛋白表达水平的改变。3)检测27nt-miRNA对eNOS活性及其代谢产物NO生成的影响:将空白质粒、Wt-27-nt-miRNA质粒和Mut-27-nt-miRNA质粒转染入HUVECs。应用酶联免疫吸附测定法（ELISA）测定不同时间细胞培养液中eNOS活性的变化;应用硝酸还原法测定不同时间细胞培养上清液中NO生成的变化。4)检测27nt-miRNA对HUVECs增殖的影响:将空白质粒、Wt-27-nt-miRNA质粒和Mut-27-nt-miRNA质粒转染入HUVECs。细胞转染消化后接种于96孔板,并于24、48和72 h三个时间点,采用MTT法检测各实验HUVECs的增殖能力。5)检测27nt-miRNA对HUVECs迁移和管腔形成的影响:将空白质粒、Wt-27-nt-miRNA质粒和Mut-27-nt-miRNA质粒转染入HUVECs。细胞转染消化后接种于96孔板,采用划痕试验检测各组细胞的迁移能力;采用人工基底膜（Matrigel）检测各组细胞的管腔形成能力。结果:1)与对照组比较,27nt-miRNA高表达组eNOS mRNA和AP-1 mRNA转录水平明显降低（P<0.05）,eNOS和AP-1蛋白表达明显下降（P<0.05）。2)与对照组比较,27nt-miRNA高表达组细胞培养液上清中eNOS活性明显减弱（P<0.05）及其代谢产物NO生成明显减少（P<0.05）。3)与对照组比较,27nt-miRNA高表达组的细胞增殖能力明显降低（P<0.05）,迁移能力明显下降（P<0.05）,血管新生面积比率也明显降低（P<0.05）。结论:1)27nt-miRNA显着抑制血管内皮细胞eNOS mRNA转录和蛋白表达,显着抑制核转录因子AP-1 mRNA转录和蛋白表达,AP-1的参与可能是这一调节过程的重要分子机制之一。2)27nt-miRNA显着抑制血管内皮细胞eNOS活性及其代谢产物NO的生成,并且可能与其对eNOS基因的调控表达有关。3)27nt-miRNA显着抑制血管内皮细胞的增殖、迁移和管腔形成能力,可能与其对eNOS基因的调控表达有关,并且eNOS/NO/可能是其调控的相关通路之一。
龙潭[3]（2013）在《高氧及血管内皮生长因子对晶状体发育的影响》文中认为目的：晶状体在整个发育过程处于低氧分压状态,这可能导致晶状体上皮细胞自身表达VEGF。晶状体上皮细胞表达VEGF可能与玻璃体血管的形成有关,同时亦可通过自分泌或旁分泌作用影响晶状体本身的生长和分化。已有大量研究表明VEGF对多种来源的干细胞具有促进分化及保持存活的作用。晶状体上皮细胞的生发区存在有干细胞/祖细胞样细胞。VEGF对于晶状体干细胞样细胞发育及分化的影响仍未见相关报道。在高氧分压下,细胞VEGF的表达会有所下降。因此通过对新生仔鼠高氧环境下饲养,观察高氧条件下,晶状体VEGF表达量的变化,以及与干细胞标记物表达的相关性,初步探讨VEGF对晶状体上皮细胞中干细胞样细胞分化及发育的可能影响,并为先天性白内障及后发性白内障发生机理及预防治疗提供一个新的思路。方法：1、将出生后第2天（postnatal, P1.5）仔鼠于75%高氧分压下饲养,分别于P3.5,P8.5取眼球。观察高氧条件下仔鼠晶状体形态学改变,组织学变化,并通过透射电子显微镜观察晶状体上皮细胞超微结构的变化。2、取上述时间点仔鼠晶状体,行免疫组化和荧光定量PCR检测,观察不同时间点高氧条件对仔鼠晶状体上皮细胞VEGF和Nestin的影响,分析干细胞特性的改变以及与VEGF的关系。3、观察高氧条件对仔鼠晶状体上皮细胞增殖的影响。取上述时间点仔鼠晶状体,行荧光定量PCR检测不同时间点高氧分压对于晶状体细胞PCNA mRNA转录的影响。使用免疫组化观察PCNA、BrdU的染色变化,以进一步分析增殖能力的变化。使用细胞核DAPI染色,初步观察上皮细胞凋亡的变化情况。结果：1、高氧分压对仔鼠晶状体的发育可以产生影响。P3.5时,仔鼠晶状体高氧组和对照组在形态学上无显着差异。P8.5时,晶状体的水平直径与对照无统计学差异,但是高氧分压使晶状体变薄,并且混浊率增加。P3.5时,高氧组和对照组仔鼠晶状体组织学上无明显差异。P8.5时,可见对照组前囊下上皮细胞为单层细胞,细胞核为横椭圆形,排列规则,而高氧组前囊下上皮细胞多为单层细胞,细胞核为圆形或不规则形,且细胞排列不整齐。对照组赤道部上皮细胞多为单层,偶见复层细胞,可能为生发区,细胞核前部为圆形,向后逐渐过渡为梭形。而高氧组赤道部复层细胞比对照组增多,细胞核亦自前部圆形向后逐渐过渡为梭形。透射电子显微镜显示高氧组P8.5时囊膜缺失。2、高氧分压可使仔鼠晶状体上皮细胞中VEGF的表达下降、Nestin表达增加。P3.5和P8.5时,高氧组仔鼠晶状体中VEGF mRNA的转录水平比对照均显着下降,免疫组化可见P3.5时高氧组晶状体上皮细胞VEGF表达较对照减弱。PCR和免疫组化表明,P3.5时高氧组仔鼠晶状体中Nestin的表达与对照无明显差异,而P8.5时高氧组比对照组增强。3、高氧分压条件可以促使仔鼠晶状体上皮细胞增殖能力增强。PCR和免疫组化均可见P3.5和P8.5时,高氧组仔鼠晶状体中PCNA的表达较对照组增强。同时在P3.5和P8.5时,高氧组仔鼠晶状体上皮细胞BrdU染色均对照组显着增强。DAPI核染色显示高氧组和对照组在两个时间点均可见赤道部凋亡的细胞核。结论：高氧分压可使仔鼠晶状体体积减小,这可能与晶状体上皮细胞合成晶状体蛋白减少有关。而晶状体囊膜消失可能与晶状体上皮细胞合成的胶原蛋白异常或合成了特殊的胶原蛋白水解酶有关。同时晶状体上皮细胞中VEGF表达减少,而干细胞特性增强,细胞增殖能力增强。这亦反映了晶状体上皮细胞成熟的延迟或减慢。而既往文献报道VEGF可促进培养的人晶状体上皮细胞增殖能力增强,这可能与实验条件不同或在体条件下,高氧可诱发其他途径促进晶状体上皮细胞增殖有关。本研究对晶状体上皮细胞分化成熟的可能机制进行了初步的探讨,并为进一步研究白内障的发生机制提供了初步的理论依据。本研究可为防治白内障及后发性白内障提供一定的理论基础。
张枫,毕馨月[4]（2013）在《整合素β1在晶状体后囊混浊形成中的作用及其干预研究》文中认为目的研究去整合素对后发障形成的影响,探讨整合素β1在HLECs转分化中的作用机制。方法免疫荧光染色检测整合素β1在后发障动物模型中的表达、逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）检测整合素β1 mRNA的变化、酶联免疫法检测房水中TGF-β2的变化。免疫荧光染色检测整合素β1在后发障体外模型中的表达,逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）检测整合素β1 mRNA的变化,去整合素（Kistrin）生行干预后检测整合素β1及其mRNA的表达。结果在兔的后发障动物模型及离体后发障模型中,整合素β1及其mRNA的表达在术后6周表达最强,在术后8周表达减弱。整合素β1及其mRNA在术后6周的表达与术后4周、8周相比,差异有显着性（P<0.05）。在离体后发障动物模型中,使用去整合素（Kistrin）进行干预后,干预组整合素β1表达免疫荧光面积为（0.03±0.02）%,对照组为（0.14±0.06）%,差异有显着性（P<0.05）;模型中整合素β1及其mRNA的表达下降（P<0.05）。结论整合素β1参与了后发障的发生,可以通过抑制整合素β1的表达来抑制后发障的发生。
李志清[5]（2012）在《Pax6基因转录本对HLE-B3细胞生物学功能调控的实验研究》文中研究说明目的:1.建立大鼠后囊膜浑浊模型并测定Pax6转录本的表达变化。2.在HLE-B3细胞系通过敲减及回复表达Pax6转录本,观察其对B3细胞的影响。3.利用基因芯片技术进行全基因表达谱检测观察随着Pax6转录本表达变化对下游基因的影响。方法:1.32只大鼠随机分组右眼行ECLE,分别取手术后不同时间点的大鼠后囊膜组织,通过Real-time PCR测定后囊膜上Pax6基因转录本的表达水平。2.利用半定量PCR测定了人HLEB3细胞中Pax6的水平,构建靶向Pax6的shRNA慢病毒载体,应用shRNA干扰慢病毒感染B3细胞,观察Pax6基因敲减后对B3细胞活力增殖的影响。3.构建分别表达Pax6基因两个转录本的慢病毒载体,在Pax6敲减后的细胞中进行回复表达,研究两个转录本对B3细胞活力增殖的影响。4.利用上述shRNA干扰后及分别回复转录本1或转录本2,分别抽提RNA,再用Agilent 4X44K人类全基因表达谱芯片进行检测,分析Pax6基因变化对下游基因的影响及2个转录本的功能差异。结果:1.成功复制了大鼠后发障模型,构建了大鼠Pax6基因的质粒并进行测序,获得大鼠Pax6两个转录本的序列。检测Pax6两个转录本的表达,在手术后7天,Pax6两种转录本的表达均有所增加,在术后14天时又有一定程度的回复,至28天时降至最低。两种转录本的表达趋势比较相似。2.成功构建了 Pax6 shRNA重组慢病毒载体,抑制Pax6基因表达后,B3细胞凋亡的数目成倍增加。3.敲减Pax6基因的表达水平后,单独回复表达其中一个Pax6转录本,不但不能逆转敲减Pax6造成的细胞活力下降、增殖减缓,反而加重了这种变化。特别是回复表达转录本2,导致了更明显的细胞活力下降和增殖减缓,并且凋亡细胞数量也显着的增加。4.基因芯片的结果显示Pax6基因被敲减后,有224个基因表达被上调,144个基因表达被下调;RNAi的同时回复转录本1的表达,引起758个基因表达上调和211个基因表达下调;RNAi的同时回复转录本2的表达,引起2033个基因表达上调和617个基因表达下调。回复表达所引起的基因表达的变化要更加明显,尤其是2号转录本。结论:1.大鼠后发障模型Pax6基因的表达存在变化,而且在术后即刻、7d、14d、28d表达量有规律性改变,两种转录本的表达趋势比较一致。2.Pax6基因表达下调、在Pax6基因下调后单独上调转录本1或转录本2的表达,都表现出一致的抑制细胞增殖,凋亡增加,但程度上是有差异的。3.基因芯片结果显示:Pax6两个转录本的回复表达,比Pax6的基因敲减,引起了更多与细胞周期和凋亡相关的基因表达的变化,包括WNT、p53信号通路的一些基因和Caspase相关的基因。
邱晓頔[6]（2012）在《白内障患者诱导性多能干细胞（iPS）的建立及其定向分化的研究》文中指出年龄相关性白内障（age-related cataract, ARC）为全球致盲眼病的主要原因。在我国约有250万人因白内障致盲,占全球白内障致盲总数的10%。随着人口的老龄化,预计我国每年新增白内障患者将超过100万,而我国的白内障年手术量尚不足以解决每年的新增例数。因此,我国的白内障盲防治问题十分严峻。而先天性白内障是指出生前即存在,或出生后才逐渐形成的先天遗传或发育障碍的白内障,超过1/3的患者是遗传所致。任何参与、影响晶状体发育的基因突变都可能导致先天性白内障的发生。因此,明确先天性白内障的发病机制对于治疗及预防先天性白内障的发生发展具有重要的意义。白内障摘除联合人工晶状体（intraocular lens, IOL）植入是目前治疗白内障最常用且效果较为理想的方法,而后囊膜混浊（posterior capsular opacification, PCO）是影响病人术后远期视力预后的最常见的并发症,其术后5年的发生率高达30%左右。虽然可以利用激光或者手术切开混浊的后囊膜,但是却增加了病人的经济负担,并会带来新的并发症。所以如何预防PCO的发生是眼科医生和病人都比较关注的一个问题。体细胞诱导成为多能干细胞（induced pluripotent stem cells, iPSCs）的研究成果被国际生命科学界誉为具有里程碑意义的创新之举。多能干细胞能够自我更新,能在体内外分化成几乎所有类型的细胞,在再生医学等方面有巨大的应用潜力,具有极高的理论研究价值。通常用来源于囊胚期胚胎的内细胞团的胚胎干细胞、通过核移植得到的胚胎干细胞以及在成体细胞中转入外源转录因子得到的iPSCs,进行体细胞重编程研究。在短短数年的时间里,此项研究已经在细胞重编程的机理研究、探索疾病的发生发展机制以及临床医学的应用等领域引发了很多突破性的进展；而且这一非克隆干细胞技术的诞生,成功地避开了长期以来争论不休的伦理问题,极大地推动该领域和相关科学领域的发展。与胚胎干细胞研究相比,体细胞重编程技术可以为更多的患者提供特异性多能干细胞。因而,在医学应用方面（例如器官培养和器官移植等）有广阔的前景。患者特异性的多能干细胞的建立能够为疾病发病机制的研究、治疗药物的筛选及细胞移植治疗提供有力的工具。采用慢病毒载体将外源性转录因子导入白内障患者晶体上皮细胞,从而获得诱导性多能干细胞。白内障患者来源的多能干细胞的建立,能够为晶体发育、细胞分化、衰老提供便利的细胞模型,同时可为白内障治疗药物的筛选及白内障发病机制的研究提供有力的研究工具。第一部分原代人晶体上皮细胞的体外培养目的对正常人晶体、年龄相关性白内障晶体上皮细胞及人皮肤成纤维细胞进行体外培养,并观察体外培养的晶体上皮细胞及皮肤成纤维细胞的生物学特性及组织学变化。方法正常人晶体上皮细胞培养取材于角膜移植术后供体眼的晶状体囊膜,年龄相关性白内障晶体上皮细胞培养取材于白内障超乳手术中撕除的晶体前囊膜。角膜移植术后供体眼的晶状体沿赤道部后方约2mm环形剪开后囊膜,小心取下完整的前囊膜和赤道部囊膜,剪成1mm×1mm大小的组织块,利用组织块贴片法,进行原代人晶状体上皮细胞的培养。白内障晶体前囊膜在超乳手术中完整取材、洗去粘弹剂之后剪成1mm×1mm大小的组织块,利用组织块贴片法进行培养。使用0.25%胰酶溶液对融合后的细胞进行消化传代。取年龄相关性白内障患者的皮肤组织,剪成1mm3大小的组织块,过夜消化,离心收集细胞,经多次传代后,获得较为纯化的皮肤成纤维细胞进行培养。在倒置相差显微镜下对三种细胞进行形态学观察。采用CCK-8法连续7天测定三种细胞的增殖速率,绘制生长曲线并进行比较。结果正常人晶体囊膜组织块贴壁48～72小时后可见人晶状体上皮细胞从组织块边缘长出,约10～15天达到融合。初期正常人晶体上皮细胞为多角形,胞体透亮,细胞边界清晰。融合后的细胞具有上皮细胞的形态特征,为典型的六角形或多边形。在体外细胞可传五代,但第三代以后细胞表型向成纤维细胞转化。第三代以后正常人晶体上皮细胞胞体呈梭形或长条形。第五代正常人晶体上皮细胞老化,胞浆内出现大小不等的空泡样改变,最后崩解死亡。白内障患者晶体上皮细胞形态与增殖能力与正常晶体上皮细胞相类似,但部分白内障晶体上皮细胞与正常人晶体上皮细胞形态差异较大,更接近成纤维细胞,且细胞在第一次传代后即老化崩解。人皮肤成纤维细胞伸展呈梭形或多边形,在经过多次培养传代后,可得到较为纯化的成纤维细胞。CCK-8法绘制的生长曲线表明人皮肤成纤维细胞具有最高的增殖速率,白内障患者的晶体上皮细胞增殖最慢。结论利用组织块贴片法进行人晶状体上皮细胞培养,操作简单,成功率高。第二代人晶状体上皮细胞是进行细胞学及相关研究比较理想的实验对象。正常人晶体上皮细胞具有较好的生长及增殖能力,而白内障晶体上皮细胞增殖力差、细胞形态不佳。人皮肤成纤维细胞在消化离心后经过多次传代能够获得纯化的成纤维细胞。人皮肤成纤维细胞增殖最快,正常人晶体上皮细胞增殖速率居中,白内障患者晶体上皮细胞增殖速率最慢。第二部分白内障患者诱导性多能干细胞的建立目的分别构建表达OCT-4、SOX-2和KLF-4的慢病毒载体（Lentivirus）,并转染年龄相关性白内障患者体外培养的晶体上皮细胞,诱导建立患者来源的诱导性多能干细胞,与同一患者来源的皮肤成纤维细胞对比,观察限定因子对于诱导多能干细胞的诱导效率。方法选择3例诊断为年龄相关性白内障的患者,取其晶体前囊膜及皮肤组织进行体外培养。白内障晶体前囊膜在超乳手术中完整取材、洗去粘弹剂之后剪成lmm×lmm大小的组织块,利用组织块贴片法进行培养。使用0.25%胰酶溶液对融合后的细胞进行消化传代。取上述3例年龄相关性白内障患者的皮肤组织,剪成Imm3大小的组织块,过夜消化,离心收集细胞,经传代后,获得较为纯化的皮肤成纤维细胞进行培养。分别将含有OCT-4、SOX-2和KLF-4的慢病毒载体质粒（plenti-hOCT4/plenti-hSOX2/plenti-hKLF4）同辅助质粒（pCMV-gag-pol-PA/pCMV-VSVg）一起共感染293T细胞,重组包装构建慢病毒载体（分别为Lenti-OCT-4/Lenti-SOX-2/Lenti-KLF-4）.将构建的三种慢病毒载体混合分别感染第2代的白内障晶体上皮细胞和人皮肤成纤维细胞,培养5天后,与小鼠胚胎成纤维细胞（mouse embryonic fibroblasts, MEFs）进行共培养,直至出现iPSCs。采用碱性磷酸酶（ilkaline phosphatase, AKP）染色比较白内障晶体上皮细胞和人皮肤成纤维细胞诱导生成iPSCs的效率差异。同时培养人H9胚胎干细胞（embryonic stem cells, ESCs）进行对照。结果利用组织块贴片法培养的白内障患者晶体上皮细胞及消化法培养的人皮肤成纤维细胞形态与增殖能力较好,第2代细胞适用于进行慢病毒感染。构建的慢病毒载体enti-OCT-4/Lenti-SOX-2/Lenti-KLF-4能高效转染两种细胞,并不影响细胞的状态及增殖能力。在慢病毒载体转染后第5天,将白内障晶体上皮细胞和人皮肤成纤维细胞分别与MEFs进行共培养,在转染后第12天开始出现与ESCs形态相似的细胞克隆。细胞克隆碱性磷酸酶（alkaline phosphatase, AKP）染色阳性,说明已成功诱导出iPSCs。采用AKP染色各比较3例患者的白内障晶体上皮细胞和人皮肤成纤维细胞诱导生成iPSCs的效率差异,在1×106的细胞接种密度下,白内障晶体上皮细胞平均可生成27.7个AKP阳性的细胞克隆,而人皮肤成纤维细胞平均仅生成15个细胞克隆。白内障晶体上皮细胞诱导形成的iPSCs细胞克隆与ESCs在细胞形态上具有相似性。结论构建的慢病毒载体Lenti-OCT-4/Lenti-SOX-2/Lenti-KLF-4能高效转染白内障晶体上皮细胞和人皮肤成纤维细胞,并成功诱导出与ESCs形态相似、AKP染色阳性的iPSCs,且白内障晶体上皮细胞与人皮肤成纤维细胞相比具有更高的iPSCs诱导效率。第三部分白内障患者诱导性多能干细胞的鉴定目的对诱导建立的白内障患者来源的诱导性多能干细胞（iPSCs）进行鉴定,检测细胞的分子标记及体内外分化能力,评价其多能性。方法对已成功诱导的白内障患者来源的iPSCs进行多能性鉴定：基因表达、免疫荧光染色分析、RT-PCR检测、体外分化拟胚体、体内分化畸胎瘤检测。提取iPSCs、ESCs和白内障患者晶体上皮细胞的总RNA采用HG-U133-2array （Affymetrix）对三种细胞的全基因表达谱进行检测并进行对比。提取iPSCs、 ESCs和白内障患者晶体上皮细胞的总RNA, RT-PCR检测人ESCs标志性基因（Nanog、OCT-4、REX-1、SOX-2、VIMENTIN）表达。采用细胞免疫组化荧光（immunohistochemistry, ICH）检测人ESCs标志性抗原（SSEA-3、SSEA-4、Nanog、 TRA-60、TRA-81、OCT-4）的表达。将iPSCs悬浮培养观察拟胚体（embryoid body,EB）形成,并在培养基中添加特殊成分（BMP4, FBS, retinoic acid （RA））观察EB的体外分化。将iPSCs接种至裸鼠皮下,观察畸胎瘤形成及体内分化情况。结果基因表达谱的分析结果显示,iPSCs与ESCs（?）（?）基因表达谱极为相似,但与白内障患者晶体上皮细胞的基因表达谱有较大差异。我们选择了1例56岁的年龄相关性白内障患者的iPSCs,并随机选择其中4个细胞克隆（分别命名为iPS1、iPS2、iPS3、iPS4）进行检测。RT-PCR检测的结果显示,iPS1与ESCs的ESCs标志性基因Nanog、OCT-4、REX-1、SOX-2和VIMENTIN的表达最为相似,而其他3株克隆与ESCs存在一定的差异。对iPS1进行ICH检测显示,人ESCs标志性抗原（SSEA-3、SSEA-4、Nanog、TRA-60、TRA-81、OCT-4）在iPS1中明显表达。体外分化拟胚体的结果显示,EB的分化使得Nanog和OCT-4表达下调,培养基中分别添加BMP4、FBS、RA之后,外胚层标志性基因NACM、TH和GFAP/内胚层标志性基因amylase、SOX7和AFP/中胚层标志性基因PECAM、desmin和SCL在EB中的表达均出现了不同程度的上调表达。对EB细胞进行ICH检测结果显示,EB细胞表达中胚层标志物α-平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin,α-SMA）、外胚层标志物β-微管蛋白（tubulin beta1, Tuj-1）和内胚层标志物甲胎蛋白（α-fetoprotein, AFP）。体内分化畸胎瘤的结果显示,裸鼠注射iPSCsl个月左右可在裸鼠注射部位见肿块形成,2个月后摘除肿瘤进行组织切片检查,镜下可见三个胚层的组织细胞。结论研究诱导的iPSCs在基因表达谱、ICH、RT-PCR检测、体内外分化能力方面与ESCs极为相似,建立的iPSCs具有与ESCs相同的多向分化能力。第四部分白内障患者诱导性多能干细胞向晶体前体细胞的分化诱导目的探讨利用诱导因子三步法将白内障患者来源的多能干细胞诱导为晶体前体细胞的方法,评价分化细胞与晶体细胞的相似性。方法对已成功诱导的白内障患者晶体上皮细胞来源的iPSCs及ESCs进行三步法的分化诱导：在细胞培养基中添加（1）第0～5天100ng/ml Noggin;（2）第5～15天100ng/ml bFGF、20ng/ml BMP4和20ng/ml BMP7;（3）第15～30天100ng/ml FGF2和20ng/ml Wnt-3a.每5天提取iPSCs和ESCs的RNA, RT-PCR检测晶体细胞分化标志基因PAX6、SCX2、SIX3、CRYAB、CRYAA、BFSP1和MIP表达情况,并绘制变化曲线。采用ICH检测分化过程中晶体细胞分化标志PAX6、α晶体蛋白和β-晶体蛋白的表达。提取iPSCs、ESCs和人晶体的总蛋白,Western-blot法检测晶体细胞分化标志PAX6、α-晶体蛋白和β-晶体蛋白的表达水平并进行比较。取3例人晶状体,分别为22岁、44岁和65岁,提取总蛋白,并提取白内障患者晶体上皮细胞来源的iPSCs、人皮肤成纤维细胞来源的iPSCs及ESCs的总蛋白,Western-blot法检测间隙连接蛋白43（connexin43）和纤维连接蛋白（fibronectin）,以评价其上皮-间质转化（epithelial mesenchymal transitions, EMT）的程度。结果经过三阶段诱导因子的作用后,对发生分化的iPSCs和ESCs进行的RT-PCR检测显示,PAX6、CRYAB、CRYAA、BFSP1和MIP的表达持续上升,SOX2的表达持续下降,SIX3的表达则是先上升后下降。ICH检测的结果显示分化过程中,iPSCs出现了晶体细胞分化标志PAX6、α-晶体蛋白和β-晶体蛋白的持续表达。Western-blot的结果显示,iPSCs、ESCs和人晶体中均有PAX6、α-晶体蛋白和β-晶体蛋白的表达,但ESCs的蛋白表达水平相对较低。EMT评价的结果显示,connexin43在22岁晶体中表达量最高,随着年龄的增加而明显降低,fibronectin则随着年龄的增加表达量逐渐增高；而在白内障患者晶体上皮细胞来源、人皮肤成纤维细胞的iPSCs及ESCs诱导分化的细胞中,connexin43在白内障患者来源的细胞中表达量最高,而fibronectin（?）勺表达相似。结论三阶段诱导因子的组合作用能够成功诱导出晶体前体细胞,且诱导分化的细胞能够稳定表达晶体细胞的标志性基因及蛋白。白内障患者晶体上皮细胞来源的iPSCs（?）比人皮肤成纤维细胞来源的iPSCs及ESCs具有更低的EMT程度。
刘冬梅[7]（2010）在《玻璃体切割术后并发性白内障发病机制的实验研究》文中认为目的：通过检测玻璃体切割术后前房氧浓度和炎性因子的变化、晶状体纤维细胞凋亡情况以、caspase-8和DLAD基因表达的变化以及硅油填充术后晶状体基因表达谱的变化,探讨玻璃体切割术后并发性白内障的可能发病机制。方法：分五部分进行研究,第一部分：建立兔眼玻璃体切割术后并发性白内障的动物模型,术后裂隙灯观察晶状体混浊程度并照相。第二部分：于术后1天、3天、7天、1月、3月抽取前房房水检测氧浓度和IL-2、TNF-a的变化；第三部分：于术后1天、3天、7天、1月、3月取兔眼晶状体,病理学观察晶状体纤维细胞形态、原位末端核苷标记（TUNEL）法检测其凋亡并计算凋亡指数（AI）、免疫组化法测定Caspase-8的表达。第四部分：采用半定量RT-PCR技术测定术后1天、3天、7天、1月、3月晶状体上DLAD基因的表达情况。第五部分：应用DNA芯片技术对硅油填充术后晶状体的基因表达谱进行差异表达谱分析,并采用实时定量PCR进行验证。结果：成功建立了玻璃体切割术后并发性白内障的动物模型；玻璃体切割术后前房氧含量和炎性因子IL-2、TNF-a有不同程度的增加；玻璃体切割术后晶状体纤维细胞凋亡增加,细胞内Caspase-8明显表达；玻璃体切割术后晶状体的DLAD基因随时间延长表达逐渐减弱；芯片结果表明硅油填充术后晶状体变化的基因主要有氧化应激、炎症反应、细胞凋亡、信号传导、细胞分化粘附等相关基因。实时定量PCR与芯片检测结果具有相同的方向性,且数据非常接近。结论：玻璃体切割术后晶状体周围微环境的变化导致了某些调控机制的破坏,使晶状体纤维细胞凋亡增加,而细胞器的降解减少,这种动态平衡的破坏,从而导致了白内障的发生。硅油填充术后并发性白内障的发生发展涉及多基因改变；实时定量PCR进一步验证了基因芯片的可靠性。
王柏川[8]（2008）在《激素性白内障发病机制的实验研究》文中研究指明长期应用糖皮质激素（GC）可以引起激素性白内障（GIC）,其特点表现为后囊下混浊（PSO）,在病因学上,激素性白内障后囊下混浊不同于一般的皮质性或核性白内障,有关GIC的发病机制并不清楚,涉及许多学说。代谢紊乱学说认为激素干扰了晶状体的物质代谢过程而形成白内障,但在激素作用下,即使是同一种酶活性的变化,各家报道都不一致,因此该学说缺乏可信的结论;渗透压学说认为激素抑制离子泵,导致晶状体电解质和水分失衡而发生GIC,但有研究发现激素并不能改变晶状体中离子水平,因此渗透压改变可能也不是GIC的形成机制;氧化损伤学说认为激素可以破坏晶状体内的抗氧化损伤机制,使晶状体蛋白的构象发生改变,不溶性蛋白增加,形成白内障,由于氧化损伤学说是普通白内障形成的一种主要机制,并不能解释为何GIC仅在后囊下发生混浊,因此氧化损伤因素可能只是一种伴随现象,不是GIC形成的主要机制;蛋白加合物学说曾被认为是GIC的形成机制,激素与晶状体蛋白形成加合物,导致晶状体蛋白的构象变化,巯基暴露并形成分子间二硫键,使得蛋白不溶性增加,白内障形成,不过非激素分子也可与晶状体蛋白结合,并且不发生晶状体混浊,该学说也缺乏说服力。上述各种学说都不能很好地解释GIC的形成机制,特别是不能阐明GIC的主要特征PSO,因此有人认为激素可能不是直接作用于晶状体而形成白内障的。GIC的重要特点是PSO,并发现后囊区有未分化的上皮细胞,而正常情况下,仅在前囊膜处才有上皮细胞,这提示上皮细胞的异常行为可能与GIC有关。在正常的晶状体中,前囊膜下的上皮细胞增殖、移行至赤道部后,发生分化,在失去细胞核及细胞器后成为纤维细胞,并向核区运动形成晶状体核。晶状体上皮细胞的增殖与分化受房水中各种细胞生长因子调控,如果房水中的细胞生长因子发生变化,可能会引起晶状体上皮细胞增殖和分化行为异常,并导致白内障形成。碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）是晶状体生长、发育的重要因子,也是调控晶状体细胞行为的重要因子。Jobling等认为GIC可能与晶状体的相关细胞生长因子变化有关,即激素可以影响细胞生长因子的合成与释放,他们推测,糖皮质激素可以降低房水中bFGF含量,增加房水中TGF-β含量,bFGF的主要作用是促进晶状体上皮细胞增殖并分化为晶状体纤维细胞,而TGF-β的主要作用是抑制晶状体上皮细胞的分化,当这些细胞生长因子发生上述变化时,前囊膜下的晶状体上皮细胞增殖、移行至赤道部后,由于分化受到抑制,不能正常分化为纤维细胞并向核区移动,而是继续增殖并向后极部移行,在后囊区堆积并形成后囊下白内障（PSC）。这种推测能较好地解释GIC的PSC形成机制,但缺乏实验支持。Jobling等的细胞异常分化学说有两个重要的假设,一是长期应用糖皮质激素后,房水中bFGF浓度降低,而TGF-β浓度增高,二是激素可以抑制晶状体上皮细胞分化为纤维细胞。我们通过动物实验与细胞培养实验,研究在地塞米松作用下,大鼠晶状体形态学的改变,大鼠房水中bFGF和TGF-β浓度的变化,晶状体上皮细胞中FGF受体和TGF-β受体表达的变化,以及晶状体上皮细胞中β-晶状体蛋白表达的变化,来证实细胞异常分化学说的观点。我们实验的主要结果与结论如下:1、大鼠眼局部长期应用地塞米松可以引起部分晶状体后囊混浊或后囊下出现上皮样细胞,表现为激素性白内障特点;2、晶状体后囊区出现的上皮样细胞来自赤道部增殖、移行的上皮细胞,其表型及转归不清楚;3、大鼠眼局部长期应用地塞米松并不影响房水中细胞生长因子（bFGF和TGFβ）含量,但可抑制细胞生长因子受体（FGFR和TGFβR）在转录及蛋白水平的表达;4、大鼠晶状体上皮原代培养细胞在地塞米松干预下,也表现为细胞生长因子受体（FGFR和TGFβR）在转录及蛋白水平表达的抑制;5、激素受体抑制剂可以阻断地塞米松对细胞生长因子受体表达的抑制,支持受体学说;6、地塞米松可促进大鼠晶状体上皮原代培养细胞增殖,并抑制其分化,这种抑制分化作用可被激素受体抑制剂阻断;7、FGF受体表达的下调可抑制晶状体上皮细胞向晶状体纤维细胞分化,使其继续增殖并向后囊区移行,我们认为FGF受体表达下调在LECs异常分化过程中可能起更重要的作用;8、TGF-β受体表达的下调可以保护增殖、移行过程中的晶状体上皮细胞,有助于未分化的晶状体上皮细胞堆积于晶状体后囊下,或者是晶状体上皮细胞在分化启动后不能完成分化过程,仍为有核细胞,并向后极部移行;9、地塞米松可导致晶状体上皮细胞异常分化,这种异常分化在激素性白内障后囊下混浊形成中可能起重要作用,即赤道部的晶状体上皮细胞不能正常分化为晶状体纤维细胞并向核区移动,而是继续增殖、移行至后囊区并堆积,形成后囊下混浊,支持细胞异常分化学说;10、地塞米松诱导晶状体上皮细胞异常分化不是通过减少细胞生长因子合成与释放途径,而是通过抑制细胞生长因子受体途径起作用的。
赵杰[9]（2008）在《Toll样受体信号通路在角膜烟曲霉菌感染中的作用》文中研究说明第一部分:Toll样受体2和4信号通路介导的人角膜上皮细胞对烟曲霉菌的炎性反应目的研究Toll样受体（Toll-like receptors,TLR）2和TLR4信号通路介导的人永生化角膜上皮细胞（THCE）对烟曲霉菌（Aspergillus fumigatus,AF）孢子、上清、菌丝体抗原的炎性反应。方法采用自制的烟曲霉菌孢子、上清和菌丝体抗原,刺激培养的THCE细胞。以Real-time PCR检测THCE细胞TLR2、TLR4 mRNA的表达;以Western blot检测THCE细胞TLR2、TLR4的表达及pIkB的活化;以酶联免疫吸附试验（ELISA）方法检测THCE细胞培养上清中IL-1β、IL-6、TNF-α和IL-8的浓度;用TLR2和/或TLR4中和抗体特异性封闭TLR2和/或TLR4,或用尾叶香茶菜丙素（kamebakaurin,KA）特异性抑制核转录因子（nuclear factor,NF）-kB活性,观察调节TLRs信号转导通路对角膜上皮细胞IL-1β、IL-6、TNF-α和IL-8表达的影响。结果①TLRs信号通路活化实验:正常THCE细胞有TLR2及TLR4 mRNA及蛋白质的表达。烟曲霉菌抗原以时间依赖方式促进THCE中TLR2、TLR4的表达及细胞因子的分泌。烟曲霉菌孢子刺激THCE细胞30min后TLR2及TLR4的表达开始增多,分别为对照组的2和2.75倍（P＜0.05）,刺激4h时达高峰,分别为对照组的23.5和27倍（P＜0.01）。上清抗原或菌丝抗原刺激THCE 2h后,TLR2、TLR4 mRNA表达较对照组升高,分别为对照组的35.5倍、33.5倍和9.75倍、18倍（P＜0.01）,刺激6h时达高峰,分别为对照组的53倍、58.5倍和29.75倍、57.5倍（P＜0.01）。烟曲霉菌孢子抗原刺激THCE细胞2h后IL-1β、IL-6、TNF-α和IL-8的表达开始增多,分别为对照组的1.33倍、2.1倍、1.2倍、1.3倍（P＜0.05）,刺激4h后达更多,分别为对照组的2.7倍、5.3倍、2.6倍、2.6倍（P＜0.01）。烟曲霉菌上清及菌丝刺激THCE细胞2h后IL-1β、IL-6、TNF-α和IL-8的表达开始增多,分别为对照组的1.4倍、2.2倍、1.3倍、1.3倍和1.3倍、2倍、1.2倍、1.2倍（P＜0.05）,刺激后6h达更多,分别为对照组的3.7倍、6.6倍、3.2倍、3.2倍和3.2倍、6.3倍、2倍、2.8倍（P＜0.01）。烟曲霉菌孢子、上清或菌丝抗原刺激THCE细胞12h后,细胞TLR2及TLR4表达增高（P＜0.01）,PIkB活化（P＜0.01）,其培养上清内IL-1β、IL-6、TNF-α和IL-8浓度升高（P＜0.01）,分别为未刺激组的3.6倍、7.3倍、4.1倍和4.5倍;4.2倍、7.4倍、4.1倍和4.5倍;3.3倍、7.3倍、3.9倍和4.4倍。②TLRs信号通路调节实验:在烟曲霉菌抗原刺激组,单纯封闭TLR2或TLR4可抑制pIkB的活性（P＜0.05）,联合封闭TLR2和TLR4可明显抑制pIkB-α的活性（P＜0.01）。烟曲霉菌孢子抗原刺激THCE细胞12h后,其培养上清内IL-1β、IL-6、TNF-α和IL-8浓度升高,分别为未刺激组的3.6倍、7.3倍、4.1倍和4.5倍;烟曲霉菌上清抗原刺激THCE细胞12h后,其培养上清内IL-1β、IL-6、TNF-α和IL-8浓度升高,分别为未刺激组的4.2倍、7.4倍、4.1倍和4.5倍;烟曲霉菌菌丝体抗原刺激THCE细胞12h后,其培养上清内IL-1β、IL-6、TNF-α和IL-8浓度升高,分别为未刺激组的3.3倍、7.3倍、3.9倍和4.4倍。在烟曲霉菌孢子抗原刺激组,联合封闭TLR2和TLR4受体后,IL-1β、IL-6、TNF-α和IL-8的分泌较刺激组分别减少了70.3%、85.8%、54.4%、57.4%;单纯封闭TLR2受体后,IL-1β、IL-6、TNF-α和IL-8的分泌较刺激组减少了63.1%、0.01%、29.3%、26.3%;单纯封闭TLR4受体,IL-1β、IL-6、TNF-α和IL-8的分泌较刺激组分别减少了48.3%、84.2%、28.3%、18.5%。在烟曲霉菌上清抗原刺激组,联合封闭TLR2和TLR4受体后,IL-1β、IL-6、TNF-α和IL-8的分泌较刺激组分别减少了74.3%、86.0%、53.7%、56.6%;单纯封闭TLR2受体后,IL-1β、IL-6、TNF-α和IL-8的分泌较刺激组减少了67.1%、0.01%、29.2%、25.4%;单纯封闭TLR4受体,IL-1β、IL-6、TNF-α和IL-8的分泌较刺激组分别减少了47.1%、84.6%、28.2%和22.7%。在烟曲霉菌菌丝抗原刺激组,联合封闭TLR2和TLR4受体后,IL-1β、IL-6、TNF-α和IL-8的分泌较刺激组分别减少了67.6%、86%、53.7%、57.5%;单纯封闭TLR2受体后,IL-1β、IL-6、TNF-α和IL-8的分泌较刺激组减少了58.3%、0.01%、26.8%、26.2%;单纯封闭TLR4受体,IL-1β、IL-6、TNF-α和IL-8的分泌较刺激组分别减少了51.7%、84.4%、25.3%、23.1%。在烟曲霉菌孢子、上清、菌丝抗原刺激组,阻断NF-κB后,IL-1β、IL-6、TNF-α和IL-8的分泌较刺激组分别减少了71.4%、86.2%、71.9%、74.4%,75%、86.3%、71.1%、74.1%,68.3%、86.2%、71.1%、74.5%。结论TLR2和TLR4参与了THCE对烟曲霉菌孢子、上清抗原及菌丝抗原的识别;并通过TLRs-NF-κB通路诱导下游炎性细胞因子的产生,介导角膜上皮细胞的炎性反应。第二部分:TLR2和TLR4在大鼠烟曲霉菌性角膜炎中的作用研究目的建立大鼠烟曲菌角膜炎动物模型,了解真菌性角膜炎病变角膜的病理特点,进一步研究TLR2和TLR4信号通路在此病理过程中的表达及作用机制。方法以基质注射法建立Wistar大鼠烟曲霉菌（1×108 CFU/角膜）角膜炎动物模型。于菌液接种后1、3、5、7、11天处死大鼠,裂隙灯观察角膜大体形态并进行临床评分;角膜组织真菌培养行烟曲霉菌菌落计数及感染真菌鉴定;髓过氧化物酶（myeloperoxidase,MPO）活力测定中性粒细胞活性;病理学检查检测角膜及真菌形态;Real-time PCR检测TLR2、TLR4 mRNA的表达;免疫荧光组织化学及Western blot检测TLR2、TLR4的表达;ELISA检测IL-1β和IL-10的表达。结果在Wistar大鼠可成功建立烟曲霉菌性角膜炎的动物模型。裂隙灯检查可见菌液接种后第1天角膜水肿;第5天角膜炎症最严重,可见角膜溃疡;第7、11天炎症反应开始减轻,可见角膜新生血管。角膜组织真菌培养鉴定为烟曲霉菌感染,菌落计数在菌液接种后第1天最多,随后逐渐减少。髓过氧化物酶活力在菌液接种后第1天开始增强,第5天活力最强,第7天开始逐渐减弱。病理结果示感染角膜组织水肿、坏死,基质纤维排列紊乱,并可查见菌丝及多形核细胞浸润。Real-time PCR、免疫荧光组织化学及Western blot结果示角膜TLR2和TLR4在感染后第1天表达开始增多,第5天表达最多,随后逐渐降低。ELISA示正常角膜有极微量的IL-1β和IL-10表达;角膜中IL-1β的表达在接种后第1天开始增多（为对照组的16.7倍）,持续升高到第5天达最多（为对照组的24倍）,第7天开始减少;而角膜中IL-10的表达在接种后第1天开始增多（为对照组的6.9倍）,呈持续性升高趋势,在第11天达最多（为对照组的31倍）。结论在大鼠角膜可成功的建立真菌性角膜炎的动物模型;角膜组织中功能性的TLR2和TLR4介导炎性细胞因子的表达,参与角膜对真菌的免疫反应及角膜炎的病理过程。第三部分:Toll样受体在真菌性角膜炎组织中的表达及其意义目的研究健康角膜组织及真菌性角膜炎角膜组织中Toll样受体（toll-likereceptors,TLRs）2和4及其介导的炎性细胞因子的表达及功能,为真菌性角膜炎发病机制研究提供理论依据。方法收集37例真菌性角膜炎标本及11例健康角膜标本,刮片及培养鉴定真菌的类型;病理学检查检测角膜及真菌形态;Real-time PCR检测TLR2、TLR4 mRNA的表达;Western blot及免疫荧光组织化学检测TLR2、TLR4蛋白质的表达;ELISA检测IL-1β和IL-10的表达。结果37例真菌性角膜炎患者中,平均病程为19.9天,10～12月份发病率高（54.1%）;男女性别之比为1.47:1,平均年龄42岁,其中农民占35例（94.6%）,21例（56.8%）患者可追溯到明确的眼部外伤史,如植物外伤史、铁丝划伤史、玻璃刺伤史等。37例标本均经临床检查与实验室诊断确认,角膜刮片镜检阳性率为91.9%,角膜标本真菌培养阳性率为62.2%,以镰刀菌、曲霉菌为主要致病菌。病理学检查示真菌性角膜炎病变角膜为广泛化脓性炎症,菌丝平行、斜行或垂直生长于胶原纤维之间。Real-time PCR检测结果示37例真菌性角膜炎标本中TLR2、TLR4 mRNA的表达均较11例健康角膜标本减少（P＜0.05）。Western blot及免疫荧光组织化学结果示健康人角膜组织表达TLR2和TLR4,真菌性角膜炎组织中TLR2、TLR4的表达水平较健康角膜标本降低。ELISA结果示真菌性角膜炎组织中IL-1β和IL-10的表达较健康角膜标本增加。结论镰刀菌和曲霉菌为真菌性角膜炎主要致病菌种。TLR2、TLR4及Th1/Th2型细胞因子在调节角膜真菌感染免疫和炎症程度方面可能发挥重要作用。
赵苒[10]（2006）在《移动通讯射频辐射对神经元基因表达谱及转录因子影响的研究》文中研究指明随着通讯事业的发展和移动通讯设备的普及,人群暴露于移动电话产生的射频电磁场（radiofrequency electromagnetic fields,RF EMF）（频率主要为800-2000MHz）的时间和强度也不断增加,随之引起的健康问题备受瞩目。已有研究显示,RF EMF可能对中枢神经系统（central nerve system,CNS）、免疫系统和血液系统等许多系统产生影响。其中,由于CNS对外界刺激的反应是最敏感的,加之移动电话使用时紧贴头部,因此,脑被认为是射频辐射作用的主要靶器官。相应地,很多研究将CNS对RF EMF作用的反应和各种功能变化作为机体功能调节受影响的早期指标。尽管有流行病学调查及动物实验报道,移动电话可以引起头痛、失眠、记忆力衰退等神经功能紊乱症状,导致血脑屏障通透性和脑电图改变,引起神经细胞损伤,甚至与脑部肿瘤的发生相关,但同时也存在一些阴性报道。鉴于目前射频研究领域中使用的辐照模式、细胞类型和检测指标多样,目前的研究结果缺乏可比性。另一方面RF EMF产生生物学效应的作用机制不明,导致无法确定专一的、与损害发生相关的暴露参数。所以,迄今为止尚未得出移动电话射
二、兔晶状体皮质吸出后FGF-R1mRNA在细胞增殖中的作用（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、兔晶状体皮质吸出后FGF-R1mRNA在细胞增殖中的作用（论文提纲范文）
（1）Hsp47在兔眼晶状体超声乳化术后囊膜组织中的表达特征（论文提纲范文）
| 中英缩略词对照表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（2）27nt-miRNA对eNOS表达/活性调节及NO生成、血管新生的影响及相关机制研究（论文提纲范文）
| 个人简历 |
| 中英文缩略词表 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 第一章 细胞的培养、高表达质粒的构建和提取以及细胞的转染 |
| 1 材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 第二章 27nt-miRNA对人脐静脉内皮 细胞eNOS基因的表达调节 |
| 1 材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 第三章 27nt-miRNA对人脐静脉内皮细胞eNOS活性及代谢产物NO生成的影响 |
| 1 材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 第四章 27nt-miRNA对人脐静脉内皮细胞增殖、54 侵袭、迁移及管腔形成的影响 |
| 1 材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文目录 |
（3）高氧及血管内皮生长因子对晶状体发育的影响（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 第一部分 高氧分压对晶状体组织发育的影响 |
| 1.1 前言 |
| 1.2 材料和方法 |
| 1.3 结果 |
| 1.4 讨论 |
| 第二部分 高氧分压对晶状体上皮细胞干细胞性变化 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 材料和方法 |
| 2.3 结果 |
| 2.4 讨论 |
| 第三部分 高氧条件下对晶状体上皮系胞增殖及凋亡的影响 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 材料和方法 |
| 3.3 结果 |
| 3.4 讨论 |
| 结论 |
| 附图 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 缩略语表 |
| 攻读学位期间发表的论文及科研成果 |
| 致谢 |
（5）Pax6基因转录本对HLE-B3细胞生物学功能调控的实验研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略语/符号说明 |
| 前言 |
| 研究现状、成果 |
| 研究目的、方法 |
| 一、后发障动物模型复制及Pax6基因转录本测定 |
| 1.1 对象和方法 |
| 1.1.1 材料 |
| 1.1.2 方法 |
| 1.2 结果 |
| 1.2.1 大鼠后发障模型 |
| 1.2.2 含大鼠Pax6转录本的质粒的构建及序列分析 |
| 1.2.3 术后大鼠后囊膜组织中Pax6两种转录本的表达测定 |
| 1.3 讨论 |
| 1.3.1 大鼠后发障模型的制备 |
| 1.3.2 后发障模型研究现状 |
| 1.3.3 后发障形成中Pax6基因的影响 |
| 1.3.4 术后大鼠后囊膜组织中Pax6两种转录本的表达分析 |
| 1.4 小结 |
| 二、敲减PAX6基因对细胞活力和增殖的影响 |
| 2.1 对象和方法 |
| 2.1.1 实验材料 |
| 2.1.2 实验方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 PAX6的两个转录本在细胞内的丰度 |
| 2.2.2 Real-time PCR表达丰度能满足检测实验要求 |
| 2.2.3 慢病毒的感染效率 |
| 2.2.4 慢病毒载体能够有效地敲减PAX6的表达 |
| 2.2.5 MTT法分析敲减PAX6后细胞活力下降 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 三、Pax6基因敲减后回复表达的研究 |
| 3.1 对象和方法 |
| 3.1.1 实验材料 |
| 3.1.2 实验方法 |
| 3.1.3 免疫印迹(Western blot)及显色 |
| 3.1.4 MTT法检测细胞活力及增殖情况 |
| 3.1.5 PI-FACS检测细胞周期 |
| 3.1.6 AnnexinⅤ单染法检测细胞凋亡 |
| 3.2 实验结果 |
| 3.2.1 构建Pax6的回复表达载体 |
| 3.2.2 制备回复表达Pax6的病毒颗粒 |
| 3.2.3 qRT-PCR确定Pax6敲减及回复表达效率 |
| 3.2.4 Pax6回复表达对细胞活力及增值能力的影响 |
| 3.2.5 Pax6回复表达对细胞周期的影响 |
| 3.2.6 Pax6回复表达对于凋亡的影响 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 四、全基因表达谱芯片对PAX6基因功能的分析 |
| 4.1 对象和方法 |
| 4.1.1 实验材料 |
| 4.1.2 实验方法 |
| 4.2 实验结果 |
| 4.2.1 细胞的感染和RNA抽提 |
| 4.2.2 实验的质控 |
| 4.2.3 杂交微阵列芯片扫描结果 |
| 4.2.4 芯片数据初步分析结果 |
| 4.2.5 Pathway和GO分析 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 小结 |
| 结论 |
| 论文创新点 |
| 参考文献 |
| 发表论文和参加科研情况说明 |
| 综述 PAX6基因在眼发育中的作用 |
| 综述参考文献 |
| 致谢 |
（6）白内障患者诱导性多能干细胞（iPS）的建立及其定向分化的研究（论文提纲范文）
| 中英文缩略词对照表 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一部分 原代人晶体上皮细胞的体外培养 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第二部分 白内障患者诱导性多能干细胞的建立 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第三部分 白内障患者诱导性多能干细胞的鉴定 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第四部分 白内障患者诱导性多能干细胞向晶体前体细胞的分化诱导 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 综述 诱导多能干细胞(iPS)在眼科的研究与应用进展 |
| 参考文献 |
| 在读期间论文发表情况 |
| 在读期间获奖情况 |
| 致谢 |
（7）玻璃体切割术后并发性白内障发病机制的实验研究（论文提纲范文）
| 提要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 第一部分 兔眼玻璃体切割术后并发性白内障动物模型的建立 |
| 实验目的 |
| 材料与方法 |
| 1 实验动物和分组 |
| 2 实验仪器和耗材 |
| 3 手术过程 |
| 3.1 手术前准备 |
| 3.2 手术步骤 |
| 4 术后观察 |
| 4.1 裂隙灯显微镜及眼底镜观察 |
| 4.2 眼压测定 |
| 5 统计学分析方法 |
| 结果 |
| 1 玻切术后眼压的改变 |
| 2 玻切术后晶状体透明度的改变 |
| 讨论 |
| 1 兔眼玻璃体切割术后并发性白内障模型的建立 |
| 1.1 BSS组模型的建立 |
| 1.2 C3F8组模型建立 |
| 1.3 硅油组模型的建立 |
| 2 兔眼玻璃体切割术后并发性白内障的发生原因分析 |
| 结语 |
| 参考文献 |
| 第二部分 兔眼玻璃体切割术后前房氧浓度和炎性因子的改变 |
| 实验目的 |
| 材料与方法 |
| 1 实验动物 |
| 2 主要仪器和试剂 |
| 3 实验方法 |
| 3.1 房水中氧浓度的检测 |
| 3.2 房水中炎性因子IL-2和TNF-α的检测 |
| 4 统计学方法 |
| 结果 |
| 1 玻切术后房水中氧浓度的改变 |
| 2 玻切术后房水中炎性因子的改变 |
| 讨论 |
| 1 玻璃体切割术后并发性白内障的发生与房水中氧浓度改变的相关性 |
| 2 玻璃体切割术后并发性白内障的发生与房水中炎性因子改变的相关性 |
| 结语 |
| 参考文献 |
| 第三部分 玻璃体切割术后兔晶状体纤维细胞凋亡及caspase-8的表达 |
| 实验目的 |
| 材料与方法 |
| 1 材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 实验仪器 |
| 1.3 实验试剂 |
| 2 动物模型建立与分组 |
| 2.1 动物分组 |
| 2.2 动物模型建立 |
| 3 实验方法 |
| 3.1 病理学观察晶状体纤维细胞形态 |
| 3.2 末端脱氧核苷酸转移酶(TDT)介导的原位末端转移酶标记TUNEL法检测晶状体纤维细胞凋亡 |
| 3.3 晶状体纤维细胞Caspase-8检测 |
| 4 统计学分析方法 |
| 结果 |
| 1 晶状体纤维细胞形态学观察 |
| 2 晶状体纤维细胞凋亡的检测 |
| 3 Caspase-8活性的检测 |
| 讨论 |
| 1 晶状体纤维细胞的结构 |
| 2 TUNEL法检测玻璃体切割术后晶状体纤维细胞凋亡的变化及意义 |
| 3 玻璃体切割术后晶状体纤维细胞Caspase-8的表达及意义 |
| 4 晶状体纤维细胞细胞凋亡与并发性白内障的关系 |
| 结语 |
| 参考文献 |
| 第四部分 DLAD基因在玻璃体切割术后晶状体上的表达 |
| 实验目的 |
| 材料与方法 |
| 1 动物模型的建立与材料 |
| 1.1 实验动物和分组 |
| 1.2 主要实验仪器 |
| 1.3 主要实验用试剂 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 组织材料的制备 |
| 2.2 半定量RT-PCR方法 |
| 3 统计方法 |
| 结果 |
| 1 A组DLAD mRNA的表达情况 |
| 2 B组DLAD mRNA的表达情况 |
| 3 C组DLAD mRNA的表达情况 |
| 4 术后1d、3d、7d、1m、3m,同一时间点三组DLAD mRNA表达的比较 |
| 讨论 |
| 结语 |
| 参考文献 |
| 第五部分 玻璃体切割联合硅油填充术后晶状体的基因表达谱的变化 |
| 实验目的 |
| 材料与方法 |
| 1 实验动物和分组 |
| 2 主要仪器与试剂 |
| 3 标本采集 |
| 4 基因芯片检测 |
| 4.1 晶状体组织总RNA样品制备步骤 |
| 4.2 准备标记反应 |
| 4.3 标记/扩增的RNA的纯化和标记cDNA的质量控制 |
| 4.4 杂交 |
| 4.5 芯片洗涤 |
| 4.6 结果扫描 |
| 4.7 数据提取 |
| 5 应用实时定量荧光PCR对基因芯片结果进行验证分析 |
| 5.1 组织RNA的抽提和质量检测同基因芯片检测中4.1步骤 |
| 5.2 使用样品的RNA进行cDNA合成 |
| 5.3 合成的cDNA用于实时定量PCR |
| 5.4 结果与计算 |
| 结果 |
| 1 四组晶状体RNA的提取结果 |
| 2 每组芯片杂交结果示意图 |
| 3 芯片杂交信号强度的散点图 |
| 4 差异表达基因及功能 |
| 4.1 玻璃体切割硅油填充术后3天差异表达的基因 |
| 4.2 玻璃体切割硅油填充术后1月差异表达的基因 |
| 4.3 术后3月差异表达的基因 |
| 5 共差异表达基因及功能 |
| 6 聚类分析结果 |
| 7 实时定量荧光PCR技术对芯片结果进行验证结果 |
| 7.1 内标AGPDH基因的溶解曲线、扩增曲线、标准曲线、及数据结果 |
| 7.2 BFSP2基因的溶解曲线、扩增曲线、标准曲线、及数据结果 |
| 7.3 CAPNS1基因的溶解曲线、扩增曲线、标准曲线、及数据结果 |
| 7.4 待测基因以内参校正 |
| 讨论 |
| 结语 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 附中英文对照表 |
| 科研课题 |
| 致谢 |
| 查新报告 |
| 发表论文 |
| 详细摘要 |
（8）激素性白内障发病机制的实验研究（论文提纲范文）
| 英文缩写及中英文对照表 |
| 英文摘要 |
| 中文摘要 |
| 论文正文 激素性白内障发病机制的实验研究 |
| 前言 |
| 第一部分 地塞米松对大鼠房水生长因子及晶状体上皮细胞生长因子受体表达的影响 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第二部分 地塞米松对大鼠晶状体上皮细胞增殖与分化的影响 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 全文总结 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 文献综述一 激素性白内障 |
| 参考文献 |
| 文献综述二 晶状体蛋白的翻译后修饰 |
| 参考文献 |
| 研究生期间发表的文章 |
| 英文论着 |
（9）Toll样受体信号通路在角膜烟曲霉菌感染中的作用（论文提纲范文）
| 中文目录 |
| 外文目录 |
| 符号说明 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 第一部分 Toll样受体2和4信号通路介导的人角膜上皮细胞对烟曲霉菌的炎性反应 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 TLR2和TLR4在大鼠烟曲霉菌性角膜炎中的作用研究 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 Toll样受体在真菌性角膜炎组织中的表达及其意义 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 文献综述 |
| 附录、附图 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
| 外文论文 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
（10）移动通讯射频辐射对神经元基因表达谱及转录因子影响的研究（论文提纲范文）
| 缩略语 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 第一部分：移动通讯射频辐射对神经元基因表达谱的影响 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第二部分：移动通讯射频辐射对神经元AP-1结合活性的影响 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 综述部分 |
| 综述一 |
| 综述二 |
| 就读期间发表论文 |
| 就读期间参与的科研项目 |
| 致谢 |
四、兔晶状体皮质吸出后FGF-R1mRNA在细胞增殖中的作用（论文参考文献）
- [1]Hsp47在兔眼晶状体超声乳化术后囊膜组织中的表达特征[D]. 令狐绍容. 遵义医科大学, 2020(12)
- [2]27nt-miRNA对eNOS表达/活性调节及NO生成、血管新生的影响及相关机制研究[D]. 罗雪兰. 广西医科大学, 2017(08)
- [3]高氧及血管内皮生长因子对晶状体发育的影响[D]. 龙潭. 武汉大学, 2013(08)
- [4]整合素β1在晶状体后囊混浊形成中的作用及其干预研究[J]. 张枫,毕馨月. 国际医药卫生导报, 2013(04)
- [5]Pax6基因转录本对HLE-B3细胞生物学功能调控的实验研究[D]. 李志清. 天津医科大学, 2012(08)
- [6]白内障患者诱导性多能干细胞（iPS）的建立及其定向分化的研究[D]. 邱晓頔. 复旦大学, 2012(04)
- [7]玻璃体切割术后并发性白内障发病机制的实验研究[D]. 刘冬梅. 山东中医药大学, 2010(07)
- [8]激素性白内障发病机制的实验研究[D]. 王柏川. 第三军医大学, 2008(03)
- [9]Toll样受体信号通路在角膜烟曲霉菌感染中的作用[D]. 赵杰. 山东大学, 2008(01)
- [10]移动通讯射频辐射对神经元基因表达谱及转录因子影响的研究[D]. 赵苒. 浙江大学, 2006(08)