一、Effect of the antibody of brain-derived neurotrophic factor on the rat with ischemic injury from obstruction of middle cerebral artery（论文文献综述）
其布日[1]（2021）在《额尔敦-乌日勒的活性成分分析及其对小胶质细胞基因调控作用的研究》文中进行了进一步梳理脑卒中是我国第一大死亡原因,是全球仅次于缺血性心脏病的第二大死亡原因。因此,研发新型抗脑卒中药物意义重大。额尔敦-乌日勒（EW）是蒙医治疗神经系统疾病的经典方剂,具有良好的神经保护作用,对脑卒中引起的半身不遂等症状疗效显着,因而得到广泛的临床应用。然而,EW化学成分复杂,作用机制不明确。因此,必需明确EW的生物活性成分,并阐明其神经保护作用机制。本论文中分析了EW的部分有效成分,并发现了EW对大脑中动脉阻塞/再灌注损伤（MCAO/R）模型大鼠脑内小胶质细胞的基因调控作用、极化作用以及从抗神经性炎症作用。【研究目的】（1）验证EW对MCAO/R模型大鼠病变部位组织内基因表达的调控作用,并分析EW中所含有的神经活性化合物;（2）确定EW在脑卒中恢复期间通过调节小胶质细胞极化来抑制神经炎症的主要化合物;（3）确定EW的分级分离组分中的关键抗炎分子及作用机理以及对神经细胞保护及突触生长的影响;（4）EW中关键活性分子的协同作用对小胶质细胞基因表达谱的影响。【研究方法】（1）建立大鼠MCAO/R模型,连续给药两周。第15天,提取大鼠大脑皮质病变区组织的总RNA,并进行转录组测序（RNA-seq）分析。筛选未处理组、MCAO模型组和EW给药组之间显着差异表达的基因,并分析各个基因的功能以及在缺血性脑卒中恢复过程中的可能作用。（2）根据文献报道收集EW药材中与神经相关的生物活性化学分子信息,采用Chem Draw软件画出结构式并建立数据库,命名为“EW神经活性化合物数据库”;其次,采用五种不同溶剂提取EW可溶解组分,并使用UPLC-QTof-MS分析其活性化合物。（3）以调控小鼠小胶质细胞（BV2细胞株）M1表型表达的细胞因子Cxcl10为筛选标准,利用RT-q PCR法对EW的5种溶剂提物进行快速筛选,选出了调控作用最为显着的提取物,通过两次HPLC半制备分离,得到优化的生物活性小分子组,并利用UPLC-QTof-MS鉴定了其生物活性分子。（4）采用UPLC-QTof-MS鉴定EW的分离组分（命名为F4-6）的关键抗炎分子;利用蛋白免疫印迹分析了F4-6对脂多糖（LPS）刺激的BV2小胶质细胞NF-κB信号通路相关蛋白水平的影响;以及分析F4-6处理的小胶质细胞培养液对神经元（N2a细胞）的增值和突触生长的影响。（5）利用RNA-seq分析讨论EW所含关键活性分子土木香内酯（Ala）和去氢二异丁香酚（Deh）单分子以及混合物对LPS刺激的BV2小胶质细胞基因表达谱（Gene expression pattern profile）的影响,并采用RT-q PCR法对RNA-seq结果进行了验证。【研究结果】（1）Bederson评分显示,给药14天后,EW给药组MCAO/R模型大鼠的评分从治疗前的2.07降至治疗后的0.21（P<0.01）,说明EW显着降低了神经系统损伤。与NT组相比,MCAO模型组大鼠大脑皮质区病变组织内有63个差异表达的基因;而与MCAO模型组相比,EW治疗后有186个差异表达的基因;其中生长因子（Igf1、Igf2和Tgfβ）和颗粒蛋白编码基因Grn等的表达在EW治疗后显着上调（P<0.05）;同时也检测到小胶质细胞标记物的表达大幅增强,以及补成分和分泌蛋白酶的表达。（2）五种不同溶剂提取的EW组分的UPLC-QTof-MS分析发现,在我们建库的11种蒙药的32个小分子化合物中,除决明子外其他10种蒙药（红花、肉豆蔻、甘草、草果、川楝子、栀子、土木香、木香、荜茇和黑种草等）中已报道的16个神经活性相关小分子化合物分别出现在五种溶剂提取物中。（3）快速筛选结果表明,EW石油醚提取物（命名为EW-5）对Cxcl10基因表达的抑制作用最强（P<0.05）。采用HPLC半制备法,对EW进行2次分级分离后最终得到12个组分。其中,组分F4-6对促炎细胞因子（Cxcl10、Tnfα、Il1β和Nos2）表达的抑制作用最显着（P<0.05）。通过UPLC-QTof-MS对F4-6进行了分析,共鉴定出20种化合物,其中包括木香烃内酯、肉豆蔻醚、土木香内酯和亚麻酸;这些小分子在LPS刺激的BV2细胞和小鼠原代小胶质细胞中,显着下调关键促炎细胞因子的表达。（4）土木香内酯（Ala）和去氢二异丁香酚（Deh）是F4-6的关键抗炎活性分子。F4-6、Ala和Deh均下调LPS刺激的小胶质细胞中Ccl2、Cox2和Il6等促炎基因的表达;同时上调Hmox1、Tgfβ、Igf1和Creb1等抗炎基因的表达。此外,F4-6处理的小胶质细胞条件培养液能显着促进N2a细胞的增殖,并可能通过上调Nefh和Dlg4来促进突起的生长。从机理上讲,F4-6显着降低了NF-κB p65蛋白的表达,同时抑制了p65的核转位,导致NF-κB启动的促炎基因转录受到抑制。（5）RNA-seq发现,Ala、Deh和Mix均下调促炎基因和上调抗氧化基因。Mix组的作用比Ala组和Deh组的作用更显着（P<0.05）,其作用不仅仅是简单的Ala和Deh作用的加和。【研究结论】综上所示,本论文首次利用RNA-seq技术,系统的分析了蒙药EW对MCAO/R模型大鼠脑卒中病变区周围细胞的基因表达的调控作用,发现EW显着改善缺血性脑卒中后神经损伤的恢复,并促使小胶质细胞从M1表型极化至M2表型;同时利用UPLC-QTof-MS系统的分析了EW中神经炎症及神经保护等相关的生物活性化合物,发现EW中多种活性化合物组分的协同作用可能是平衡小胶质细胞极化和缺血性脑卒中后的恢复,也验证了EW治疗白脉病（神经系统疾病）的传统功效,为进一步研究EW甚至其他传统药物的治疗机理提供了重要的证据。
胡冠宇[2]（2021）在《“治神调形”下头针对缺血性中风痉挛大鼠BDNF/TrkB/CREB及PI3K/Akt/GSK-3β通路影响的研究》文中认为目的:基于“治神调形”中医理论,探讨头针疗法通过对BDNF/TrkB/CREB信号通路和PI3K/Akt/GSK-3β信号通路的调节作用,促进对缺血性PSS大鼠受损脑组织细胞修复和细胞保护作用,进而改善缺血性PSS症状的生物学机制。方法:1.实验一:缺血性PSS大鼠模型的确立和验证采用文献检索和文献计量学统计的方式,通过对中国知网、万方数据知识服务平台、维普网以及Pubmed等主要中英文数据库进行检索,统计中风后肢体痉挛及相关疾病研究的动物实验中造模方法出现的频数,并根据实验中头针干预条件的情况确定恰当的缺血性PSS模型的造模方法。将60只Sprague Dawley大鼠（SD大鼠）随机分成空白组20只,假手术组20只,模型组20只。对模型组大鼠进行已确立的造模方案造模。造模后于1d、3d、7d、14d记录各组大鼠的死亡只数、痉挛发生只数、改良Ashworth（MAS）评分。2.实验二:缺血性PSS动物研究头针行针频率及时间验证将120只SD大鼠,分为空白组10只,假手术组10只,实验组100只,对实验组大鼠进行PSS模型建立。将造模成功大鼠随机平均分到模型组、头针A组（200r/min,3min）、头针B组（200r/min,1min）、头针C组（100r/min,3min）、头针D组（100r/min,1min）,给予相应的治疗7天,并于第7d观察记录Zealonga评分、改良Ashworth评分。3.实验三:头针对缺血性PSS大鼠行为学改变的影响以缺血性PSS模型大鼠为研究对象,将60只SD大鼠随机分成假手术组20只,实验组40只。对实验组大鼠进行缺血性PSS模型建立。将造模成功大鼠随机分到模型组和头针组,给予相应的治疗7天,并每2日观察记录Zealonga评分、改良Ashworth评分、平衡木行走实验评分等动物行为学数据。4.实验四:头针对缺血性PSS大鼠脑组织恢复的影响7d后对大鼠脑皮质组织进行取材,采用2,3,5—氯化三苯基四氮唑（TTC）染色的方法观察缺血性PSS大鼠脑梗死灶体积变化,采用HE染色和尼氏染色观察缺血损伤病变部位的病理改变及神经元细胞和尼氏小体的变化,采用FITC-葡聚糖脑血管灌注的方法观察脑组织血管状态变化。5.实验五:头针对缺血性PSS大鼠BDNF/TrkB/CREB信号通路的影响对缺血性PSS大鼠损伤的脑皮质运动区组织采用Western Blotting、PCR检测脑皮质中的BDNF、TrkB、CREB、p-CREB的蛋白表达及其mRNA的表达。6.实验六:头针对缺血性PSS大鼠PI3K/Akt/GSK-3β信号通路的影响对缺血性PSS大鼠损伤的脑皮质运动区组织采用Western Blotting、PCR检测脑皮质中的PI3K、Akt、p-Akt、GSK-3β、p-GSK-3β的蛋白表达及其mRNA的表达。结果:1.实验一:缺血性PSS大鼠模型验证文献检索结果显示,相关动物实验研究论文发表数量为25例,其中中文18篇、英文7篇。所出现的造模方法主要包括:线栓法MCAO（包括再灌注）、线栓MCAO+内囊注射NMDA法、光栓法三种。其中线栓法MCAO在卒中后肢体痉挛动物研究中应用概率最大（60%）,其次为线栓MCAO+内囊注射NMDA法（32%）,最后为光栓法（8%）。并且考虑后两者均会造成颅损,因此初步确定线栓法永久性大脑中动脉闭塞（MCAO）为造模方法。对模型组大鼠进行线栓法MCAO造模,造模后,模型组存活15只,造模过程中死亡5只。空白组与假手术组大鼠14d内均无死亡、痉挛状态出现,且MAS评级为0级。与空白对照组,1d时模型组大鼠死亡1例,痉挛状态出现3例,MAS评分平均水平无显着性差异（P>0.05）;3d时模型组大鼠死亡3例,痉挛状态出现8例,MAS评分平均水平有显着性差异（P<0.05）;7d时模型组大鼠死亡4例,痉挛状态出现10例,MAS评分平均水平有显着性差异（P<0.05）;14d时模型组大鼠死亡7例,痉挛状态出现6例,MAS评分平均水平无显着性差异（P>0.05）。因此线栓法MCAO可以作为本研究中的动物造模方法。2.实验二:缺血性PSS动物研究中头针行针频率及时间验证头针干预7d时,头针B组相较头针A、C、D组Zealonga评分与改良Ashworth评分均有显着性降低（P<0.05）,与1d组相比,头针B组7d后Zealonga评分与改良Ashworth评分显着性（P>0.05）。因此最终选择200r/min,1min为头针的行针方案。3.实验三:头针对缺血性PSS大鼠行为学影响与假手术组比较,模型组大鼠Zealonga评分上升,平衡木行走评分下降,说明运动神经功能下降,改良Ashworth评分上升,说明肢体痉挛程度上升（P<0.05）;与模型组比较,头针组大鼠Zealonga评分下降,平衡木行走评分上升,说明经头针治疗后运动神经功能提升,改良Ashworth评分下降,说明肢体痉挛程度减小（P<0.05）。4.实验四:头针对缺血性PSS大鼠脑组织形态学影响对比假手术组,模型组缺血性PSS模型大鼠脑组织缺血性梗死灶占比显着性增高（P<0.05）,有明显液化性坏死区域,细胞数量减少,神经元细胞数量减少且排列不规整。与模型组比较,头针组缺血性PSS模型大鼠脑组织缺血性梗死灶占比显着性减小（P<0.05）,无明显病理改变,细胞数量增多,神经元数量及形态正常。5.实验五:头针对缺血性PSS大鼠BDNF/TrkB/CREB信号通路的影响模型组相较假手术组大鼠患侧脑皮质运动区组织中BDNF、TrkB、CREB、p-CREB蛋白表达下降（P<0.05）,BDNF、TrkB、CREB mRNA的表达下降（P<0.05）;与模型组比较,头针组大鼠BDNF、TrkB、CREB、p-CREB蛋白表达及BDNF、TrkB、CREB相关mRNA的表达上升（P<0.05）。6.实验六:头针对缺血性PSS大鼠BDNF/TrkB/CREB信号通路的影响模型组相较于假手术组大鼠患侧脑皮质运动区组织中PI3K、Akt、p-Akt、p-GSK-3β表达降低（P<0.05）,GSK-3β表达增高（P<0.05）,PI3K、Akt mRNA的表达下降（P<0.05）;与模型组比较,头针组大鼠PI3K、Akt、p-Akt、p-GSK-3β表达升高（P<0.05）,GSK-3β表达降低（P<0.05）,PI3K、Akt mRNA的表达升高（P<0.05）。结论:本研究基于“BDNF/TrkB/CREB信号通路及PI3K/Akt/GSK-3β信号通路对脑组织中神经、血管等组织细胞的修复与保护作用,促进损伤的神经与血管网络的改善,进而改善缺血性PSS大鼠的痉挛状态,起到所提出中医康复理论中的‘治神调形’作用”的科学假说,从动物行为学观察、组织病理学、分子生物学三个方面进行分析,得到结论如下:1.从动物行为学的角度说明了头针具有改善PSS模型大鼠神经功能、肌痉挛程度、运动功能的效用,证明了头针疗法通过调节头部治疗区具有“调形”的治疗作用。2.从组织学层面说明了头针能有效减小缺血性PSS模型大鼠缺血梗死灶的体积,改善脑组织病理状态,促进上运动神经元细胞形态和数量上的恢复,以及脑血管状态的恢复。结合行为学研究结果证明了头针能通过对病机中提出的“脑损”的治疗,能起到“调形”,也就是促进行为学改善的功效。3.从分子生物学层面证明了头针能有效提高BDNF、TrkB、CREB等蛋白的表达,上调BDNF/TrkB/CREB信号通路,从而促进BNDF自分泌的良性循环,进而促进BDNF对脑组织细胞的修复作用和细胞保护作用,结合行为学和病理组织学的结论,头针对这一信号通路的影响证明了头针“治神”能改善“髓虚”,进而起到“调形”的功效。4.证明了头针能激活PI3K/Akt/GSK-3β信号通路,并可能通过激活该信号通路促进GSK-3β的磷酸化,抑制GSK-3β的促凋亡作用,从而对脑组织细胞起到保护作用,结合上述实验结论,头针可能通过上调BDNF与TrkB的表达,进一步激活的下游PI3K/Akt/GSK-3β信号通路,起到了对“脑损”组织的治疗作用,即“治神”,进而促进了行为学的恢复,即“调形”,从这一角度阐释了“治神”与“调形”的关系。
李志雄[3]（2021）在《舒血宁注射液在缺血性脑卒中预后的药效评价及作用机制研究》文中认为目的:缺血性脑卒中是脑卒中的主要类型,可分为急性期、亚急性期和恢复期等阶段,严重危害人类生命健康。目前临床上主要通过重组组织型纤溶酶原激活物（rt PA）静脉溶栓或者血管内血栓切除术治疗缺血性卒中,但二者具有诸如出血性转化、治疗时间窗口狭窄、再灌注损伤、致残率高等缺点。亟需开发出一种更有效的广泛适用于脑卒中不同分期的防治方法。银杏叶是一种历史悠久的中草药,广泛应用于心脑血管疾病防治。所以,本研究在我们实验室前期卒中急性期研究基础上,构建了卒中预后模型,并探讨银杏叶提取物制剂——舒血宁注射液（SXNI）在该动物模型上的药效作用及其关键药理学机制。最后在体外实验上使用海马神经元细胞株HT-22进行氧糖剥夺/复氧（OGD/R）以模拟体内的疾病发生发展过程,让实验结果更可靠。本研究有望为SXNI的临床应用和处方优化提供理论依据。方法:1.利用大脑中动脉闭塞（MCAO）方法构建脑卒中预后模型,即缺血30分钟后实现血流再灌注,造成缺血/再灌注损伤（CIRI）。CIRI鼠被随机分为模型组（Model）、阳性药米诺环素组（Minocycline）和SXNI治疗组,同时设置假手术组（Sham）。再灌注即时起,每天腹腔注射一次药物或生理盐水,持续到第28天。通过脑水肿情况、血脑屏障渗漏、脑梗死体积、水迷宫、避暗实验、神经功能缺损评分、自动步态分析来评价SXNI的药效作用。2.选取SXNI组和Model组小鼠的脑组织进行转录组测序（RNA-seq）,以获取差异表达基因（DEGs）,将log2Fold Change≥1和P≤0.05的DEGs进行Ingenuity Pathway Analysis（IPA）核心分析,以得到SXNI对卒中预后作用的关键机制和关键靶标。通过实时逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）、苏木精伊红（H&E）与尼氏（NISSL）染色、免疫印迹法（WB）、酶联免疫吸附测定（ELISA）、免疫荧光（IF）对IPA的结果进行实验验证。3.在体外,先鉴定购买的HT-22细胞,然后通过CCK8测定该细胞的半数抑制浓度(IC50)。对HT-22细胞进行氧糖剥夺4小时,复氧不同时间（12、24、36和48小时）,以选定合适的可用于模拟体内CIRI后脑卒中预后的时间点。对选中的OGD/R时间点,在复氧时加入SXNI,用免疫细胞化学方法（ICC）检测关键靶蛋白的表达。同时,对细胞的凋亡情况及其相关因子的m RNA和蛋白表达水平进行了探究。结果:1.在卒中后第7天的检测发现Model组小鼠具有显着的脑梗死、脑水肿和血脑屏障渗漏,第28天患侧发生明显的脑萎缩,而Minocycline和SXNI给药能显着改善这些组织损伤。随即连续4周的记录发现,Minocycline和SXNI能在不同时间点不同程度地改善CIRI小鼠的被迫游泳和躲避暗室的潜伏期或犯错次数,而且能够减轻神经功能缺损严重程度和支撑距离、平均压力、爪印面积、步幅长度等步态损伤程度。2.在对Model和SXNI组小鼠脑组织的转录组测序中,得到了565个变化倍数对数≥1,P值≤0.05的DEGs,包含221个上调和344个下调的基因。对这565个DEGs进行IPA核心分析,得到排名前20的信号通路,其中与脑部疾病最相关的是第3条神经营养蛋白-肌球蛋白受体激酶（Neurotrophin/Trk Signaling）通路。同理在排名前20的生物学功能中,排名第5的是神经系统疾病（Neurological Disease）。对与Neurotrophin/Trk Signaling和Neurological Disease密切相关的DEGs进行IPA的蛋白-蛋白互作（PPI）分析交叠得到15个关键基因。它们分别是Bdnf、Mapk1（Erk）、Map2k3（Mek3）、C-fos、Creb1、Map2k7、Map3k5、Mapk8（Jnk1）、Ngfr p75、Ntf4、Ntrk1、Ntrk2（Trk B）、Pik3r1、Spry2、Akt1。RT-PCR结果证实了3 m L/kg的SXNI可以显着提高脑组织中Bdnf、Mapk1、Mek3、Creb1、Ntrk1、Trk B、Shh和Vegfa的m RNA表达水平,而降低C-fos、Map2k7、Jnk1、Pik3r1、Csf3和Gfap的m RNA表达水平。H&E和NISSL染色发现SXNI可以改善海马CA3区损伤和神经元细胞凋亡。WB结果表明SXNI可以显着提高卒中后BDNF、Trk B和Mek3的蛋白表达,而降低Jnk1蛋白表达。ELISA结果表明SXNI可以显着提高卒中后Creb和p-Erk蛋白水平的表达。IF结果表明SXNI可以显着提高BDNF和Trk B蛋白在海马CA3区的表达水平。3.使用神经元细胞的标记蛋白Tuj1和NeuN对HT-22进行的免疫荧光染色发现该细胞株100%表达这两个标记蛋白,表明该株神经元细胞较纯。CCK8实验发现SXNI对HT-22的IC50=496.3μg/m L,50μg/m L和200μg/m L被选为HT-22细胞的给药浓度。通过核计数方式发现氧糖剥夺4小时,复氧24小时和36小时对细胞的损伤程度适中,为了更好地与体内的卒中长期的预后对应,最终选择OGD/R 4h/36h进行后续研究。在对Neurotrophin/Trk Signaling通路中最关键的一对配体蛋白BDNF和Trk B的免疫荧光共染中发现,OGD/R组HT-22细胞的BDNF和Trk B蛋白表达显着降低,虽然50μg/m L的SXNI不能显着提高BDNF的表达,但200μg/m L的SXNI却能起到显着上调该蛋白的作用。在Trk B上,与OGD/R组相比,50μg/m L和200μg/m L的SXNI都能显着提高Trk B蛋白的表达。200μg/m L的SXNI可以调节OGD/R后的凋亡分子Bax/Bcl-2和Caspase-3的表达。结论:1.在卒中后第7天,舒血宁注射液可以有效改善脑梗死体积、脑水肿和血脑屏障渗漏。在卒中后第28天,舒血宁注射液可以减少脑萎缩体积、减轻认知功能障碍和运动缺陷。2.揭示并验证了BDNF介导的神经营养蛋白-肌球蛋白受体激酶通路是舒血宁注射液促进卒中后小鼠认知功能障碍和运动缺陷恢复的关键信号通路。
马岱朝[4]（2021）在《丹参多酚酸通过小胶质细胞P2X7/NLRP3/GSDMD通路减轻实验性脑缺血再灌注损伤研究》文中研究指明目的:大量研究表明丹参多酚酸可以改善缺血性脑卒中的预后结局,并通过多种药理作用及机制发挥神经保护作用,但其潜在的作用机制有待进一步阐明。小胶质细胞参与脑梗死后的炎症反应,而小胶质细胞中由NLRP3炎症小体及其上游的P2X7受体和下游的GSDMD分子构成的P2X7/NLRP3/GSDMD通路介导脑梗死后的炎症级联反应。本研究建立大鼠大脑中动脉闭塞/再通（MCAO/R）模型和大鼠原代神经元与原代小胶质细胞共培养缺氧缺糖/复氧复糖（OGD/R）模型,通过观察丹参多酚酸的注射剂型注射用丹参多酚酸盐（SAFI）对MCAO/R模型神经功能评分、梗死体积、神经元凋亡、炎症因子表达及OGD/R模型中神经元细胞活力与凋亡的影响,并且观察SAFI对MCAO/R模型脑皮质及OGD/R模型中小胶质细胞中P2X7/NLRP3/GSDMD通路中相关分子的表达的影响,旨在探讨SAFI通过抑制小胶质细胞P2X7/NLRP3/GSDMD通路对实验性脑缺血再灌注（I/R）损伤的神经保护作用及分子机制。材料与方法:1.SAFI对MCAO/R模型大鼠神经保护作用（1）将58只SD大鼠随机分为2部分,第一部分大鼠随机分2组:I/R组（MCAO/R+生理盐水）,I/R+SAFI组（MCAO/R+SAFI）,于术后第1至第7天每天进行一次神经功能评分,于术后第7天获取脑组织测量梗死体积。实验第二部分动物随机分为四组:Control组（假手术+生理盐水）,SAFI组（假手术+SAFI）,I/R组（MCAO/R+生理盐水）,I/R+SAFI组（MCAO/R+SAFI）,该部分大鼠3天后取脑用于组织学（HE、免疫组化、TUNEL、荧光染色）检测及RT-PCR及western blot检测。（2）使用尼龙线由颈外动脉插入至大脑中动脉（MCA）阻断MCA血供引起供血区域缺血损伤,封堵120分钟后拔出尼龙线恢复血流,建立MCAO/R模型。通过观察MCAO/R模型大鼠梗死体积、神经功能评分、HE染色组织病理,免疫组织化学检测炎症因子表达、TUNEL检测神经细胞凋亡情况,评估SAFI对大鼠缺血再灌注损伤的神经保护作用。2.SAFI对经OGD/R处理的神经元细胞活力与凋亡影响的研究（1）取新生SD乳鼠分离提取原代神经元细胞及原代小胶质细胞,免疫荧光检测神经元标记物MAP2的表达鉴定神经元,免疫荧光检测小胶质细胞标记物CD11-b的表达鉴定小胶质细胞。MTT法检测不同浓度SAFI对OGD处理的大鼠原代神经元细胞和原代小胶质细胞的细胞活性筛选SAFI最佳药物浓度。（2）根据细胞类型,分为单纯神经元培养组与小胶质细胞+神经元共培养组。单纯神经元培养组分为三个亚组:Neuron组（神经元正常条件下培养）,Neuron+OGD/R组（神经元行OGD/R处理）,Neuron+OGD/R+SAFI组(神经元行OGD/R及SAFI处理。处理方法:在Neuron+OGD/R+SAFI组,将原代神经元接种于培养板中,给予SAFI预处理24 h,将培养换至无葡萄糖的DMEM于95%N2+5%CO2环境中（培养液含同浓度SAFI）培养3h,接着将细胞于正常培养条件下继续培养24h后收集细胞用于检测;Neuron+OGD/R组不加SAFI,培养条件同前;Neuron组不加SAFI于正常培养条件下培养。小胶质细胞+神经元共培养组分为三个亚组:Neuron+Microglia组（神经元与小胶质细胞正常条件下共培养）,Neuron+Microglia+OGD/R组（神经元与小胶质细胞共培养并行OGD/R处理）,Neuron+Microglia+OGD/R+SAFI组（神经元与小胶质细胞共培养并行OGD/R及SAFI处理）。处理方法:在Neuron+Microglia+OGD/R+SAFI组,将原代小胶质细胞和原代神经元细胞利用Transwell共培养体系培养。神经元细胞接种于下室,小胶质细胞接种于上室,用SAFI于正常培养条件下预处理24 h后,将细胞换至无葡萄糖的DMEM（含相同浓度的SAFI）于95%N2及5%CO2环境中,37℃培养3 h构建OGD模型,于正常培养条件下继续培养24 h后,收集神经元细胞及培养基用于检测;Neuron+Microglia+OGD/R组不加SAFI,培养条件同前;Neuron+Microglia组不加SAFI于正常培养条件下培养。（3）经OGD/R处理细胞,通过检测培养基中LDH水平反映细胞受损程度,通过CCK-8法检测各组神经元细胞的活力,采用流式细胞术检测神经元细胞的凋亡等方法,来观察SAFI对单纯培养及与小胶质细胞共培养的神经元的保护作用。3.SAFI对MCAO/R模型及OGD/R模型小胶质细胞NLRP3炎症小体激活与焦亡相关蛋白GSDMD影响的研究（1）动物造模及分组同上。将共培养细胞分为4组:分别为Control组（神经元与小胶质细胞正常条件下共培养）,SAFI组（神经元与小胶质细胞正常条件下共培养并加入SAFI）,OGD/R组（神经元与小胶质细胞共培养并行OGD/R处理）,OGD/R+SAFI组（神经元与小胶质细胞共培养并行OGD/R处理且加入SAFI干预）。（2）将体外培养的原代小胶质细胞和体外培养的大鼠原代神经元细胞利用Transwell共培养体系培养,神经元细胞种于下室,小胶质细胞接种于上室,用50ug/ml浓度的SAFI于正常培养条件下预处理24 h,后将细胞换至无葡萄糖的DMEM（含相同浓度的SAFI）于95%N2+5%CO2环境中,37℃培养3 h构建OGD模型,于正常培养条件下继续培养24 h后收集神小胶质细胞。OGD/R组不加SAFI,培养条件同前。SAFI组加SAFI于正常培养条件下培养。Control组不加SAFI于正常培养条件下培养。（3）构建MCAO/R模型及小胶质细胞OGD/R模型后,采用免疫荧光法观察皮质小胶质细胞NLRP3的表达情况,采用western blot法检测脑组织中及培养的小胶质细胞中NLRP3炎症小体激活与焦亡相关蛋白GSDMD表达及裂解的水平,采用RT-PCR检测脑组织中及培养的小胶质细胞中NLRP3炎症小体相关的m RNA表达和GSDMD的m RNA表达水平。（4）采用尼日利亚菌素和尿酸单钠作NLRP3炎症小体激活剂,在培养小胶质细胞后加入脂多糖激惹细胞,用PBS洗脱脂多糖后以SAFI处理细胞,然后以尼日利亚菌素或尿酸单钠在无血清培养基中处理细胞,然后裂解细胞后进行western blot检测。4.SAFI对MCAO/R模型及OGD/R模型NLRP3炎症小体激活上游的膜离子通道P2X7表达的影响及SAFI组分与P2X7的分子对接（1）MCAO/R造模及OGD/R模型制备及分组同上。（2）采用RT-PCR、Western blot及免疫荧光方法,观察SAFI对大鼠MCAO/R脑皮质及OGD/R模型中与神经元共培养的小胶质细胞中P2X7表达的影响。（3）采用计算机分子对接方法,从RCSB数据库下载大鼠P2X7的X-ray晶体三维结构文件,通过文献报道获取该蛋白与ATP通过氢键与离子相互作用结合口袋的主要氨基酸残基,运用Discovery Studio4.2软件对蛋白质删除配体处理,利用Auto Dock 4.2.6软件进行加氢、计算电荷、转化格式等处理。从TCMSP数据库、ZINC数据库、Pub Chem数据库获取SAFI主要成分的分子结构。利用Auto Dock软件进行半柔性对接。采用Discovery Studio4.2软件对对接结果进行可视化分析,观察SAFI的主要成分丹酚酸B、丹酚酸D、丹酚酸Y、紫草酸及迷迭香酸与P2X7结合的能力。结果:1.SAFI可改善大鼠脑MCAO/R模型神经功能缺损并减小脑梗死体积,并可减轻MCAO/R模型脑组织病理损伤。2.SAFI可减少大鼠脑MCAO/R模型脑皮质炎症因子ICAM-1、IL-1β、IL-18、TNF-α的表达水平,并减少MCAO/R模型皮质神经细胞凋亡。3.SAFI对OGD/R处理的单纯培养及与小胶质细胞共培养神经元的细胞损伤有减轻作用,并可改善细胞活力,且能降低凋亡率。4.在共培养条件下经OGD/R处理,小胶质细胞对神经元有细胞毒性作用,而SAFI可能具有减轻小胶质细胞对神经元的细胞毒性的作用。5.SAFI可以降低大鼠脑I/R损伤后小胶质细胞中NLRP3表达,并可抑制脑I/R损伤后IL-1β及IL-18等促炎性因子的表达。6.SAFI可抑制脑I/R损伤后皮质及与神经元共培养并经OGD/R处理的小胶质细胞中NLRP3炎症小体的激活。7.SAFI可以抑制脑I/R损伤后脑皮质及与神经元共培养并经OGD/R处理的小胶质细胞的焦亡相关蛋白GSDMD的裂解。8.SAFI可以降低脑I/R损伤后皮质及OGD/R处理后的小胶质细胞中NLRP3、ASC、caspase1、IL-1βm RNA的表达水平。9.SAFI可降低MCAO/R模型大鼠脑皮质Iba1及P2X7双标阳性的小胶质细胞的数量,并可降低MCAO/R模型大鼠脑皮质及与神经元共培养并经OGD/R处理的小胶质细胞中P2X7蛋白及m RNA表达。10.SAFI中的丹酚酸D、丹酚酸Y、紫草酸等活性成分可能与P2X7受体具有较好的结合能力。结论:1.抑制炎症反应及减轻神经元凋亡是SAFI治疗缺血性脑卒中发挥神经保护作用的部分药理学基础,抑制炎症反应可能是体现SAFI活血化瘀功效的一个方面。2.SAFI对OGD/R处理的神经元具有直接的和可能通过拮抗小胶质细胞对神经细胞毒性而产生间接的神经保护作用。3.SAFI中的丹酚酸D、丹酚酸Y、紫草酸等活性成分可能有拮抗P2X7受体激活的作用。4.SFAI对脑缺血再灌注损伤具有神经保护作用,部分原因可能是SAFI可抑制小胶质细胞NLRP3炎症小体激活及细胞焦亡。5.SAFI可能通过小胶质细胞P2X7/NLRP3/GSDMD通路抑制NLRP3炎症的激活及细胞焦亡,缓解下游炎症级联瀑布扩大,从而对实验性脑缺血再灌注损伤发挥神经保护作用。
张琼帅[5]（2021）在《头穴丛刺治疗中风后肢体痉挛的临床观察及其抗痉挛效应机理研究》文中研究指明目的:本研究临床试验通过头穴丛刺治疗中风后肢体痉挛,评价头穴丛刺在改善患者肢体痉挛程度、运动功能及日常生活能力的影响。动物实验主要以头穴丛刺对大脑中动脉闭塞后肢体痉挛大鼠模型进行干预,探析头穴丛刺对抑制性神经递质GABA及其受体GABAA、GABAB的表达,及对BDNF/Trkb-KCC2信号通路的影响,探究头穴丛刺治疗中风后肢体痉挛的可能作用机制。方法:临床研究:将72例确诊为中风后肢体痉挛患者,按随机数字表法随机分为头针组和对照组,对照组仅采用单独运动疗法治疗,头针组在对照组运动疗法基础上在顶区和顶前区选取5条穴线加用丛刺治疗,每次留针6小时,两组患者均每日治疗1次,每周治疗5天,共治疗4周。干预4周后,使用改良Ashworth评分表（modified Ashworth scale,MAS）对两组患者肌张力分别进行评定,使用简化的Fugl-Meyer运动功能评定表（Fugl-Meyer motor assessment,FMA）对两组患者运动功能分别进行评价,通过改良巴氏指数（modified Barthel index,MBI）评价患者日常生活能力。在治疗前（-3～0天）、治疗后（第4周±3天）各评价一次。研究人员采用SPSS26.0统计分析软件,对研究所得结果数据进行处理分析。其中,所得计量资料数据以均数（（？））±标准差（s）的形式表示,各组组间进行比较采用独立样本t检验,而组内治疗前后结果对比则采用配对t检验;计数资料组间比较采用χ2检验;检验水准α=0.05。动物实验:将25只大鼠随机分为对照组5只,模型组10只和头针组10只。对照组常规喂养,不做任何处置,而对模型组和头针组大鼠采用大脑中动脉栓塞方法（MACO）进行脑缺血模型造模。头针组大鼠造模24h后对其采用头穴丛刺法在大鼠百会及左右侧各旁开2mm处针刺,快速捻转1min后留针2h,每日1次,共14d;模型组大鼠造模后正常饲养,每日给予头针组相同强度及时间的抓摸刺激;对照组每日仅给予同头针组相同强度及时间的抓摸刺激。造模24h后对各组大鼠采用Zealonga评分对其神经功能损伤情况进行评价,造模24h及干预14d后对各组大鼠分别采用Narrow ally test进行行为学评价,并采用BL-420S生物机能实验系统检测各组大鼠肌张力。干预14d后,采用TTC染色测定大鼠脑梗死体积。应用石蜡切片及免疫荧光双标测定大鼠梗死区脑皮质内GABA及其受体GABAA和GABAB的表达情况,采用免疫荧光法检测三组大鼠梗死部分脑皮质中Trkb及KCC2表达,采用Western Blot检测三组大鼠梗死区脑皮质中BDNF含量及Trkb含量表达。采用SPSS26.0软件进行统计学分析,采用Graphpad Prism9.0对统计结果进行描述。结果1.临床研究:临床研究结果显示:头穴丛刺结合运动疗法治疗中风后肢体痉挛可明显降低患者患侧上肢和下肢的痉挛程度,且疗效优于单独运用运动疗法（P<0.05）;经治疗两组患者Fugl-Meyer量表评分均明显提升,头针组与对照组相比无统计学差异,但头针组评分均值仍略高于对照组（P>0.05）;两组均可明显提升患者日常生活活动能力,且头穴丛刺联合运动疗法明显优于单独运用运动疗法（P<0.05）。2.动物实验:脑梗死模型造模成功24h后,应用Zealonga评分法对大鼠进行神经功能损伤评价。对照组未出现神经功能损伤情况,模型组与头针组相较于对照组均表现明显神经功能损伤情况（P<0.05）,而模型组与头针组则无明显差异（P>0.05）。造模24h后对大鼠进行Narrow ally test行为学测试结果显示:与对照组相比模型组与头针组大鼠站立向脑梗死侧转身几率明显增多（P<0.05）,而模型组与头针组两组间无明显差异（P>0.05）;干预治疗14天后,相较于对照组,模型组与头针组向脑梗死侧转身几率仍明显偏多（P<0.05）。与模型组相比,头穴丛刺治疗显着降低了Narrow ally test行为学评分。在大鼠造模24h及干预14d后三组进行肌张力检测结果显示:造模24h后,对照组大鼠肌张力未明显改变;与对照组相比模型组和头针组均出现肌张力明显增高（P<0.05）;经14d治疗后,对照组及模型组肌张力较治疗前均未明显改变,头针组治疗后较其治疗前及模型组治疗后肌张力均明显减低（P<0.05）。干预14d后,对大鼠脑组织切片并进行TTC染色后观察结果显示:对照组大鼠脑组织未出现梗死区域,与对照组相比,模型组和头针组可见明显梗死区域（P<0.05）。而头穴丛刺治疗后与模型组对比,头针组梗死体积显着降低（P<0.05）。干预14d后,免疫荧光检测各组大鼠脑皮质GABA、GABAA、GABAB中含量结果显示:与对照组比较,模型组大鼠缺血侧脑皮质中GABA表达明显减低（P<0.05）;与模型组比较,头针组大鼠缺血侧脑皮质中GABA表达有所提高（P<0.05）,但其表达水平显着低于对照组（P<0.05）。与对照组比较,模型组大鼠缺血侧脑皮质中GABAA表达明显减低（P<0.05）;与模型组比较,头针组大鼠缺血侧脑皮质中GABAA表达有所提高（P<0.05）,但其表达水平仍低于对照组（P<0.05）;与对照组比较,模型组大鼠缺血侧脑皮质中GABAB表达明显减低（P<0.05）;与模型组比较,头针组大鼠缺血侧脑皮质中GABAB表达有所提高（P<0.05）,但其水平同样低于对照组（P<0.05）。干预14d后,免疫荧光法检测各组大鼠脑皮质中KCC2及Trkb表达结果显示:与对照组相比,模型组大鼠损伤侧皮质中KCC2表达明显减低（P<0.05）,而头针组大鼠经头穴丛刺治疗后KCC2表达有所提升,与模型组相比具有统计学差异（P<0.05）;与对照组相比,模型组损伤侧皮质中Trkb表达明显减低（P<0.05）.而经头穴丛刺治疗,与模型组对比头针组Trkb表达进一步减低,头针组与模型组相比具有统计学差异（P<0.05）。干预14d后,采用Western Blot检测三组大鼠梗死区脑皮质中BDNF及Trkb含量,表达结果显示:与对照组相比,模型组大鼠损伤侧皮质中BDNF表达减低,头针组大鼠经治疗后与模型组相比BDNF表达明显上调（P<0.05）;与对照组相比模型组损伤侧皮质中Trkb表达明显减低（P<0.05）,经头穴丛刺治疗,与模型组对比头针组Trkb表达进一步减低,与模型组相比具有统计学差异（P<0.05）。结论:1.临床研究结果表明,头穴丛刺联合运动疗法治疗中风后肢体痉挛可明显减低患者患侧上肢及下肢的痉挛程度,可明显提升患者的运动功能及日常生活活动能力,表明头穴丛刺治疗中风后肢体痉挛具有临床有效性。2.头穴丛刺疗法干预缺血性脑卒中模型大鼠,可减小脑梗死体积,减低大鼠的痉挛程度,使大鼠行动能力得到提升,对损伤神经具有保护作用。3.头穴丛刺疗法干预缺血性脑卒中模型大鼠,可上调损伤侧皮质抑制性神经递质及其受体含量表达,减低痉挛程度。4.头穴丛刺疗法干预缺血性脑卒中模型大鼠,可调节损伤侧皮质BDNF/Trkb-KCC2信号通路表达,BDNF/Trkb-KCC2信号通路可能是头穴丛刺疗法降低大鼠痉挛状态的作用机制。结合临床与基础两方面研究结果可得出结论:头穴丛刺疗法对中风后肢体痉挛具有明确治疗作用,其作用机制可能与调整损伤侧脑组织内神经递质有关。头穴丛刺疗法基于中医学“形神合一”理论,依据“治神调形”法则,本研究为其治疗中风后肢体痉挛提供临床及实验证据。
刘洪雨[6]（2020）在《激活素A参与缺血性脑损伤小胶质细胞极化表型变化的研究》文中研究说明缺血性脑损伤具有复杂的病理生理过程,涉及多种损伤及修复机制。中枢神经系统中小胶质细胞对所处微环境、不同刺激信号产生差异应答,表现出不同的功能表型M1型、M2型,小胶质细胞这种极化行为在脑缺血损伤中发挥着“双刃剑”的作用,表型的极性可能加重损伤或促进修复。激活素A（activinA,Act A）作为转化生长因子-β（transforminggrowthfactor-β,TGF-β）超家族中成员之一,其受体和结合蛋白广泛分布于脑组织,缺血性脑损伤可引起Act A的表达上调,通过激活不同的信号通路,表现神经保护活性,参与神经元损伤后修复。Act A可能是调控小胶质细胞极化行为的重要因子,但其机制尚不清楚。本研究为探讨缺血性脑损伤小胶质细胞极化规律及Act A参与调节小胶质细胞极化的可能机制,通过体内实验进行大脑中动脉阻塞（middle cerebral artery occlusion,MCAO）建立大鼠局灶性脑缺血损伤模型,体外实验建立小鼠小胶质细胞（BV2）氧糖剥夺/复氧（oxygenand glucose deprivation/repoxygenation,OGD/R）模型,根据缺血/缺氧不同时间点进行分组,检测Act A/Smads信号通路、小胶质细胞表型在缺血性脑损伤中的表达变化,并研究激活素A干预小胶质细胞极化的变化趋势。本研究包括以下内容:1.局灶性缺血性脑损伤中Act A/Smads信号通路的表达变化目的:检测不同缺血时间点Act A/Smads信号通路各位点活化情况。方法:应用Longa线栓法建立大鼠大脑中动脉阻塞模型（MCAO）,选取不同缺血时间点（0d、1d、3d、5 d、7 d及14 d）并进行随机分组,采用改良神经功能缺损严重程度量表（modifiedneurological severity score,mNSS）评价神经功能损伤程度,TTC染色法分析缺血性脑梗死区域体积,HE染色评价梗死后病理变化,实时荧光定量PCR、Western blot法检测脑组织内Act A/Smads通路相关跨膜受体（ActRⅡ）、受体下游因子（Smad2）基因及蛋白的表达水平。结果:MCAO局灶性脑缺血模型建立后,神经功能学评分提示存在明显的功能缺损,随缺血时间延长,评分逐渐降低;TTC染色可见明显的脑梗死病灶,随缺血时间延长,梗死脑组织体积逐渐降低;脑组织冠状位切片HE染色可见皮质梗死核心区大量神经元细胞坏死,细胞核固缩、核仁显示不清;Act A/Smads信号通路中Act A、Act AⅡ型受体及受体复合物中Smad2分别在基因及蛋白水平表达升高,随着缺血时间的延长,在缺血后3-5 d达到表达高峰,差异有统计学意义（P<0.05）。结论:缺血性脑损伤可诱导Act A表达,上调Act A/Smads信号通路中跨膜受体、受体下游因子基因及蛋白水平的表达,Act A/Smads信号通路参与了缺血性脑损伤过程,缺血3-5 d表达达到高峰,为后续探讨Act A/Smads信号通路与小胶质细胞在缺血性脑损伤中的关系奠定了实验基础。2.局灶性缺血性脑损伤小胶质细胞表型变化研究目的:研究缺血性脑损伤不同缺血时间点小胶质细胞表型变化规律。方法:建立大鼠MCAO模型,选取不同缺血时间点（0d、1 d、3d、5 d、7d及14d）将实验大鼠进行随机分组,实时荧光定量PCR检测M1型小胶质细胞标志物（iNOS、CD86）、M2型小胶质细胞标志物（CD206、Arg-1）基因水平的表达;免疫组织化学法检测M1型标志物（iNOS、CD86）、M2型标志物（CD206、Arg-1）蛋白的原位表达,并计算阳性表达IOD的百分比。结果:实时荧光定量PCR结果显示缺血1 d组M1型小胶质细胞标志物（iNOS、CD86）及M2型小胶质细胞标志物（CD206、Arg-1）mRNA均处于低表达水平,iNOS基因表达水平从MCAO 3d开始逐渐升高,在缺血14d内保持升高的趋势;CD86基因表达水平在MCAO 5 d达到表达高峰后水平逐渐降低,MCAO 14 d时其表达水平接近缺血损伤初期表达水平;M2型小胶质细胞标志物CD206和Arg-1的基因表达趋势相同,二者均在MCAO 1-3 d内表达,在损伤3 d时达到表达高峰,随缺血时间延长,CD206、Arg-1表达水平逐渐降低;免疫组化结果与实时荧光定量PCR结果变化趋势基本一致。与对照组比较差异有统计学意义（P<0.05）。结论:缺血性脑损伤可诱导小胶质细胞的极化,缺血早期以M2型为主,后期以M1型为主,提示了早期缺血诱导的小胶质细胞M2型极化,可能介导吞噬、抗炎作用,而后期M1型极化,可能介导慢性炎症损伤作用。3.Act A对局灶性缺血性脑损伤小胶质细胞表型变化的影响目的:研究Act A对缺血性脑损伤小胶质细胞极化趋势的影响。方法:建立大鼠MCAO模型,选取缺血损伤3d时间点,在MCAO造模6小时后侧脑室微量注射不同浓度的Act A,随机分为假手术组、MCAO 3 d组、MCAO 3 d+Act A2.5 μg/kg 组及 MCAO 3 d+Act A 7.5 μg/kg 组。通过 mNSS 评价神经功能损伤程度,TTC染色法分析缺血性脑梗死区域体积,实时荧光定量PCR检测Act A/Smads信号通路中Smad3、ActRⅡ基因水平、M1型标志物iNOS、M2型标志物CD206基因水平的表达;免疫组织化学法检测M1型标志物iNOS、M2型标志物CD206蛋白的原位表达,并计算阳性表达IOD百分比;结果:mNSS评价缺血性脑损伤后神经功能缺损结果显示Act A干预组评分明显优于MCAO 3 d组,Act A7.5μg/kg组评分优于Act A2.5μg/kg组,组间差异有统计学意义（P<0.05）;TTC染色测定结果显示干预组脑梗死体积明显小于MCAO 3 d组,ActA7.5μg/kg组小于ActA2.5μg/kg组,组间差异有统计学意义（P<0.05）;实时荧光定量PCR结果显示,M1型标志物iNOS基因在MCAO 3 d组表达升高,Act A干预后表达水平降低,MCAO 3 d+Act A 7.5μg/kg 组<MCAO 3 d+Act A 2.5μg/kg 组<MCAO 3 d 组;M2 型标志物 CD 206 基因 MCAO 3 d 组表达高于假手术组,Act A干预后CD206基因表达水平升高,MCAO 3 d+Act A 7.5μg/kg 组>MCAO 3 d+Act A2.5μg/kg 组水平>MCAO 3 d 组;Smad 3、ActR Ⅱ基因表达结果显示干预组水平高于MCAO 3 d组,MCAO 3 d+Act A 7.5μg/kg组高于MCAO 3 d+ActA2.5μg/kg组。差异有统计学意义（P<0.05）。结论:局灶性缺血性脑损伤后不同浓度Act A的干预,可减轻神经功能损伤程度、缩小脑梗死体积,促进Act A/Smads信号通路的表达,上调M2型标志物CD206的表达,下调表M1型标志物iNOS的表达,效应与干预浓度具有正相关性。Act A/Smads信号通路的活化可诱导小胶质细胞表型从M1型向M2型转化,这种变化可能发挥抗缺血损伤作用,为缺血性脑损伤的治疗提供潜在的转化靶点。4.Act A对小胶质细胞体外OGD/R过程中M1、M2型表达的影响目的:研究小鼠小胶质细胞BV2细胞OGD/R过程中不同时间点M1、M2型标志物、信号通路关键靶点的表达情况及Act A干预对M1、M2型表达的影响。方法:BV2细胞复苏后常规培养（高糖DMEM培养基,37℃、5%CO2）传代至第3代,通过更换无糖DMEM培养基、三气培养箱低氧培养（94%N2、5%CO2、1%O2）,建立BV2细胞氧糖剥夺/复氧（OGD/R）模型,将细胞分为对照组、OGD 1 h/R0h、OGD 1 h/R3 h、OGD 1 h/R6h、OGD 1h/R12h五组,Western blot对M1型标志物iNOS、M2型标志物IL-10及Act A/Smads信号通路Smad2蛋白表达水平进行检测;选择OGD1 h/R6h时间点,给予不同浓度Act A预培养BV2 细胞,分为对照组、OGD 1h/R6h 组、OGD 1h/R6h+Act A30nM组及OGD 1 h/R6h+Act A30nM组共四组,进一步Western blot检测各组M1型标志物iNOS、M2型标志物IL-10的表达情况及Smad2蛋白水平的表达情况。结果:体外实验成功培养BV2细胞并建立BV2细胞OGD/R模型,WesterBlot结果显示随复氧时间的延长,Act A/Smads信号通路Smad2蛋白表达逐渐增加,M1型标志物iNOS蛋白表达逐渐增加,M2型标志物IL-10蛋白表达逐渐增加,与R6 h达到高峰后表达水平有所回落;Act A预处理BV2小胶质细胞后,与OGD 1h/R 6 h组比较干预组Smad2蛋白表达逐渐增加,OGD 1 h/R 6 h+Act A50nM组高于OGD 1 h/R 6 h+Act A30nM组;M1型标志物iNOS蛋白表达干预组低于OGD 1 h/R 6 h 组,OGD 1 h/R 6 h+Act A50nM 组低于 OGD 1 h/R 6 h+Act A30nM组;M2型标志物蛋白水平表达逐渐升高,干预组高于OGD 1 h/R6 h组,OGD 1 h/R 6 h+Act A50nM 组高于 OGD 1 h/R 6 h+Act A30nM 组。结论:Act A可通过上调Act A/Smads信号通路中下游因子Smad2蛋白水平的表达,从而发挥神经保护作用,这一过程也参与调控了氧糖剥夺条件下BV2细胞极化过程,提示了 Act A/Smads信号通路可能通过调控小胶质细胞表型变化从而影响神经元细胞在缺血性损伤中的转归。
樊飞燕,张运克[7]（2021）在《益气活血中药联合骨髓间充质干细胞促进缺血性脑卒中血管新生的作用与机制》文中研究指明背景:骨髓间充质干细胞具有促进血管新生的作用,治疗缺血性脑卒中效果良好,益气活血类中药在促进血管新生方面亦存在显着疗效。目的:综述益气活血类中药联合骨髓间充质干细胞促进缺血性脑卒中血管新生的机制,以期为缺血性脑卒中的研究及治疗提供参考。方法:以"bone marrow mesenchymal stem cells,angiogenesis,ischemic stroke,traditional chinese medicine"为英文关键词,以"骨髓间充质干细胞,血管新生,缺血性脑卒中,中药"为中文关键词,检索2009至2020年期间收录在PubMed、中国知网、万方数据库中的文献,纳入血管新生相关机制及中药联合骨髓间充质干细胞促进血管新生相关的文献,排除重复与相关性弱的文献,对145篇文献进行总结分析。结果与结论:（1）梳理了骨髓间充质干细胞、血管新生的定义及血管新生的机制;（2）总结了益气活血类中药联合骨髓间充质干细胞促进血管新生的相关因子及信号通路,如血管内皮生长因子、脑源性神经营养因子、碱性成纤维细胞生长因子、缺氧诱导因子1α、血管生成素、整合素αvβ3、基质金属蛋白酶9及Wnt信号通路、Notch信号通路、PI3K/Akt信号通路和SDF-1/CXCR4信号轴;（3）总结发现益气活血类中药与骨髓间充质干细胞联合应用能增强血管新生作用,提升缺血性脑卒中的治疗效果。
吴春晓[8]（2020）在《电针结合NeuroD1基因疗法修复缺血性脑中风的机制研究》文中研究说明背景与目的:目前缺血性脑中风的治疗在一定程度上能改善患者的神经功能缺损症状和抑制炎症反应。然而,对于神经细胞死亡后无法再生的难题仍无法解决。本研究通过将神经转录因子NeuroD1微量注射到大脑中动脉损伤脑区,观察NeuroD1能否将大脑中动脉损伤脑区的应激星形胶质细胞重编为功能性神经元,同时运用改善运动功能较佳的电针疗法,两者的结合治疗是否能优化缺血性脑中风的治疗方案;能否进一步改善动物行为学障碍,提高神经元转化率,降低脑损伤炎症反应,进一步提高脑修复作用。探究电针结合神经转录因子NeuroD1调控缺血性脑中风的潜在机制。方法:将9只SPF级C57BL/6成年雄性小鼠制作MCAO模型后随机分为3组,分别为造模后（3天）组、（14天）组和（30天）组,通过激光散斑脑血流成像以及TTC染色观察脑梗死区域验证梗塞模型是否成功。同时,运用免疫荧光染色观察星形胶质细胞、小胶质细胞的病理变化。选用SPF级C57BL/6成年雄性小鼠（8-12周）9只,纹状体和皮层注射AAV病毒hGFAP::Cre/FLEX-CAG::NeuroD1-P2A-GFP分别于注射后第7天、14天和30天进行免疫荧光染色,观察在正常机体（小鼠）大脑不同脑区（纹状体以及皮层）不同时间点NeuroD1将应激星形胶质细胞重编成神经元的转化率情况。同时,运用电生理膜片钳全细胞记录技术观察重编的神经元是否具有正常的电生理功能。SPF级C57BL/6成年雄性小鼠（8-12周）35只随机分为假手术组、模型空载病毒组和NeuroD1治疗组三组,基因疗法干预后4天、14天、28天、60天和90天,分别进行动物行为学实验,主要包括黏纸实验、走格子实验、爬杯试验以及足迹分析。通过免疫荧光染色评估应激星形胶质细胞重编成NeuN神经元的转化情况,观察不同处理组脑梗死面积,应激星形胶质细胞、小胶质细胞的荧光强度变化及形态变化。将55 SPF级C57BL/6成年雄性小鼠（8-12周）采用随机数字表法随机分为4大组,分别为假手术（Sham）组,脑缺血再灌注损伤（I/R组）+mCh组,I/R+NeuroD1组和I/R+电针+NeuroD1组。分别于干预后第4天、14天、28天、60天和90天进行动物行为学实验测试。通过免疫荧光染色评估应激星形胶质细胞重编成NeuN神经元的转化情况,不同处理组脑梗死面积,应激星形胶质细胞、小胶质细胞的荧光强度及形态变化。结果:1.模型评价部分（1）MCAO模型小鼠在3d、14d和28d时神经功能缺损症状评分均为1分;（2）线栓插入后进行激光散斑血流量监测,可观察到线栓堵塞侧（左侧）灌注血流量与健侧相比,显着降低（分别为101.92±42.44和268.51 ±80.70）。（3）将造模后的MCAO小鼠进行TTC和神经元NeuN的染色,可观察到小鼠损伤脑区主要分布在纹状体以及纹状体附近皮层,并且出现大量的神经元丢失情况。（4）小鼠MCAO造模第3d、14d和30d后患侧脑区与正常健侧脑区星形胶质细胞（GFAP 标记）光强度分别为（21.98±2.44;7.92±0.69）、（19.47±3.05;6.15±1.35）和（22.38±3.61;5.98±1.27）。小胶质细胞（IBA1）平均光强度分别为（21.98±2.44;7.92±0.69）、（19.47±3.05;6.15±1.35）、（22.38±3.61;5.98±1.27）。2.在正常动物不同脑区,神经转录因子N euroD1将星形胶质细胞重编为功能性神经元的情况（1）皮层脑区:观察注射AAV 病毒 hGFAP::Cre/FLEX-CAG::NeuroD1-P2A-GFP 第7d、14d 和 30d 神经元的转化率分别为 4.06±2.33%、16.85± 6.75%和 84.42±1.07%。病毒注射14d和30d后,NeuroD1将皮层星形胶质细胞重编为神经元的转化率与7d相比,显着增加（P<0.05）。（2）纹状体脑区:注射AAV 病毒 hGFAP::Cre/FLEX-CAG::NeuroD1-P2A-GFP 第 7d、14d和30d后纹状体神经元的转化率分别为5.24±2.11%、31.48±11.10%和85.18±0.47%,纹状体星形胶质细胞在病毒侵染14d,30d后重编为神经元的转化率较7d的高,差异有统计学意义（P<0.05）。（3）全细胞膜片钳记录:NeuroD1表达7天时,随着注入电流的增加,电压呈线性变化,表明侵染的细胞仍旧是星形胶质细胞不表达钠离子通道,存在有一定的阻抗,尚未重编成神经元;NeuroD1表达21天时,记录纹状体标记的细胞发现其具有钠离子和钾离子电流信号,并且具有动作电位。说明NeuroD1重编的细胞表达钠通道,具有神经元的特性,且拥有神经元功能。3.神经转录因子NeuroD1将MCAO小鼠应激星形胶质细胞转化功能性神经元部分（1）动物行为学黏纸实验去除黏纸时长、走格子实验患肢踩空率、爬杯试验患侧肢体拖拽率和足迹分析患侧前后肢步长,三组均显示总体差异具有统计学意义（P<0.05）。进一步观察每一个干预时间点不同组别改善肢体运动功能的差别,N euroD1病毒注射后28天,60天,90天NeuroD1治疗组黏纸去除时长减少,走格子踩空率以及爬杯拖拽率减少,与模型组比较均具有统计学差异（P<0.01）;足迹分析在病毒注射后28天,60天,NeuroD1治疗组与模型空载组比较,NeuroD1治疗组能较好的改善MCAO小鼠患侧前肢、后肢的步长,差异均具有统计学意义（均P<0.05）。（2）NeuroD1将MCAO小鼠应激星形胶质细胞重编为功能性神经元相关病毒注射7天后,NeuroD1将皮层以及纹状体中应激星形胶质细胞重编为神经元的转化率分别为9.1%和10%;注射30天后,NeuroD1病毒治疗组将皮层和纹状体应激星形胶质细胞重编为神经元的转化率大约为80.86%和82.08%,与对照组相比差异具有统计学意义（P<0.01）。（3）NeuroD1降低MCAO小鼠脑梗死面积NeuroD1干预30天和120天后,结果发现,三组脑梗死面积总体比较,差异具有统计学意义（P<0.01）;NeuroD1与模型空载组比较,差异均具有统计学意义（P<0.05）。（4）NeuroD1对MCAO小鼠炎症胶质细胞的影响NeuroD1治疗30天和120天后,结果显示三组应激星形胶质细胞以及小胶质细胞荧光强度比较差异均具有统计学意义（P<0.01）。NeuroD1治疗组应激星形胶质细胞以及小胶质细胞荧光强度均比模型组弱（均P<0.01）。（5）NeuroD1对MCAO小鼠炎症小胶质细胞形态结构的影响治疗干预30天和120天后,三组比较,损伤脑区小胶质细胞数量、平均末端数量和突起长度均具有统计学差异（均P<0.01）;NeuroD1治疗组与模型组比较,能减少MCAO小鼠应激小胶质细胞数量,增加小胶质细胞平均末端数量和突起长度,差异均具有统计学意义（P<0.05）。4.电针结合神经转录因子NeuroD1将应激星形胶质细胞重编成神经元修复缺血性脑中风部分（1）动物行为学黏纸实验去除黏纸时长、走格子实验踩空率、爬杯试验患侧肢体拖拽率和足迹分析患侧前后肢步长,Sham,mCherry,NeuroD1,NeuroD1+EA四组比较均显示总体差异具有统计学意义（P<0.05）。观察每一个干预时间点不同组别改善肢体运动功能的差别。结果在干预后14天、28天、60天和90天,EA+NeuroD1治疗组黏纸去除时长减少,走格子踩空率以及爬杯拖拽率减少,与模型组比较均具有统计学差异（P<0.01）;足迹分析在病毒注射后28天、60天和90天,EA+NeuroD1治疗组与模型空载组比较,EA+NeuroD1组能较好的提高MCAO小鼠患侧前肢、后肢的步长,差异均具有统计学意义（均P<0.05）。在干预后14天,28天NeuroD1+EA组与单纯NeuroD1治疗组进行比较,NeuroD1+EA组出现较低的踩空率,具有统计学差异（P<0.05）;在干预90天,EA+NeuroD1能较好的提高患侧肢体下肢的步长,与单纯NeuroD1比较患侧下肢步长的改变具有统计学差异（P<0.05）。（2）电针结合NeuroD1将应激星形胶质细胞重编为功能性神经元7天后EA+NeuroD1将皮层以及纹状体应激星形胶质细胞重编为神经元的转化率分别为6.4%和9.2%,30天后EA+N euroD1治疗组将皮层和纹状体应激星形胶质细胞重编成神经元的转化率分别为89.74%和90.18%,与对照组相比,差异均具有统计学意义（均P<0.01）。（3）电针结合NeuroD1降低MCA0小鼠脑梗死面积EA+NeuroD1组干预30天和120天后MCAO小鼠脑梗死面积的变化:4组进行比较,总体脑梗死面积比较具有统计学差异（P<0.01）,EA+NeuroD1能较好的减小MCAO小鼠脑梗死面积,与模型组比较具有统计学差异（P<0.01）。并且120天,EA+NeuroD1与单纯NeuroD1比较,EA+NeuroD1组能较好的减少脑梗死面积,具有统计学差异（P<0.01）。（4）电针结合NeuroD1对MCAO小鼠炎症胶质细胞的影响EA+NeuroD1干预30天和120天后,结果显示4组中应激星形胶质细胞（GFAP标记）和小胶质细胞（IBA1标记）荧光强度比较差异均具有统计学意义（P<0.01）。EA+NeuroD1组的GFAP和IBA1荧光强度均比模型组弱,具有统计学差异（均P<0.01）。120天后,EA+NeuroD1能较好的降低应激IBA1的荧光强度表达,与单纯NeuroD1组比较具有统计学意义（P<0.01）。（5）电针结合NeuroD1对MCAO小鼠炎症小胶质细胞形态结构的影响干预30天和120天后,4组比较,损伤脑区小胶质的细胞数量,平均末端数量,突起长度均具有统计学差异（均P<0.01）;EA+NeuroD1治疗组与模型组比较,能减少MCAO小鼠应激小胶质细胞数量,增加小胶质细胞平均末端分支数量和突起长度,差异均具有统计学意义（P<0.05）;EA+NeuroD1组与NeuroD1组比较,EA+NeuroD1组能较好的提高小胶质细胞突起长度（P<0.01）。结论:1.大脑中动脉梗塞模型成功制作的主要特征为:出现神经缺损症状、梗塞一侧脑区血流明显减少甚至消失、损伤脑区TTC染色变白、梗死脑区主要为皮层和纹状体。并且,炎症胶质细胞从脑缺血再灌注损伤第3天起出现持续的胶质细胞应激反应,形成胶质细胞“疤痕组织”阻碍脑损伤的修复。2.NeuroD1神经转录因子在正常小鼠上能将大脑中星形胶质细胞重编成功能性神经元。病毒侵染7天后大部分仍是星形胶质细胞的形态,转化率大约10%;14天后皮层以及纹状体脑区开始有部分星形胶质细胞被重编为神经元,转化率达到40%;而在侵染1个月后,星形胶质细胞被重编为神经元的转化率则高达80%。从实验中推测神经转录因子NeuroD1将星形胶质细胞重编为成熟的神经元大约需要1个月的时间,并且在纹状体以及皮层具有较高的神经元转化率。3.NeuroD1能改善MCAO小鼠运动感觉以及平衡功能等行为障碍,将MCAO损伤脑区（皮层和纹状体）应激的星形胶质细胞重编成功能性神经元,重编的细胞形态以及功能均与正常神经元一致,并且NeuroD1的治疗可减轻脑中风小鼠的梗死面积,减轻脑区的炎症反应和保护损伤神经元。4.电针“百会穴”,“大椎穴”,“足三里穴”,“曲池穴”四个穴位结合神经转录因子NeuroD1可较好的挽救MCAO小鼠运动感觉以及平衡功能等行为学障碍,提高NeuroD1将应激星形胶质细胞重编成神经元的转化率,同时降低损伤的脑梗死面积,减轻损伤脑区应激胶质细胞的炎症反应,改变具有吞噬免疫功能的小胶质细胞的形态结构,使其趋向正常。5.电针的早期干预具有优化脑内微环境,提高再生神经元转化率和存活率以及改善动物行为障碍等优势,结合NeuroD1将应激星形胶质细胞原位重编成功能性神经元的作用,两者的结合治疗能较好的提高MCAO小鼠短期以及远期的神经功能恢复的脑保护作用。
刘殿玮[9]（2020）在《BDNF在记忆消退及缺血性脑卒中诱导的记忆损伤中的作用机制》文中研究说明背景:认知功能是大脑的高级神经活动之一,是人类和动物获得或应用知识以及信息加工的过程,它包括精神和智力活动的各个方面,学习和记忆是其中最主要的方面。学习记忆是一个由各种神经细胞、神经突触之间相互作用、相互联系形成的复杂的大脑高级活动过程。研究学习记忆的分子机制尤其是疾病导致的学习记忆障碍的机制,将为治疗记忆类疾病和疾病导致的认知能力降低提供新靶点、新思路。条件性味觉厌恶（conditioned taste aversion,CTA）是将味觉刺激与内脏不适感觉相关联的学习过程,是研究学习记忆的经典的条件反射。动物在饮用某种有特殊味觉特征的食物后,随后出现恶心、呕吐、腹泻等内脏不适,当再次遇到相同味觉特征的食物时,便会减少或拒绝摄取该食物。条件反射建立后,动物会长时间记住该食物的特殊味觉特征,因此CTA可以用来研究记忆的一个重要过程:记忆消退（extinction）。由于很多疾病,如脑卒中,可导致创伤后应激综合征（post traumatic stress disorder,PTSD）,而记忆消退与此密切相关,因此研究记忆消退的分子机制将有助于记忆相关疾病的诊治。另外,研究表明丘脑、杏仁体、岛叶（Insular cortex,IC）等脑区与CTA密切相关,因此,便于在解剖学基础上进一步研究学习记忆的分子机制。脑卒中是因各种诱发因素引起内动脉狭窄、闭塞或出血而造成的急性脑血液循环障碍,是当前威胁人类生命的三大疾病之一。脑卒中按发病原因可分为出血性和缺血性,其中缺血性脑卒中约占全部卒中的80%,且每年以8.1%的速率不断上升。在我国,70%-80%的缺血性脑卒中患者遗留有不同程度的躯体运动及认知功能障碍,其中认知功能障碍常常干扰患者对外界环境的感知和适应,给患者家庭和社会带来了严重的负担。目前关于缺血性脑卒中后的认知功能,尤其是学习记忆障碍未受到足够重视。学习记忆障碍不仅严重影响患者的日常生活能力,也对躯体感觉运动功能的恢复造成不利影响,是缺血性脑卒中致残的重要原因之一。因此研究缺血性脑卒中后学习记忆障碍的分子机制,及早发现并有效治疗具有重要的医学价值和社会意义。脑源性神经营养因子（Brain derived neurotrophic factor,BDNF）是中枢神经系统中含量最丰富、分布范围最广的神经营养素家族成员,且在与认知功能密切相关的脑区如海马、皮层、纹状体等表达较高。BDNF不仅对神经元的存活、分化、生长和损伤修复具有重要作用,还参与学习记忆等多种生物学功能。随着脑损伤修复机制研究的不断深入,证据表明神经可塑性是脑卒中功能恢复的基础。而BDNF对神经元可塑性起着重要的调控作用,BDNF合成后通常储存在突触的致密核心囊泡（dense core vesicle,DCV）中,它必须从中分泌释放,并与其高亲和力酪氨酸激酶受体B（TrkB）结合使其磷酸化,继而激活mitogen activated protein kinase（MAPK）、phosphatidylinositol 3-kinase（PI3K）和phospholipase Cγ（PLC-γ）等一系列胞内信号转导通路,才能最终发挥其生物学功能。但是目前BDNF分泌的机制仍不明确。因此,研究BDNF分泌在学习记忆中的作用,寻找缺血性脑卒中后BDNF分泌的调控分子,明确其在缺血性脑卒中记忆障碍中的作用机制,将有助于进一步了解学习记忆的分子生物学机制,并有望成为缺血性脑卒中记忆障碍的重要治疗手段。综上所述,本课题采用CTA动物行为学和大鼠大脑中动脉线栓模型,应用Elisa、western-blot、实时荧光定量PCR、原位杂交、腺相关病毒、水迷宫等方法,系统的研究了 BDNF分泌在CTA记忆消退以及缺血性脑卒中后学习记忆障碍中的作用及其机制。通过本项研究,能够使我们进一步了解BDNF参与学习记忆的神经生物学机制,更为将来以BDNF及其调控分子为目标的缺血性脑卒中记忆障碍的诊疗提供新思路和新方法。研究目的:1.探讨岛叶BDNF分泌在CTA记忆消退中的作用及其机制。2.探讨BDNF分泌及其调控分子在缺血性脑卒中学习记忆障碍中的作用及其机制。研究方法:1.脑内埋管将麻醉后的雄性Wistar大鼠头部固定于脑立体定位仪,以前囟点为原点,参考大鼠脑立体定位图谱,双侧脑内埋管至岛叶上lmm,术后一周开始后续实验。CTA消退测试完毕后立即在岛叶内微量注射BDNF中和抗体,连续注射三天,观察动物行为学的变化。2.条件性味觉厌恶CTA记忆消退大鼠限水24小时后,每天上午定时喂水,适应3天,大鼠便会形成固定时间饮水的习惯。第4天,给予大鼠等量糖水,饮后40分钟腹腔注射氯化锂（LiCl）,造成动物腹部不适,从而建立条件反射。3天后开始进行消退测试,测试时同时给予大鼠糖水和自来水,但不给予腹腔注射LiCl,分别记录动物饮自来水和糖水的量,计算饮自来水占饮液体总量的百分比,该比值称为厌恶指数。连续测试4天,随着测试天数的增加,厌恶指数逐渐降低,说明动物经过训练后记忆逐渐消退。3.缺血性脑卒中模型的建立雄性大鼠麻醉后,于颈部正中切口,逐层分离并暴露颈部血管,从颈外动脉或颈总动脉分叉部插入线栓,进入颈内动脉,阻断左侧大脑中动脉（middle cerebral artery,MCA）起始段及其所有血液供应,导致MCA局灶性缺血,缝合皮肤,留一线端在外,2小时后小心抽出线栓。假手术组只钝性分离颈总动脉,然后逐层缝合。4.实时荧光定量 PCR（Real-time PCR）在CTA记忆消退和缺血性脑卒中术后,选定不同的时间点,取大鼠岛叶或海马,用RNA提取试剂盒提取RNA。取定量总RNA,用反转录试剂盒将RNA反转录成cDNA。最后根据目的基因的不同,选择不同的退火温度做实时定量PCR,检测目的基因的变化情况。5.BDNF Elisa在CTA记忆消退和缺血性脑卒中后特定时间点,取大鼠特定脑组织,提取蛋白后测定蛋白浓度。将标准品倍比稀释。取出板条,依次向每孔中加入分析液,标准品和待测样本,样本和标准品设置复孔,室温避光孵育2小时。振荡洗后,孵育二抗。再次洗涤后,加入底物工作液孵育显色,最后终止反应。6.原位杂交CTA消退第2天测试完毕后,在特定的时间点将大鼠麻醉后进行心脏灌流,取出脑组织后固定过夜后,置于蔗糖中沉淀直至沉至管底,冰冻切片机进行切片,切片厚度为40μm,每只动物留取6套组织切片进行原位杂交实验检测BDNFmRNA,最后用Image J软件统计各组岛叶的灰度值。7.免疫沉淀CTA记忆消退第二天测试完毕后不同时间点,于冰上取岛叶并用蛋白裂解液提取蛋白。取定量蛋白裂解液,向其中加入蛋白A微球润洗后,加入TrkB抗体,于4℃孵育3-4小时,向其中加入蛋白A微球,4℃孵育过夜,收集微球,经蛋白变性、电泳、转膜等步骤将蛋白转至PVDF膜,PVDF膜封闭结束后,分别孵育pY99磷酸化酪氨酸抗体及TrkB抗体检测磷酸化TrkB及总TrkB,根据两者的比值判断各组磷酸化TrkB的变化。8.Western blotCTA消退第二天测试完毕后或MCAO术后第一天及第三天取脑,加入蛋白裂解液研磨后提取蛋白,加上样缓冲液煮沸后将蛋白变性。经电泳、转膜及封闭后,分别加入 c-Fos、Erk、磷酸化 Erk、caspase-3、CAPS1、LC3B、TrkB、磷酸化TrkB、Akt及磷酸化Akt等抗体,4℃孵育过夜,回收一抗后,加入相应二抗室温孵育1小时,最后ECL显影。9.免疫组化缺血性脑卒中术后第一天及第三天,将大鼠麻醉,灌流取脑,冰冻切片机切片,切片厚度为20 μm,进行免疫荧光染色。切片经5%山羊血清封闭1小时后,滴加CAPS1及secretogranin I（突触致密囊泡DCV的蛋白标志物）的一抗,4℃孵育过夜,回收一抗后,滴加荧光二抗。最后用DAPI孵育5分钟,显微镜下观察CAPS 1与DCV共定位的情况。l0.Morris水迷宫水迷宫实验是测试缺血性脑卒中后学习记忆的常用实验。大鼠脑卒中术后恢复一周,第8天开始进行水迷宫实验。摄像机记录大鼠运动轨迹。定位航行实验:将大鼠依次从四个象限放入水中,记录大鼠寻找到隐藏在水面下平台的时间,即逃避潜伏期,时间越短说明学习记忆能力越强,连续训练5天。空间探索实验:第13天撤去平台,记录大鼠60秒内在原平台象限的活动时间,以评判大鼠的空间记忆。结果:1.岛叶BDNF分泌在CTA记忆消退中的作用及其机制1.1.岛叶BDNF参与CTA记忆消退过程为了明确岛叶中BDNF在记忆消退中的作用,我们选择在CTA消退第1、2、3天测试完毕后立即在岛叶内微量注射BDNF抗体,用厌恶指数评价记忆消退的情况,厌恶指数越高消退越慢,说明大鼠学习能力越差;为了进一步明确条件性味觉厌恶记忆消退能否诱导岛叶中神经元活化,我们用western blot检测了消退第二天测试完毕后90min岛叶中c-Fos的变化,结果显示:在岛叶中注射BDNF抗体后,从消退第二天开始,厌恶指数明显高于溶剂对照组,说明注射BDNF抗体能够阻断条件性味觉厌恶记忆消退过程;消退第二天测试完毕后90min,c-Fos表达量升高,说明岛叶中BDNF参与条件性味觉厌恶记忆消退过程,且条件性味觉厌恶记忆消退能够激活岛叶中神经元。为了进一步明确条件性味觉厌恶记忆消退后岛叶中BDNF的变化,我们选择在条件性味觉厌恶记忆消退第二天测试完毕后不同时间点取岛叶,分别用实时荧光定量PCR及BDNF Elisa检测了 BDNF mRNA及蛋白的变化情况。结果显示:CTA消退第二天岛叶中BDNF基因及蛋白表达量均出现不同程度的升高,而NGF和NT-4mRNA的表达水平没有明显变化,说明CTA消退特异性的诱导岛叶中BDNF出现时间特异性表达增加。另外,为了更直观的显示BDNFmRNA的变化,我们进一步用原位杂交验证了 Real-time PCR的结果。这些结果提示:CTA记忆消退诱导岛叶中BDNF表达升高,且BDNF的变化参与CTA记忆消退过程。1.2.CTA记忆消退诱导岛叶中活性依赖的BDNF分泌BDNF分泌释放后与TrkB受体结合并使其磷酸化,所以磷酸化TrkB的水平能够反映BDNF分泌的情况。为了进一步明确CTA消退能否诱导活性依赖的BDNF分泌,我们选择BDNF表达变化前以及BDNF升高的时间点,取岛叶脑组织,用免疫沉淀检测磷酸化TrkB,结果显示:在BDNF蛋白升高的时间点,岛叶中磷酸化TrkB水平升高,说明此时TrkB的磷酸化是由于BDNF蛋白合成后释放导致的。有趣的是,我们发现在BDNF升高前,磷酸化TrkB水平已经升高,说明在BDNF蛋白升高前,CTA记忆消退诱导了 BDNF分泌。为了进一步证实CTA消退诱导岛叶中BDNF分泌,我们用western blot检测了 BDNF下游分子Erk及其磷酸化情况,结果显示:与磷酸化TrkB变化一致,CTA消退第二天岛叶中磷酸化Erk升高,进一步证实BDNF分泌通过Erk信号通路参与CTA记忆消退过程。1.3.CTA记忆消退抑制神经元凋亡为了明确记忆消退过程中脑细胞凋亡的情况,我们选择在条件性味觉厌恶记忆消退第二天测试完毕后不同时间点取脑,用western blot检测了凋亡相关分子caspase-3的变化,结果显示:CTA消退后caspase-3表达量降低,说明CTA记忆消退抑制岛叶中神经元的凋亡。文献报道,BDNF能够抑制神经元凋亡,因此我们的结果进一步提示岛叶中BDNF通过抑制神经元凋亡参与CTA记忆消退。2.探讨BDNF分泌及其调控分子在缺血性脑卒中学习记忆障碍中的作用及其机制。2.1缺血性脑卒中诱导海马中BDNF表达及分泌增加本课题采用大鼠左侧大脑中动脉阻塞线栓法制备缺血性脑卒中模型,术后1天,3天及7天取双侧海马,分别用Real-time PCR及Elisa检测BDNFmRNA及BDNF蛋白的变化,另外,用western blot检测BDNF受体p-TrkB及其下游分子p-Akt的变化情况。结果显示:与假手术组相比,双侧海马中BDNFmRNA及蛋白在术后1天及3天均出现了不同程度的升高,且在BDNF变化的时间点p-TrkB及p-Akt均出现了不同程度的升高,说明缺血性脑卒中诱导海马中BDNF分泌增加,且BDNF/TrkB/Akt信号通路可能在缺血性脑卒中预后中起着重要的调控作用。2.2缺血性脑卒中诱导海马CAPS1表达增加BDNF分泌是钙离子依赖的过程。体外研究表明,钙离子依赖分泌激活蛋白 1（Ca2+-dependent activator protein for secretion 1,CAPS1）在其中起着重要的调控作用。为了明确CAPS1是否参与调控缺血性脑卒中后BDNF分泌,我们在大鼠缺血性脑卒中术后BDNF升高的时间点取双侧海马,用western blot检测CAPS1的变化,结果显示:在BDNF及磷酸化TrkB升高的时间点,双侧海马中CAPS1表达升高,说明海马中CAPS1可能参与调控缺血性脑卒中后BDNF的分泌。2.3缺血性脑卒中后海马中CAPS1通过与突触致密囊泡结合调控BDNF分泌合成的BDNF储存于突触致密囊泡DCV中,为了进一步明确CAPS1调控BDNF分泌的机制,我们用免疫组化检测了缺血性脑卒中术后第1天及第3天海马中CAPS1与DCV共定位的情况。结果显示:与假手术组相比,脑卒中术后第1天及第3天,海马CAPS1与DCV共定位增强,提示CAPS1通过与DCV结合进而调控BDNF分泌。2.4海马CAPS1调控BDNF分泌参与缺血性脑卒中学习记忆障碍的恢复为了明确CAPS1是否通过调控BDNF分泌,进而参与缺血性脑卒中记忆障碍的调控,我们设计了 CAPS1腺相关病毒,大鼠海马内微量注射腺相关病毒1个月后建立缺血性脑卒中（MCAO）模型,MCAO术后恢复一周,术后第8天开始用水迷宫检测CAPS1在缺血性脑卒中记忆障碍的作用。我们首先用western blot检测了 CAPS1腺相关病毒对CAPS1及p-TrkB的影响,结果显示:与假手术组相比,注射病毒空载体（对照腺相关病毒）组在MCAO术后第1天和第3天海马中CAPS1及p-TrkB表达显着升高,说明注射对照腺相关病毒对CAPS1的表达没有影响。与注射对照腺相关病毒相比,注射CAPS1腺相关病毒导致MCAO术后第1天和第3天海马中CAPS1及p-TrkB的表达降低,且与假手术组没有差异,说明CAPS1腺相关病毒能够抑制缺血性脑卒中诱导的CAPS1表达及BDNF分泌。进一步应用水迷宫实验证实,缺血性脑卒中大鼠逃避潜伏期延长,说明空间学习记忆受损,但随着训练次数的增加,脑卒中大鼠的学习记忆能力逐渐恢复至正常水平;而海马内注射CAPS1腺相关病毒的脑卒中大鼠,记忆损伤不能恢复。这些结果表明,海马CAPS1通过调控BDNF分泌参与缺血性脑卒中后学习记忆损伤的恢复。结论:1.CTA记忆消退特异性诱导岛叶BDNF分泌及表达增加,且岛叶BDNF分泌参与CTA消退过程。2.岛叶中BDNF通过抑制神经元凋亡参与CTA记忆消退。3.缺血性脑卒中诱导海马中BDNF表达及分泌增加,分泌的BDNF通过与其受体TrkB结合进而激活下游Akt信号通路。4.缺血性脑卒中诱导海马中CAPS1表达增加,且CAPS1通过与突触致密囊泡结合调控BDNF分泌。5.CAPS1通过调控BDNF分泌参与缺血性脑卒中学习记忆损伤的恢复。意义:本课题研究了 BDNF分泌在记忆消退中的作用及其机制,并首次证实缺血性脑卒中能够诱导海马中BDNF分泌增加,且CAPS 1能够通过调控BDNF分泌参与脑卒中记忆损伤恢复的调控。这将使我们进一步明确BDNF及其调控分子在记忆相关疾病中的作用;并为缺血性脑卒中后认知功能障碍的治疗提供新的思路和新靶点。
白浩[10]（2019）在《脂联素通过cAMP/PKA-CREB-BDNF通路抗脑缺血-再灌注损伤及其机制研究》文中提出缺血性脑卒中是一种急性脑血管疾病,其发病率高,致死致残率高,严重危害着人类的生命健康。随着医疗技术和医疗设备的发展,脑卒中的治疗已经取得了巨大的飞跃,通过药物溶栓或机械取栓的方式再通血管的问题已得到初步解决,但血管再通后随之而来的缺血再灌注（I/R）损伤是不可避免的,并且严重制约着治疗的效果,影响患者的预后。脂联素（APN）是一种脂肪源性的血浆蛋白,研究表明,其在心肌缺血再灌注（I/R）损伤过程中有良好的治疗保护作用,而脂联素在脑缺血再灌注损伤过程中的保护作用及其相关机制尚有待进一步研究。本研究旨在探讨APN对脑I/R损伤的影响及其可能的相关分子机制。本研究以线栓法阻塞C57BL/6小鼠大脑中动脉作为卒中模型,阻塞一定时间后拔出栓线,以模拟脑缺血再灌注病理过程。外源性脂联素预处理实验小鼠,以探索脂联素对小鼠脑缺血再灌注损伤的保护作用及其具体分子通路和作用机制。本研究将为脂联素在脑缺血再灌注损伤过程中的神经保护作用提供新的研究证据,并为临床应用脂联素干预缺血性卒中患者的预后提供新的理论基础。本研究共分为一项两部分:1.脂联素对小鼠脑缺血再灌注损伤后的保护作用。2.cAMP/PKA通路在脂联素脑保护效应中的作用及机制。第一部分脂联素对小鼠脑缺血再灌注损伤后的保护作用方法将C57BL/6小鼠随机分为假手术组、I/R组、溶剂+I/R组和APN+I/R组。在大脑中动脉闭塞（MCAO）前24h给予APN处理3次（0h,12h,24h）。小鼠大脑中动脉阻塞2h后拔出栓线,进行脑组织血流再灌24h,以此模拟脑缺血再灌注损伤。再灌注24h后对小鼠进行脑梗死体积测量、神经功能评分、脑水含量测定,宏观评估脂联素的脑保护效应。以TUNEL染色法检测小鼠缺血半暗带脑组织（核心梗死区和正常脑组织之间的部分）的细胞凋亡情况。同时,再灌注24h后提取小鼠缺血半暗带脑组织,以Western blot法检测缺血半暗带脑组织中凋亡分子active caspase-3、Bax、Bcl-2的表达情况,以微观评估脂联素对缺血半暗带细胞凋亡的影响。结果1.与假手术组相比,脑缺血再灌注损伤组脑梗死体积、神经功能评分、脑水含量均增加。与溶剂+I/R组相比,APN+I/R组的脑梗死体积,神经功能评分,脑水含量均降低。2.与假手术组相比,脑缺血再灌注损伤组TUNEL染色阳性细胞增多。与溶剂+I/R组相比,APN+I/R组的TUNEL染色阳性细胞减少。与假手术组相比,脑缺血再灌注损伤组的促凋亡分子active caspase-3、Bax均升高,抑凋亡分子Bcl-2下降。与溶剂+I/R组相比,APN+I/R组的促凋亡分子active caspase-3、Bax均下降,抑凋亡分子Bcl-2升高。结论脂联素预处理能够减轻小鼠脑缺血再灌注后的损伤效应,并可有效抑制缺血半暗带的细胞凋亡。第二部分cAMP/PKA通路在脂联素脑保护效应中的作用及机制方法将C57BL/6小鼠随机分为假手术组、I/R组、溶剂+I/R组和APN+I/R组。再灌注24h后取缺血半暗带脑组织,以Western blot法及免疫荧光法检测缺血半暗带脑组织中通路分子cAMP、PKA、CREB、BDNF的表达情况。而后将C57BL/6小鼠随机分为溶剂+I/R组、APN+I/R组、PKA激活剂+I/R组、PKA抑制剂+APN+I/R组。再灌注24h后取缺血半暗带脑组织,以Western blot法检测在PKA激动剂和PKA抑制剂作用条件下cAMP、PKA、CREB、BDNF的表达情况。再灌注24h后对小鼠进行脑梗死体积测量、神经功能评分、脑水含量测定,宏观评估PKA抑制剂对脂联素脑保护效应的影响。以TUNEL染色法检测小鼠缺血半暗带脑组织的细胞凋亡情况。同时,再灌注24h后提取小鼠缺血半暗带脑组织,以western blot法检测缺血半暗带脑组织中凋亡分子active caspase-3、Bax、Bcl-2的表达情况,微观评估PKA抑制剂对脂联素抑制缺血半暗带区域细胞凋亡效应的影响。结果1.与假手术组相比,脑缺血再灌注损伤后,缺血半暗带区域的cAMP、PKA、P-CREB/CREB、BDNF的表达下降。与溶剂+I/R组相比,APN+I/R组的cAMP、PKA、P-CREB/CREB、BDNF的表达升高。2.与溶剂+I/R组相比,APN+I/R组和PKA激活剂+I/R组的cAMP、PKA、P-CREB/CREB、BDNF的表达升高。与APN+I/R组相比,PKA抑制剂+APN+I/R组的cAMP、PKA、P-CREB/CREB、BDNF的表达下降。3.与溶剂+I/R组相比,APN+I/R组和PKA激活剂+I/R组的脑梗死体积、神经功能评分、脑水含量均下降。与APN+I/R组相比,PKA抑制剂+APN+I/R组的脑梗死体积,神经功能评分,脑水含量均升高。4.与溶剂+I/R组相比,APN+I/R组和PKA激活剂+I/R组的TUNEL染色阳性细胞减少。与APN+I/R组相比,PKA抑制剂+APN+I/R组的TUNEL染色阳性细胞增多。与溶剂+I/R组相比,APN+I/R组和PKA激活剂+I/R组的促凋亡分子active caspase-3、Bax均下降,抑凋亡分子Bcl-2升高。与APN+I/R组相比,PKA抑制剂+APN+I/R组的促凋亡分子active caspase-3、Bax均升高,抑凋亡分子Bcl-2下降。结论脂联素的脑保护效应可能是由cAMP/PKA-CREB-BDNF通路介导。
二、Effect of the antibody of brain-derived neurotrophic factor on the rat with ischemic injury from obstruction of middle cerebral artery（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、Effect of the antibody of brain-derived neurotrophic factor on the rat with ischemic injury from obstruction of middle cerebral artery（论文提纲范文）
（1）额尔敦-乌日勒的活性成分分析及其对小胶质细胞基因调控作用的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 额尔敦-乌日勒的简介 |
| 1.1.1 额尔敦-乌日勒历史沿革 |
| 1.1.2 额尔敦-乌日勒研究进展 |
| 1.1.3 额尔敦-乌日勒所含单药化学成分的国内外研究进展 |
| 1.2 脑卒中简介 |
| 1.2.1 脑卒中分类及病因 |
| 1.2.2 缺血性脑卒中的主要病理生理机制 |
| 1.2.3 治疗脑卒中的策略 |
| 1.3 小胶质细胞简介 |
| 1.3.1 小胶质细胞简介 |
| 1.3.2 小胶质细胞的极化 |
| 1.3.3 小胶质细胞极化与信号通路 |
| 1.3.4 小胶质细胞与其它神经细胞的相互作用 |
| 1.3.5 作用于小胶质细胞的药物 |
| 1.4 中草药的研究方法及进展 |
| 1.5 立题依据及主要研究内容 |
| 1.5.1 立题依据 |
| 1.5.2 主要研究内容 |
| 1.5.3 创新性 |
| 第二章 额尔敦-乌日勒对大鼠大脑中基因表达调控作用及其活性成分的分析 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.2.1 实验动物 |
| 2.2.2 主要试剂与耗材 |
| 2.2.3 主要仪器 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 动物饲养 |
| 2.3.2 MCAO模型 |
| 2.3.3 治疗组 |
| 2.3.4 收集样品,提取RNA和 RNA-seq |
| 2.3.5 序列过滤、比对和组装(Assembly) |
| 2.3.6 差异表达分析 |
| 2.3.7 EW的提取方法 |
| 2.3.8 建立数据库 |
| 2.3.9 UPLC-QTof-MS分析 |
| 2.4 实验结果 |
| 2.4.1 治疗后MCAO/R模型大鼠的神经功能评估 |
| 2.4.2 Illumina测序和参考基因组比对 |
| 2.4.3 EW处理后差异基因表达 |
| 2.4.4 EW-1 中神经活性成分分析 |
| 2.4.5 EW-2 中神经活性成分分析 |
| 2.4.6 EW-3 中神经活性成分分析 |
| 2.4.7 EW-4 中神经活性成分分析 |
| 2.4.8 EW-5 中神经活性成分分析 |
| 2.5 讨论 |
| 2.6 小结 |
| 第三章 额尔敦-乌日勒中活性小分子对小胶质细胞分泌的促炎型细胞因子的转录调控作用 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料 |
| 3.2.1 实验动物 |
| 3.2.2 细胞品系 |
| 3.2.3 主要试剂耗材 |
| 3.2.4 仪器设备 |
| 3.2.5 引物 |
| 3.2.6 主要试剂的配制 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 样品的提取制备 |
| 3.3.2 HPLC半制备分离 |
| 3.3.3 UPLC-QTof-MS分析 |
| 3.3.4 小鼠原代小胶质细胞的分离及培养 |
| 3.3.5 BV2 小胶质细胞培养 |
| 3.3.6 EW对小胶质细胞表达的促炎因子的影响 |
| 3.3.7 实时荧光定量PCR |
| 3.3.8 统计学分析 |
| 3.4 实验结果 |
| 3.4.1 EW不同溶剂提取物对Cxcl10 表达的下调作用 |
| 3.4.2 EW-5 半制备馏分的UPLC分析及其对促炎因子表达的下调作用 |
| 3.4.3 F4 半制备馏分的UPLC分析及其对促炎因子表达的下调作用 |
| 3.4.4 F4-6 中生物活性化学物质的分析及鉴定 |
| 3.4.5 木香烃内酯对小胶质细胞释放的促炎因子表达的影响 |
| 3.4.6 肉豆蔻醚对小胶质细胞释放的促炎因子表达的影响 |
| 3.4.7 土木香内酯对小胶质细胞中促炎因子表达的影响 |
| 3.4.8 亚麻酸对小胶质细胞中促炎因子表达的影响 |
| 3.5 讨论 |
| 3.6 小结 |
| 第四章 额尔敦-乌日勒中活性小分子土木香内酯和去氢二异丁香酚抑制小胶质细胞NF-κB信号通路 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验材料 |
| 4.2.1 细胞品系 |
| 4.2.2 主要试剂与耗材 |
| 4.2.3 主要仪器 |
| 4.2.4 引物 |
| 4.2.5 抗体 |
| 4.2.6 主要试剂的配置 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 样品的提取制备 |
| 4.3.2 UPLC-QTof-MS法对F4-6 定性分析 |
| 4.3.3 UPLC-QTof-MS法对F4-6中Ala和 Deh进行定量分析 |
| 4.3.4 细胞培养 |
| 4.3.5 细胞毒性测定 |
| 4.3.6 N2a细胞的细胞增值活力和神经突触生长测定 |
| 4.3.7 提取总RNA和 RT-q PCR |
| 4.3.8 蛋白免疫印迹(Western blot) |
| 4.3.9 统计学分析 |
| 4.4 实验结果 |
| 4.4.1 EW提取物中活性分子的Ala和 Deh的定性 |
| 4.4.2 F4-6 抑制LPS刺激的BV2 细胞促炎因子的表达 |
| 4.4.3 F4-6 促进BV2 细胞LPS刺激后抗炎基因表达 |
| 4.4.4 F4-6 的神经保护作用 |
| 4.4.5 F4-6对LPS诱导的BV2 细胞中NF-κB信号通路激活的影响 |
| 4.5 讨论 |
| 4.6 小结 |
| 第五章 天然产物小分子土木香内酯和去氢二异丁香酚对小胶质细胞基因表达的联合调控作用 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 实验材料 |
| 5.2.1 细胞品系 |
| 5.2.2 主要试剂与耗材 |
| 5.2.3 主要仪器 |
| 5.2.4 引物 |
| 5.3 实验方法 |
| 5.3.1 细胞培养 |
| 5.3.2 提取RNA和文库构建 |
| 5.3.3 序列过滤、比对和组装 |
| 5.3.4 差异表达分析 |
| 5.3.5 差异表达基因的GO和 KEGG富集分析 |
| 5.3.6 实时荧光定量PCR |
| 5.3.7 统计学分析 |
| 5.4 实验结果 |
| 5.4.1 Illumina测序和参考基因组比对 |
| 5.4.2 Ala、Deh和 Mix处理后的差异表达基因 |
| 5.4.3 DEG的GO富集分析 |
| 5.4.4 DEG的 KEGG代谢通路富集分析 |
| 5.4.5 通过RT-qPCR验证DEG数据 |
| 5.5 讨论 |
| 5.6 小结 |
| 第六章 总结与展望 |
| 参考文献 |
| 附录一 |
| 致谢 |
| 攻读博士期间发表的学术论文 |
（2）“治神调形”下头针对缺血性中风痉挛大鼠BDNF/TrkB/CREB及PI3K/Akt/GSK-3β通路影响的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略语 |
| 引言 |
| 文献综述 |
| 文献综述一 中风后肢体痉挛临床研究进展 |
| 1 PSS的流行病学研究 |
| 2 中风的主要致病因素 |
| 3 中风后肢体痉挛的临床评价现状 |
| 4 中风后肢体痉挛的临床康复治疗现状 |
| 文献综述二 头针疗法的源流及作用机制研究进展 |
| 1 头针理论的中医内涵 |
| 2 头针的主要流派 |
| 3 头针穴名标准化方案的建立 |
| 4 头针在PSS治疗机制研究中的进展 |
| 实验研究 |
| 实验一 缺血性PSS大鼠模型的确立和验证 |
| 1 研究内容 |
| 2 研究方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 实验结果讨论 |
| 5 小结 |
| 实验二 缺血性PSS动物研究头针行针频率及时间验证 |
| 1 研究内容 |
| 2 研究方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 实验结果讨论 |
| 5 小结 |
| 实验三 头针对缺血性PSS大鼠行为学改变的影响 |
| 1 研究内容 |
| 2 研究方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 实验结果讨论 |
| 5 小结 |
| 实验四 头针对缺血性PSS大鼠脑组织恢复的影响 |
| 1 研究内容 |
| 2 研究方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 实验结果讨论 |
| 5 小结 |
| 实验五 头针对缺血性PSS大鼠BDNF/TrkB/CREB信号通路的影响 |
| 1 研究内容 |
| 2 研究方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 实验结果讨论 |
| 5 小结 |
| 实验六 头针对缺血性PSS大鼠PI3K/Akt/GSK-3β信号通路的影响 |
| 1 研究内容 |
| 2 研究方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 实验结果讨论 |
| 5 小结 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 创新点 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 研究成果 |
| 个人简介 |
（3）舒血宁注射液在缺血性脑卒中预后的药效评价及作用机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩略词表 |
| 前言 |
| 研究内容一 舒血宁注射液对脑卒中后小鼠脑损伤及行为学的药效评价 |
| 1 材料与方法 |
| 2 实验结果 |
| 小结一 |
| 研究内容二 舒血宁注射液提高脑卒中后小鼠认知功能障碍的体内机制研究 |
| 1 材料与方法 |
| 2 实验结果 |
| 小结二 |
| 研究内容三 舒血宁注射液提高脑卒中后小鼠认知功能障碍的体外机制研究 |
| 1 材料与方法 |
| 2 实验结果 |
| 小结三 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 多组分天然药物能否作为缺血性脑卒中分期分型治疗策略? |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（4）丹参多酚酸通过小胶质细胞P2X7/NLRP3/GSDMD通路减轻实验性脑缺血再灌注损伤研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 英文缩略词表 |
| 前言 |
| 论文一 注射用丹参多酚酸盐(SAFI)对MCAO/R模型大鼠神经保护作用 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 论文二 SAFI对经OGD/R处理的神经元细胞活力与凋亡影响的研究 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 论文三 SAFI对MCAO/R模型及OGD/R模型小胶质细胞NLRP3炎症小体激活与GSDMD影响的研究 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 论文四 SAFI对MCAO/R模型及OGD/R模型NLRP3炎症小体激活上游的膜通道P2X7表达的影响及SAFI组分与P2X7的分子对接 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 结论 |
| 本研究创新性的自我评价 |
| 参考文献 |
| 附图 |
| 综述一 脑梗死后的免疫反应 |
| 参考文献 |
| 综述二 注射用丹参多酚酸盐治疗脑梗死的研究进展 |
| 参考文献 |
| 个人简介 |
| 在学期间科研成绩 |
| 致谢 |
（5）头穴丛刺治疗中风后肢体痉挛的临床观察及其抗痉挛效应机理研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略语 |
| 引言 |
| 综述一.中风后肢体痉挛的研究概况 |
| 综述二.中风后肢体痉挛的治疗及效应机制研究概述 |
| 第一章 试验研究头穴丛刺治疗中风后肢体痉挛的临床观察 |
| 1.研究对象 |
| 2.研究方案 |
| 3.研究结果 |
| 4.讨论 |
| 5.小结 |
| 第二章 实验一头穴丛刺对中风后肢体痉挛模型大鼠GABA受体机制研究。 |
| 1.实验材料 |
| 2.试验方法 |
| 3.实验结果 |
| 4.讨论 |
| 5.小结 |
| 第三章 实验二头穴丛刺治疗中风后肢体痉挛对BDNF/Trk B-KCC2 信号通路的影响 |
| 1.实验材料 |
| 2.实验方法 |
| 3.实验结果 |
| 4.讨论 |
| 5.小结 |
| 结论 |
| 本文创新点 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 在学期间主要研究成果 |
| 个人简介 |
（6）激活素A参与缺血性脑损伤小胶质细胞极化表型变化的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩略词表 |
| 第1章 前言 |
| 第2章 文献综述 |
| 2.1 小胶质细胞研究进展 |
| 2.1.1 小胶质细胞的活性状态 |
| 2.2 小胶质细胞与缺血性脑损伤 |
| 2.2.1 小胶质细胞参与缺血性脑损伤的神经免疫反应 |
| 2.2.2 小胶质细胞参与缺血性脑损伤的神经炎症反应 |
| 2.3 Activin A/Smads信号通路在缺血性脑损伤中作用的研究进展 |
| 2.3.1 ActivinA/Smads信号转导 |
| 2.3.2 ActivinA参与缺血性脑损伤的病理生理过程 |
| 2.3.3 ActivinA与小胶质细胞 |
| 第3章 局灶性缺血性脑损伤中Act A/Smads信号通路的表达变化 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 实验动物 |
| 3.1.2 主要试剂 |
| 3.1.3 主要仪器 |
| 3.1.4 大脑中动脉阻塞局灶性脑缺血模型建立 |
| 3.1.5 神经功能评分 |
| 3.1.6 脑梗死体积测定 |
| 3.1.7 苏木精—伊红染色 |
| 3.1.8 Western blot |
| 3.1.9 实时荧光定量PCR (Quantitative Realtime-PCR) |
| 3.1.10 统计学分析 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 MCAO模型不同缺血时间后的神经功能评分 |
| 3.2.2 脑梗死体积测定 |
| 3.2.3 脑组织神经元病理形态改变 |
| 3.2.4 MCAO模型不同缺血时间组ActA基因表达 |
| 3.2.5 MCAO模型不同缺血时间组ActRⅡ基因表达 |
| 3.2.6 MCAO模型不同缺血时间组Smad2蛋白表达 |
| 3.2.7 MCAO模型不同缺血时间组Smad7蛋白表达 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 第4章 局灶性缺血性脑损伤小胶质细胞表型变化研究 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 实验动物及动物模型建立 |
| 4.1.2 主要试剂 |
| 4.1.3 主要仪器 |
| 4.1.4 免疫组化分析 |
| 4.1.5 实时荧光定量PCR(Quantitative Realtime-PCR) |
| 4.1.6 统计学分析 |
| 4.2 结果 |
| 4.2.1 MCAO模型不同组别M1型标志物iNOS基因表达 |
| 4.2.2 MCAO模型不同组别M1型标志物CD86基因表达 |
| 4.2.3 MCAO模型不同组别M2型标志物CD206基因表达 |
| 4.2.4 MCAO模型不同组别M2型标志物Arg-1基因表达 |
| 4.2.5 iNOS和CD206免疫组织化学染色结果 |
| 4.2.6 神经元细胞标志物NeuN、小胶质细胞标志物Iba1免疫组织化学 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 小结 |
| 第5章 ACTA对局灶性缺血性脑损伤小胶质细胞表型变化的影响 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 实验动物 |
| 5.1.2 主要试剂 |
| 5.1.3 主要仪器 |
| 5.1.4 大脑中动脉阻塞局灶性脑缺血模型建立 |
| 5.1.5 侧脑室微量注射 |
| 5.1.6 实时荧光定量PCR(Quantitative Realtime-PCR) |
| 5.1.7 免疫组化分析 |
| 5.1.8 神经功能评分 |
| 5.1.9 脑梗死体积测定 |
| 5.1.10 统计学分析 |
| 5.2 结果 |
| 5.2.1 神经功能评分 |
| 5.2.2 脑梗死体积 |
| 5.2.3 ActA干预后各组M1型标志物iNOS基因表达 |
| 5.2.4 Act A干预后各组M2型标志物CD206基因表达 |
| 5.2.5 Act A干预后各组Act A/Smads信号通路Smad3、ActRⅡ的基因表达 |
| 5.2.6 Act A干预后各组iNOS和CD206免疫组织化学染色结果 |
| 5.3 讨论 |
| 5.4 小结 |
| 第6章 ACTA对小胶质细胞体外OGD/R过程中M1、M2表型表达的影响 |
| 6.1 材料与方法 |
| 6.1.1 实验细胞 |
| 6.1.2 主要试剂 |
| 6.1.3 主要仪器 |
| 6.1.4 BV2细胞OGDR模型建立 |
| 6.1.5 Wsstern blot |
| 6.1.6 ActA给药方法 |
| 6.1.7 CCK8检测细胞活力 |
| 6.1.8 统计学分析 |
| 6.2 结果 |
| 6.2.1 OGD/R损伤对BV2细胞活力的影响 |
| 6.2.2 Act A/Smads信号通路在BV2细胞OGD/R损伤后的表达 |
| 6.2.3 小胶质细胞表型标志物在BV2细胞OGD/R损伤后的表达 |
| 6.2.4 ActA干预BV2细胞OGD/R过程Act A/Smads信号通路及小胶质细胞标志物表达 |
| 6.3 讨论 |
| 6.4 小结 |
| 第7章 结论 |
| 创新点 |
| 参考文献 |
| 作者简介及在学期间所取得的科研成果 |
| 致谢 |
（7）益气活血中药联合骨髓间充质干细胞促进缺血性脑卒中血管新生的作用与机制（论文提纲范文）
| 0引言Introduction |
| 1 资料和方法Data and methods |
| 1.1 文献检索和筛选要求 |
| 1.2 文献筛选标准 |
| 1.3 质量评估及数据的提取 |
| 2 结果Results |
| 2.1 血管新生的概念和影响因素 |
| 2.2 益气活血类中药联合骨髓间充质干细胞对缺血性脑卒中血管新生的影响 |
| 2.2.1 益气活血类中药联合骨髓间充质干细胞对血管内皮生长因子及血管内皮生长因子A的影响 |
| 2.2.2 益气活血类中药联合骨髓间充质干细胞对缺氧诱导因子1α的影响 |
| 2.2.3 益气活血类中药联合骨髓间充质干细胞对血管生成素的影响 |
| 2.2.4 益气活血类中药联合骨髓间充质干细胞对脑源性神经营养因子的影响 |
| 2.2.5 益气活血类中药联合骨髓间充质干细胞对碱性成纤维细胞生长因子的影响 |
| 2.2.6 益气活血类中药联合骨髓间充质干细胞对整合素αvβ3的影响 |
| 2.2.7 益气活血类中药联合骨髓间充质干细胞对基质金属蛋白酶9的影响 |
| 2.2.8 益气活血类中药联合骨髓间充质干细胞对Wnt信号通路的影响 |
| 2.2.9 益气活血类中药联合骨髓间充质干细胞对Notch信号通路的影响 |
| 2.2.1 0 益气活血类中药联合骨髓间充质干细胞对PI3K/Akt信号通路的影响 |
| 3 小结Conclusions |
（8）电针结合NeuroD1基因疗法修复缺血性脑中风的机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 引言 |
| 第一部分 文献研究 |
| 1.1 缺血性脑中风的致病机制 |
| 1.1.1 兴奋性氨基酸毒性作用 |
| 1.1.2 缺血性脑中风与氧化、硝化应激损伤 |
| 1.1.3 缺血性脑中风与炎症反应 |
| 1.1.4 缺血性脑中风与细胞凋亡 |
| 1.1.5 缺血性脑中风与细胞自噬 |
| 1.2 神经再生技术对缺血性脑中风的研究进展 |
| 1.2.1 内源性干细胞移植 |
| 1.2.2 外源性干细胞移植 |
| 1.2.3 基因治疗转化重编技术 |
| 1.3.针灸疗法通过调控大脑可塑性改善缺血性脑中风的机制研究 |
| 1.3.1 针刺调控内源性干细胞增殖和分化成功能性神经元治疗缺血性脑中风 |
| 1.3.2 针刺调控突触可塑性治疗缺血性脑中风 |
| 1.3.3 针刺调节神经血管营养因子改善微环境治疗缺血性脑中风 |
| 第二部分 实验研究 |
| 2.1 缺血性脑中风模型的建立与评价 |
| 2.1.1 实验材料 |
| 2.1.2 实验方法 |
| 2.1.3 实验结果 |
| 2.1.4 实验讨论 |
| 2.2 神经转录因子NEUROD1将星形胶质细胞重编为功能性神经元的机制研究 |
| 2.2.1 实验材料 |
| 2.2.2 实验方法 |
| 2.2.3 实验方法 |
| 2.2.4 实验讨论 |
| 2.3 神经转录因子NEUROD1对MCAO小鼠应激星形胶质细胞转化功能性神经元的机制研究 |
| 2.3.1 实验材料 |
| 2.3.2 实验方法 |
| 2.3.3 实验结果 |
| 2.3.4 实验讨论 |
| 2.4 电针结合神经转录因子NEUROD1将应激星形胶质细胞重编成神经元修复缺血性脑中风的机制研究 |
| 2.4.1 实验材料 |
| 2.4.2 实验方法 |
| 2.4.3 实验结果 |
| 2.4.4 实验讨论 |
| 第三部分 小结 |
| 3.1 结论 |
| 3.2 本研究创新点 |
| 3.3 不足与展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 附录1: 缩略词 |
| 附录2: 随机数字表 |
| 在校期间发表论文情况 |
| 发表论文 |
| 参与课题情况 |
| 获得奖励 |
| 致谢 |
| 附件1:统计学处理合格证明 |
（9）BDNF在记忆消退及缺血性脑卒中诱导的记忆损伤中的作用机制（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 符号说明 |
| 第一部分 岛叶BDNF在条件性味觉厌恶记忆消退中作用的研究 |
| 前言 |
| 实验材料 |
| 实验方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 附图 |
| 参考文献 |
| 第二部分 BDNF分泌及其调控分子在缺血性脑卒中记忆损伤中的作用 |
| 前言 |
| 实验材料 |
| 实验方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 附图 |
| 参考文献 |
| 综述 BDNF及其调控分子在脑卒中功能障碍中作用的研究进展 |
| 参考文献 |
| 创新点及局限性 |
| 研究结论 |
| 致谢 |
| 攻读博士学位期间的学术成果 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
| 英文文章一 |
| 英文文章二 |
（10）脂联素通过cAMP/PKA-CREB-BDNF通路抗脑缺血-再灌注损伤及其机制研究（论文提纲范文）
| 缩略语表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 文献回顾 |
| 第一部分 脂联素对小鼠脑缺血再灌注损伤后的保护作用 |
| 1 材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 主要实验器材 |
| 1.3 主要实验试剂 |
| 1.4 主要实验试剂配制 |
| 2 方法 |
| 2.1 小鼠MCAO模型的建立 |
| 2.2 实验方案及分组 |
| 2.3 TTC染色及脑梗死体积测定 |
| 2.4 神经功能评分 |
| 2.5 脑水含量测定 |
| 2.6 TUNEL染色 |
| 2.7 蛋白质免疫印迹 |
| 2.8 数据统计分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 脂联素减少脑缺血再灌注损伤后的脑梗死体积 |
| 3.2 脂联素改善脑缺血再灌注损伤后的神经功能评分 |
| 3.3 脂联素减轻脑缺血再灌注损伤后的脑水肿程度 |
| 3.4 脂联素抑制缺血半暗带区域的细胞凋亡 |
| 3.5 脂联素抑制凋亡通路的激活 |
| 4 讨论 |
| 第二部分 CAMP/PKA通路在脂联素脑保护效应中的作用机制 |
| 1 材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 主要实验器材 |
| 1.3 主要实验试剂 |
| 1.4 主要实验试剂配制 |
| 2 方法 |
| 2.1 小鼠MCAO模型的建立 |
| 2.2 实验方案及分组 |
| 2.3 TTC染色及脑梗死体积测定 |
| 2.4 神经功能评分 |
| 2.5 脑水含量测定 |
| 2.6 TUNEL染色 |
| 2.7 蛋白质免疫印迹 |
| 2.8 免疫荧光染色 |
| 2.9 数据统计分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 脂联素在缺血再灌注损伤后激活c AMP/PKA通路 |
| 3.2 PKA抑制剂的干预抑制脂联素对c AMP/PKA通路的激活效应 |
| 3.3 PKA抑制剂干预后,脂联素减小脑梗死体积的效应被抑制 |
| 3.4 PKA抑制剂干预后,脂联素改善神经功能评分的效应被抑制 |
| 3.5 PKA抑制剂干预后,脂联素减轻脑水肿的效应被抑制 |
| 3.6 PKA抑制剂的干预抑制脂联素的抗细胞凋亡效应 |
| 3.7 PKA抑制剂的干预抑制了脂联素对凋亡通路的激活 |
| 4 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 个人简历和研究成果 |
| 致谢 |
四、Effect of the antibody of brain-derived neurotrophic factor on the rat with ischemic injury from obstruction of middle cerebral artery（论文参考文献）
- [1]额尔敦-乌日勒的活性成分分析及其对小胶质细胞基因调控作用的研究[D]. 其布日. 内蒙古大学, 2021(11)
- [2]“治神调形”下头针对缺血性中风痉挛大鼠BDNF/TrkB/CREB及PI3K/Akt/GSK-3β通路影响的研究[D]. 胡冠宇. 长春中医药大学, 2021(01)
- [3]舒血宁注射液在缺血性脑卒中预后的药效评价及作用机制研究[D]. 李志雄. 天津中医药大学, 2021(01)
- [4]丹参多酚酸通过小胶质细胞P2X7/NLRP3/GSDMD通路减轻实验性脑缺血再灌注损伤研究[D]. 马岱朝. 辽宁中医药大学, 2021(02)
- [5]头穴丛刺治疗中风后肢体痉挛的临床观察及其抗痉挛效应机理研究[D]. 张琼帅. 长春中医药大学, 2021(01)
- [6]激活素A参与缺血性脑损伤小胶质细胞极化表型变化的研究[D]. 刘洪雨. 吉林大学, 2020(04)
- [7]益气活血中药联合骨髓间充质干细胞促进缺血性脑卒中血管新生的作用与机制[J]. 樊飞燕,张运克. 中国组织工程研究, 2021(13)
- [8]电针结合NeuroD1基因疗法修复缺血性脑中风的机制研究[D]. 吴春晓. 广州中医药大学, 2020(02)
- [9]BDNF在记忆消退及缺血性脑卒中诱导的记忆损伤中的作用机制[D]. 刘殿玮. 山东大学, 2020(12)
- [10]脂联素通过cAMP/PKA-CREB-BDNF通路抗脑缺血-再灌注损伤及其机制研究[D]. 白浩. 中国人民解放军空军军医大学, 2019(06)