一、补肾益精的分子生物学研究（论文文献综述）
上海中医药大学“慢性筋骨病研究中心”[1]（2021）在《慢性筋骨病的防治研究——上海中医药大学王拥军教授团队研究思路与方法概述》文中进行了进一步梳理王拥军教授、施杞教授领衔的"慢性筋骨病研究中心"隶属于上海中医药大学,依托于上海中医药大学脊柱病研究所,中心主任为王拥军教授（图1）。中心整合了筋骨理论与治法教育部重点实验室、国家中医药管理局脊柱退变肾骨相关重点研究室、国家中医药管理局脊柱病理三级实验室、石筱山伤科学术研究中心、石仰山国医大师伤科学术工作室、施杞名中医工作室、石仰山国医大师名中医学术经验研究工作室、王拥军劳模创新团队工作室、王拥军岐黄学者传承与创新工作室,并承担了国家重点学科、国家临床重点专科、国家中医临床研究基地、
曹[2]（2021）在《基于ROS-MAPK-线粒体途径探讨补肾益精方治疗少弱精子症的作用机制》文中指出少弱精子症（Oligozoospermia and Asthenozoospermia,OAZS）主要表现为精子密度和精子活力的下降,约占男性不育的50%～75%,是引起男性不育的重要原因之一。各种因素如不良生活方式、精索静脉曲张、系统疾病、遗传变异、激素异常、环境污染等都会不同程度地影响男性的生殖功能,且它们之间常常共存,导致精液中活性氧（reactive oxygen species,ROS）的产生和精浆中抗氧化能力之间的动态平衡失调,引起氧化应激损伤,降低精子质量水平。OAZS生殖系统内过多的氧自由基、高活性氧的状态可以看作是中医学“血瘀”证候的一种表现形式,而“肾虚”则是“血瘀”的重要病因,正如《医林改错》中记载:“元气即虚,必不能达于血管,血管无气必停留而为瘀”。因此贾金铭教授认为“肾虚血瘀”是导致OAZS的基本病机,并以补肾活血,填髓益精立法创制了补肾益精方（YJD）,临床应用多年,疗效确切,可显着提高精子密度、精子活力及正常形态率等。本研究采用网络药理学与数据挖掘技术分析YJD的潜在药理机制,并以环磷酰胺复制的OAZS小鼠模型和体外培养的Leydig细胞及Sertoli细胞为载体,以ROS-OS-p38MAPK-线粒体途径为研究主线,探讨YJD抑制氧化应激损伤,提高精子质量的作用及机制。目的:传承创新名老中医学术经验,采用网络药理学方法探讨YJD治疗OAZS的作用机制,并通过体内外实验明确YJD抑制氧化应激损伤和细胞凋亡的作用,从ROS-OS-p38MAPK信号途径深入探讨其作用机制。方法:1 网络药理学分析:通过 TCMSP、Swiss Target Preduction、Pharm Mapper、UniProt、CTD、Genecards、String、David 等数据库;将 YJD12 种中草药采用MW≤500,AlogP≤10,Hdon≤5,HACC≤10,OB≥30%,DL≥0.18,CaCO-2≥-0.4七种仿制药原则筛选出这些成分中潜在的活性化合物及相对应的药物靶点,检索少弱精子症相关靶基因,两组交叉获取重合靶点,进行GO-BP及KEGG分析,从有效成分、潜在靶点、关键途径三个方面分析YJD治疗弱精子症的潜在药理机制。2动物实验:以环磷酰胺复制少弱精子症小鼠模型,通过睾丸--生精小管--睾丸间质细胞/支持细胞--线粒体--凋亡相关分子等多层次进行研究;采用ELISA、HE染色、细胞计数、流式分析、透射电镜、Western blot等手段,检测睾丸指数,生精小管形态及超微结构,血清TT、FT、LH、FSH,雄激素生成及利用相关蛋白 STAR、P450Scc、AR、ABP,睾丸/附睾组织ROS、MDA、SOD、GSH-Px,线粒体膜结构及功能,p38MAPK信号通路相关因子BAX、Bcl-2、Cyt-C、Caspase3等多纬度进行实验。3细胞实验:分别以TM3细胞（体外培养）和Sertoli细胞（原代提取）为研究对象,并制备YJD含药血清进行干预;采用siRNA干扰技术敲减目标基因p38MAPK,PCR检测敲减p38MAPK效率,CCK8检测细胞增殖情况,western blot检测敲减p38MAPK后相关指标的变化,从睾酮的合成分泌与利用两个方面进行实验。结果:1通过筛选,YJD12味中药共获得75个有效成分,对应190个潜在靶点;检索少弱精子症靶点共1125个（含少精子症713个,弱精子症412个）;两组交叉获得重合靶点30个;对30个重合基因进行拓扑分析,共获得9个核心指标:MAPK1、AR、ESR1、AKT1、MAPK8、EGFR、MMP9、PTGS2 和 MAPK14。30个重合靶点富集分析主要涉及细胞对脂质、有机化合物、有毒物质、活性氧、类固醇激素的反应;细胞对激素刺激、氧化应激、外界刺激、炎症反应的反应;及生殖系统/结构调节等生物学过程;及MAPK信号通路、胰岛素信号通路、TNF信号通路、雌激素信号通路、P53信号通路、神经营养蛋白信号通路、T细胞受体信号转导途径、cAMP信号通路及FoxO、VEGF等信号通路。2环磷酰胺建立少弱精子症模型小鼠的睾丸指数及体积减小（P<0.05,P<0.01）;精子密度和活力下降（P<0.01）;血清TT、FT水平下降（P<0.01）,血清FSH、LH水平增加（P<0.01）;睾丸及附睾组织中ROS、MDA含量明显增加（P<0.01）,SOD、GSH-Px含量减少（P<0.01）;生精小管结构紊乱;线粒体结构和功能下降;p38MAPK、Caspase3、BAX、Cyt-C蛋白表达水平增加（P<0.05,P<0.01）,Bcl-2、STAR、P450scc、AR、ABP 蛋白表达水平降低（P<0.05,P<0.01）;给予YJD治疗后,OAZS模型小鼠睾丸指数无明显变化（P>0.05）,睾丸体积增加（P<0.01）;精子密度和活力增加（P<0.01）;血清TT、FT水平增加（P<0.01）,血清FSH、LH水平降低（P<0.01）;睾丸及附睾组织中ROS、MDA含量明显减少（P<0.01）,SOD、GSH-Px含量增加（P<0.01）;生精小管结构及线粒体结构和功能改善;p38MAPK、Caspase3、BAX、Cyt-C蛋白表达水平降低（P<0.05,P<0.01）,Bcl-2、STAR、P450scc、ABP 蛋白表达水平增加（P<0.05,P<0.01）;AR蛋白水平无明显变化（P>0.05）。3 在敲减 TM3 细胞中 p38MAPK 后,p38MAPK、Caspase3、Cyt-C、STAR及P450scc蛋白水平表达量均明显下调（P<0.05）,BAX和Bcl-2蛋白相对表达量无明显变化（P>0.05）;以10%YJD含药血清干预细胞12h后,上述除Bcl-2上调外,其他指标蛋白表达水平再次出现明显下调（P<0.01）。在敲减Sertoli细胞中 p38MAPK 后,p38MAPK、Caspase3、Cyt-C、BAX 及 AR 蛋白水平表达量均明显下调（P<0.05）,ABP及Bcl-2蛋白相对表达量无明显变化;以10%YJD含药血清干预细胞12h后,p38MAPK、Caspase3、Cyt-C及BAX蛋白水平表达量再次明显下调（P<0.01）,Bcl-2蛋白相对表达量明显上调（P<0.05）,AR及ABP蛋白相对表达量无明显变化（P>0.05）。结论:补肾益精方（YJD）能够通过ROS/OS/p38MAPK-线粒体途径改善环磷酰胺制备少弱精子症（OAZS）小鼠模型,及Leydig细胞和Sertoli细胞模型的氧化应激（OS）损伤,改善线粒体结构及功能,从睾酮的分泌合成与利用等方面,促进精子发生和成熟,提高精子密度和活力,治疗少弱精子症。
杨欢[3]（2021）在《右归饮益精生血的作用机制及其与EPO的相关性》文中进行了进一步梳理背景《素问·阴阳应象大论》曰“肾生骨髓,髓生肝”。五行之中,肾属水为母,肝属木为子,其“髓生肝”即肾精化生肝血,为母子相生关系的体现。肝藏血,肾藏精,精血可以互化,故“精血同源”。右归饮是经典的补肾益精方,具有阴阳双补、填精补血的功效。课题组假设“促红细胞生成素（EPO）可能是肾精的重要物质基础,可作为肾精的生物学标志物”,并在抗衰、健脑、健骨、改善生殖功能低下、增强免疫等方面验证了补肾益精中药改善肾精亏虚动物体质的同时逆转了EPO的降低。本课题拟研究右归饮对肾精亏虚贫血大鼠模型的改善作用及其与EPO的相关性,以期进一步验证“EPO可作为肾精的生物学标志物”的假设。本课题受到国家自然科学基金面上项目（81473549）资助。目的观察右归饮对肾精亏虚贫血大鼠模型的改善作用及其与EPO的相关性,阐释右归饮“益精生血”疗效的生物学作用机制。方法1.腺嘌呤致肾精亏虚贫血大鼠模型的复制方法:用200 mg·kg-1的腺嘌呤悬液灌胃雄性SD大鼠连续3周后,再每隔一日灌胃持续8周以维持模型。2.模型成功判定标准:（1）肾精亏虚检测指标:检测大鼠血清中肌酐（CREA）、尿素（UREA）、尿素氮（BUN）、促肾上腺皮质激素释放激素（CRH）、促肾上腺皮质激素（ACTH）、皮质酮（CORT）、三碘甲状腺原氨酸（T3）、四碘甲状腺原氨酸（T4）、甲状旁腺激素（PTH）、镁（Mg）、磷（P）、葡萄糖（Glu）、铁（Fe）、白介素-1（IL-1）、白介素-6（IL-6）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和肌酐清除率。（2）贫血检测指标:检测大鼠全血中的红细胞数目（RBC）、红细胞压积（HCT）、血红蛋白（HGB）。每只大鼠与正常组大鼠均值相比,取以上值均出现显着性差异的大鼠,作为造模成功的大鼠,纳入下一步试验。3.模型成功动物分组并均衡性检验及给药:将模型成功的大鼠随机分为模型组和右归饮10 g·kg-1、20 g·kg-1、40 g·kg-1三个剂量组和rh EPO组。分组之后,给药之前,对各组动物的模型成功判定标准指标进行均衡性检验,统计学结果显示无显着性差异后方给予药物。第4周开始,右归饮各组每日上午灌胃相应剂量的右归饮配方颗粒液,rh EPO组三日一次皮下注射500 IU·kg-1的rh EPO,连续给药8周,同时除正常组以外,各组均每隔一日下午灌胃200 mg·kg-1腺嘌呤以维持模型。4.右归饮对肾精亏虚贫血大鼠模型的改善作用的观察指标及检测方法:（1）观察各组动物肾脏组织大体形态学,肾脏进行石蜡切片制作HE染色和Masson染色观察其组织形态学。（2）全自动血液生化仪检测血清中CREA、UREA、Mg、P、Glu、甘油三酯（TG）、碱性磷酸酶（ALP）和尿液中CREA、UREA、总蛋白（TP）的含量。（3）酶联免疫法测定血清中CRH、ACTH、CORT、T3、T4、PTH、Fe、Hepcidin、IL-1、白介素-2（IL-2）、IL-6、TNF-α的含量。（4）兽用全自动血细胞分析仪检测血液中RBC、HCT、HGB、平均红细胞体积（MCV）、平均红细胞血红蛋白浓度、白细胞数目（WBC）、单核细胞数目、单核细胞百分比、中性粒细胞数目、淋巴细胞百分比、PLT、PCT的含量。（5）免疫荧光和免疫印迹法检测肾脏中α-SMA的相对表达量。（6）免疫组化和免疫印迹法检测肾脏中TGFβ的相对表达量。（7）免疫荧光法检测肾脏中PDGFRβ的相对表达量。5.血清和肾脏中EPO含量及肾脏中EPO信号通路的检测方法:（1）酶联免疫法测定血清和肾脏中EPO的含量。（2）免疫印迹法检测肾脏中EPO相关通路中PHD2、GATA2、HIF2α、PI3K、AKT、p-AKT、m TOR、p-m TOR、HIF1α、EPOR、JAK2、p-JAK2、STAT5、p-STAT5蛋白的相对表达量。结果1.腺嘌呤致模型组大鼠体质及肾功能显着降低。与正常组相比,模型组大鼠毛色更暗淡,精神更加萎靡不振,体重增长更缓慢,24 h尿液更加清澈,24 h尿量显着增多（P<0.01）,肾脏颜色苍白、肿大,表现为“大白肾”,肾脏指数和肾上腺指数显着升高（均P<0.01）,血清中CRH、ACTH、CORT、T3、PTH、Mg、P、ALP、Hepcidin显着升高（P<0.05）,血清中T4、Glu、TG、Fe显着降低（P<0.05）,表明模型大鼠体质降低;与正常组相比,模型组大鼠尿液中CREA、UREA、TP显着降低（P<0.01或P<0.05）,血清中CREA、UREA、BUN显着升高（P<0.05）,肌酐清除率显着降低（P<0.01）,表明模型大鼠肾功能降低。2.腺嘌呤致模型组大鼠出现显着贫血、炎症及肾纤维化。与正常组相比,模型组大鼠血液中RBC、HCT、HGB、MCV、淋巴细胞百分比显着降低（P<0.05或P<0.01）,平均红细胞血红蛋白浓度、WBC、单核细胞数目、单核细胞百分比、中性粒细胞数目显着升高（P<0.05或P<0.01）,表明模型大鼠出现贫血症状。与正常组相比,模型组大鼠血清中IL-1、IL-6、TNF-α显着升高（P<0.01）,IL-2显着降低（P<0.01）,表明模型大鼠出现了炎症。与正常组相比,模型组大鼠肾脏中胶原容积分数显着升高（P<0.01）,肾脏中TGFβ、α-SMA、PDGFRβ相对表达量显着升高（均P<0.05）,表明模型大鼠肾脏发生了纤维化。3.腺嘌呤致肾精亏虚贫血大鼠EPO含量显着降低,EPO通路蛋白显着异常。与正常组相比,模型组大鼠血清和肾脏中EPO含量显着降低（P<0.05）;肾脏中PHD2、GATA2蛋白表达显着升高（均P<0.05）,HIF2α、p-AKT、m TOR、p-m TOR、HIF1α、JAK2、p-JAK2、STAT5、p-STAT5显着降低（P<0.05或P<0.01）。4.右归饮能显着改善肾精亏虚贫血大鼠的体质。与模型组相比,右归饮组大鼠的毛色、精神状态得到改善,体重增长较快,肾脏的组织形态学得到改善,肾脏指数显着降低（P<0.05）,右归饮组血清中CRH、ACTH、CORT、T3、PTH、Mg、P、ALP、Hepcidin显着降低（P<0.05或P<0.01）,Fe显着升高（P<0.05）,右归饮10 g·kg-1组、20 g·kg-1组T4显着升高（P<0.05）,右归饮20 g·kg-1组、40 g·kg-1组的Glu显着升高（P<0.05）,表明右归饮能显着改善肾精亏虚贫血大鼠模型的体质。5.右归饮能显着改善肾精亏虚贫血大鼠的肾功能。与模型组相比,右归饮10 g·kg-1组尿液中UREA显着升高（P<0.05）,右归饮40 g·kg-1组尿液中TP显着升高（P<0.01）,右归饮组血清中CREA、UREA、BUN显着降低（P<0.05）,右归饮20 g·kg-1组肌酐清除率显着升高（P<0.05）,表明右归饮能改善肾精亏虚贫血大鼠模型的肾功能。6.右归饮能显着改善肾精亏虚贫血大鼠血常规指标。与模型组相比,右归饮10 g·kg-1组、20 g·kg-1组大鼠血液中的RBC、HCT、HGB显着升高（P<0.05或P<0.01）,右归饮20 g·kg-1组的MCV显着升高（P<0.05）,右归饮20 g·kg-1组的平均红细胞血红蛋白浓度显着降低（P<0.05）,右归饮10 g·kg-1组的WBC显着降低（P<0.01）,右归饮20 g·kg-1组的单核细胞数目、单核细胞百分比、中性粒细胞数目显着降低（均P<0.05）,右归饮20 g·kg-1组的淋巴细胞百分比显着升高（P<0.05）。7.右归饮能显着改善肾精亏虚贫血大鼠的炎症指标。与模型组相比,右归饮组血清中IL-1、IL-6、TNF-α显着降低（P<0.05）,右归饮组IL-2显着升高（P<0.01）。8.右归饮能显着改善肾精亏虚贫血大鼠的肾脏纤维化。与模型组相比,右归饮组胶原容积分数显着降低（P<0.05）,右归饮组肾脏中的TGFβ、α-SMA、PDGFRβ相对表达量显着降低（均P<0.05）,表明右归饮可以减轻模型大鼠的肾脏纤维化程度。9.右归饮能显着逆转肾精亏虚贫血大鼠的EPO含量及信号通路异常。与模型组相比,右归饮20 g·kg-1组、40 g·kg-1组大鼠血清中EPO含量显着升高（P<0.01）,右归饮10 g·kg-1组、20 g·kg-1组、40 g·kg-1组肾脏中EPO含量显着升高（均P<0.05）,右归饮20 g·kg-1组PHD2、GATA2蛋白相对表达量显着降低（P<0.05）,右归饮各组HIF2α、p-AKT、p-JAK2蛋白相对表达量显着升高（均P<0.05）,右归饮20 g·kg-1组、40 g·kg-1组PI3K、HIF1α蛋白相对表达量显着升高（均P<0.05）,右归饮40 g·kg-1组m TOR蛋白表达显着升高（P<0.05）,右归饮10 g·kg-1组p-m TOR蛋白表达显着升高（P<0.05）,右归饮20 g·kg-1组STAT5蛋白相对表达量显着升高（P<0.05）。结论1.200 mg·kg-1腺嘌呤连续灌胃3周,间隔灌胃8周后,能成功复制肾精亏虚贫血大鼠模型。2.该模型动物血清中EPO含量和肾脏中EPO蛋白表达均显着下降,PHD2/HIF2α,PI3K/AKT/m TOR/HIF1α及JAK2/STAT5通路中蛋白含量发生显着变化,显示了肾精亏虚贫血与EPO具有显着的相关性。3.补肾益精经典名方右归饮可显着改善肾精亏虚贫血大鼠模型的肾功能、炎症、肾纤维化及血常规指标,其机制可能与升高血清中EPO、肾脏中EPO的含量,调节PHD2/HIF2α,PI3K/AKT/m TOR/HIF1α及JAK2/STAT5通路中蛋白含量有关。4.上述结果证明了补肾益精名方右归饮具有益精生血的作用,为中医理论“精血同源”提供了一个实验支撑,支持“EPO可作为肾精生物学标志物”的假设。
王世平,李倩云,崔言秀,吕涛,徐光玉,王策正[4]（2020）在《补肾益精汤对弱精症大鼠精子线粒体功能的影响及其相关机制研究》文中提出目的:研究补肾益精汤对大鼠精子线粒体呼吸功能及能量代谢的影响,并从基因水平分析其可能的相关机制。方法:随机数字表法将100只SD雄性大鼠分为正常对照组（A组）、雷公藤多苷组（B组）、生理盐水组（C组）、左卡尼汀组（D组）及补肾益精汤组（E组）,每组20只。A组大鼠每日灌胃生理盐水[1 mL/（kg·d）],B、C、D、E组每日灌胃雷公藤多苷[20 mg/（kg·d）],共21 d,处死A、B两组大鼠,然后C组每日灌胃生理盐水[1 mL/（kg·d）],D组每日灌胃左卡尼汀[50 mg/（kg·d）],E组每日灌胃补肾益精汤[3 g/（kg·d）],共35 d,处死C、D、E三组大鼠。获取各组大鼠精液标本,检测精液精子运动参数、细胞线粒体呼吸控制率（RCR）及精子细胞ATP含量,同时检测各组精子细胞特异性钙通道CatSper1基因含量,分析E组RCR、ATP分别与CatSper1 RNA含量的相关性。结果:与A组比较,B组的精子密度、a+b级百分率及存活率均明显下降（P<0.01）。与C组比较,D组、E组a+b级精子百分率明显提高（P<0.01）。RCR、ATP含量及CatSper1 RNA均提高。D、E组的精子RCR分别为（4.39±0.42 vs 5.15±0.39）μmol·min-1·g-1,ATP含量分别为（4.02±0.50 vs 5.82±0.40）μg/g,CatSper1 RNA分别为（2.18±0.28 vs 2.64±0.28）ng/μL,差异均具有统计学意义（P<0.01）。E组大鼠的RCR、ATP含量与CatSper1 RNA均呈正相关（r=0.912、0.893,P <0.05）。结论:雷公藤多苷可成功制备弱精子症大鼠模型;补肾益精汤可明显提高弱精症大鼠的精子活动力,增加其精子呼吸功能及能量代谢,其机制可能与增加特异性钙通道CatSper1 RNA基因的表达有关。
马丹凤[5]（2020）在《促孕安怡方对初老雌性大鼠卵巢储备功能及子宫内膜容受性影响的实验研究》文中提出目的促孕安怡方是黎烈荣教授在更年安怡方的基础上,针对高龄女性生育力下降化裁而成,在前期临床观察研究已取得较好的疗效的基础上,我们以自然衰老的雌性大鼠（10-12月龄）为初老模型,观察促孕安怡方对初老模型大鼠卵巢储备功能和子宫内膜容受性的影响,并对其机理作初步研究,为促孕安怡方在生育力下降的高龄女性中的临床应用提供实验数据及坚实的理论依据。方法选取自然衰老的10-12月龄的大鼠为研究对象进行造模。将造模成功的大鼠随机分为二组,分别为:初老模型组和初老药物组,另外一组为正常对照组（4-6月龄大鼠）。每组的给药方式如下所示:A组（正常对照组）:灌服等体积纯化水12.73ml/kg,每日1次,连续15日;B组（初老模型组）:灌服等体积纯化水10.82ml/kg,每日1次,连续15日;C组（初老药物组）:灌服促孕安怡方,剂量10.82ml/kg,每日1次,连续共15日;实验包括四个部分。第一部分实验为:初老大鼠模型的建立与评价。通过15天对自然衰老雌性大鼠（10-12月龄）进行阴道脱落细胞涂片观察,选取阴道脱落细胞涂片表现为动情间期延长或动情周期紊乱者作为初老雌性大鼠模型。第二部分实验为:研究促孕安怡方对初老雌性大鼠生殖内分泌调控的影响。各组大鼠分别于给药15日后,麻醉,开腹,腹主动脉取血。用酶联免疫吸附法（ELISA）检测大鼠血清抗苗勒氏管激素（AMH）、抑制素B（INH-B）、雌二醇（E2）、促卵泡刺激素（FSH）和促黄体生成素（LH）水平。第三部分实验为:研究促孕安怡方对初老雌性大鼠的卵巢组织形态学及卵巢干细胞因子（SCF）和生长分化因子9（GDF-9）表达的影响。将实验二取血后的大鼠,剖取卵巢组织,称重并计算脏器指数;苏木素-伊红（HE）病理切片,在显微镜下观察卵巢结构,各期卵泡及黄体数目;蛋白质印迹法（Western Blot）检测卵巢干细胞因子（SCF）和生长分化因子9（GDF-9）的蛋白定量表达水平。第四部分实验为:研究促孕安怡方对初老雌性大鼠的子宫内膜组织形态学及对白血病抑制因子（LIF）、HOXA-10mRNA表达的影响。将实验二取血后的大鼠,剖取子宫组织,称重并计算脏器指数;苏木素-伊红（HE）病理切片,在显微镜下观察子宫内膜厚度,腺体数量和结构;制备透射电镜切片,观察胞饮突;免疫组化HRP法测定子宫内膜LIF的表达;实时荧光定量PCR法测HOXA-1OmRNA含量。酶联免疫吸附法（ELISA）,它以免疫学反应为基础,使抗原或抗体结合到某种固相载体表面,并保持其免疫活性。然后洗涤除去多余的游离反应物,通过显色,用酶标仪在450nm波长测量各孔的光密度（OD值）,绘制出标准曲线,同时计算出待测定物的浓度。ELISA分为多种方法,本文用双抗夹心法检测大鼠血清AMH、INH-B、FSH和LH,用竞争法检测E2。用苏木素-伊红染色法（hematoxylin-eosin staining,HE）和免疫组织化学染色法处理标本组织石蜡切片后,在显微镜下观察并记录图像。本文,此法主要用于观察卵巢和子宫内膜的细胞形态及卵巢LIF蛋白的表达。蛋白质印迹法（Western Blot）是把蛋白转移到膜上,再用抗体进行检测的方法。本文主要用此法检测卵巢干细胞因子（SCF）和生长分化因子9（GDF-9）的蛋白定量表达水平。实时荧光定量PCR（Quantitative Real-time PCR）是指一种在DNA扩增反应中,于聚合酶链式反应（PCR）体系中加入荧光基团,利用荧光信号积累实时监测PCR全程,然后用标准曲线对未知模板采取定量分析的方法。本文主要用此法检测子宫内膜HOXA-1OmRNA含量。所有实验的数据结果采用SPSS19.0软件包进行分析,数据资料以（?）形式表示,组间差异性分析采用单因素方差分析方法（One-Way ANOVA）并进行多重比较,P<0.05为差异有统计学意义。结果1.初老雌性大鼠模型的建立与评价4-6月龄雌性大鼠的阴道脱落细胞涂片均观察到周期出现的规律动情周期。10-12月龄雌性大鼠做阴道脱落细胞涂片观察,可以观察到动情间期延长或动情周期紊乱,但极少数有个体差异性。2.促孕安怡方对初老雌性大鼠生殖内分泌调控的影响促孕安怡方能够提高初老模型大鼠血清抗苗勒氏管激素（AMH）、抑制素B（INH-B）和雌二醇（E2）水平,降低促卵泡刺激素（FSH）和促黄体生成素（LH）水平。初老模型组与正常对照组比较差异有统计学意义（P<0.05）;初老药物组与初老模型组比较差异有统计学意义（P<0.05）。3.促孕安怡方对初老雌性大鼠的卵巢组织形态学及卵巢干细胞因子（SCF）和生长分化因子9（GDF-9）表达的影响促孕安怡方能够提高初老模型大鼠的卵巢脏器指数和干细胞因子（SCF）及生长分化因子9（GDF-9）的表达,改善卵巢显微结构。初老模型组与正常对照组比较差异有统计学意义（P<0.05）;初老药物组与初老模型组比较差异有统计学意义（P<0.05）。4.促孕安怡方对初老雌性大鼠的子宫内膜组织形态学及白血病抑制因子（LIF）、HOXA-10mRNA表达的影响促孕安怡方能够提高初老模型大鼠的子宫脏器指数和白血病抑制因子（LIF）及HOXA-10mRNA的表达,改善子宫内膜显微结构并增加胞饮突数量。初老模型组与正常对照组比较差异有统计学意义（P<0.05）;初老药物组与初老模型组比较差异有统计学意义（P<0.05）。结论在本实验中,我们发现促孕安怡方能够调控初老模型大鼠血清抗苗勒氏管激素（AMH）、抑制素B（INH-B）、雌二醇（E2）、卵泡刺激素（FSH）和黄体生成素（LH）的水平;上调卵巢干细胞因子（SCF）和生长分化因子9（GDF-9）的表达;增强子宫内膜白血病抑制因子（LIF）和HOXA-10mRNA的表达;改善卵巢和子宫显微结构;从而改善初老模型大鼠的卵巢储备功能和子宫内膜容受性,增强初老雌性大鼠的生育力。
贺宇[6]（2020）在《补肾养血活血法治疗卵泡发育障碍类疾病的导师临床经验总结及实验研究》文中提出目的:通过整理导师治疗卵泡发育障碍类疾病的诊疗思路及用药特点,总结其运用补肾养血活血法治疗本病的临床经验,以期丰富传统中医药治疗卵泡发育障碍类疾病的理论与方法。以雷公藤甲素引起的卵泡发育障碍大鼠模型为研究对象,探讨中药复方新加苁蓉菟丝子丸在促进卵泡发育中的作用,为临床治疗此类疾病提供客观的理论依据。方法:1、阐述中西医对卵泡发育障碍疾病的病因、病机的认识,中医补肾养血活血法在卵泡发育障碍类疾病中的治疗进展。总结导师治疗此类疾病的相关学术思想,并结合临床经典病案3则,对导师治疗此类疾病进行临床经验总结。2、进行动物实验,将56只SD雌性大鼠随机分为7组,随机抽取8只予蒸馏水灌胃作为正常对照组,其余6组予雷公藤甲素（triptolide,TP）400μg/kg的剂量灌胃60天造模。成功建模后,将其分为正常对照组,TP模型组,西药组,中药高剂量组和低剂量组,抑制剂组,中药高剂量+抑制剂组。在灌胃2周后,通过阴道脱落细胞涂片检查和染色观察大鼠动情周期的变化。灌胃后抽血并通过ELISA检测血清E2、P、FSH、LH、AMH激素水平,血液分析仪对AI、HCT、ESR进行检测;采血后处死大鼠,取出卵巢组织并称湿重,计算卵巢指数,光学显微镜下对初级、次级、窦状、闭锁卵泡及黄体数目进行计数,并检测颗粒细胞层厚度;通过透射电子显微镜观察颗粒细胞的自噬;WB法和RT-PCR检测卵巢颗粒细胞中自噬相关因子的蛋白表达和m RNA的水平。结果:1、与正常对照组相比,TP模型组的动情周期延长且紊乱（p<0.01）,卵巢湿重和卵巢指数明显降低（p<0.01）。次级及窦状卵泡数量减少（p<0.01）,黄体数和颗粒细胞层厚度减少（p<0.01）,闭锁卵泡数量增加（p<0.01）,初级卵泡无明显变化（p>0.05）。血清E2,P,AMH水平明显降低（p<0.01）,FSH和LH水平明显升高（p<0.01）;AI和ESR指数增加（p<0.01）,HCT无明显变化（p>0.05）;大鼠卵巢颗粒细胞中自噬小体及溶酶体数量增加（p<0.01）。2、与模型组相比,西药组和中药组的卵巢湿重和卵巢指数均升高（p<0.01）;次级卵泡数、窦状卵泡数、黄体和颗粒细胞层的数量增加（p<0.01）,闭锁卵泡数目减少（p<0.01）;血清E2,P,AMH水平升高（p<0.01）,FSH,LH水平降低（p<0.01）;AI,ESR指数下降（p<0.01）;且中药高剂量组与西药组效果相当（p>0.05）;使用通路抑制剂后,中药高剂量组对卵巢上述指标影响能力消失（p<0.01）。3、和模型组相比,西药组和中药组的卵巢颗粒细胞中自噬小体和溶酶体的数量均减少（p<0.01）。大鼠组织中PI3K,AKT和mTOR蛋白的磷酸化水平明显增加（p<0.01）,但对其m RNA水平无明显影响（p>0.05）;自噬相关分子Beclin1,LC3Ⅱ,P53的蛋白表达和m RNA表达均被下调,LC3I表达上升（p<0.01）。在抑制剂的作用下,高剂量中药组对上述相关因子的影响消失（p<0.01）。结论:1、雷公藤甲素模型建立后,大鼠出现一般情况改变,动情周期紊乱,血清性激素和卵巢组织学改变与卵巢功能损伤的表现相符,说明雷公藤甲素可成功建立卵泡发育障碍模型。2、新加苁蓉菟丝子丸可以改善大鼠血清性激素水平,增加卵巢指数和卵巢湿重,增加次级、窦状卵泡和黄体数量,增加颗粒细胞层的厚度并降低红细胞聚集指数（AI）和血沉（ESR）。在补肾保护大鼠卵巢功能的基础上,发挥此中药复方养血活血的功效,改善模型大鼠血瘀状态。3、补肾养血活血的中药复方新加苁蓉菟丝子丸,可能是通过PI3K/AKT/mTOR通路抑制大鼠颗粒细胞自噬来促进卵泡发育,改善卵巢功能,修复雷公藤甲素对其造成的损伤的。
李卓恒[7]（2020）在《EPO与肾虚雄性生殖功能低下的相关性及右归饮的改善作用》文中研究指明背景中医理论认为,肾主生殖,与“肾精”密切相关。肾精不足,则生殖之精匮乏,导致不育不孕。“肾精”物质基础至今未明。课题组提出“促红细胞生成素（Erythropoietin,EPO）可能是肾精的重要生物物质基础”的假设,并初步验证了“肾精通于脑”、“肾精主骨”、“肾精化气强卫”等方面与EPO的相关性。本研究通过观察三种雄性动物模型（2种肾虚生殖功能低下,1种EPO基因敲除）体内的EPO变化,以及补充外源性EPO或给予补肾益精经典方药对三种雄性动物模型的改善作用及其机制,拟揭示EPO对肾虚雄性生殖功能的影响。从而从生殖的角度证明EPO可能是‘肾精’的重要物质基础,阐释“肾精藏生殖之精”的中医理论。本研究得到国家自然科学基金面上项目（81473549）,2018年中央高校基本科研业务费学生项目（XDJK2018D027）的支持。目的1.观察雄性EPO基因敲除小鼠、自然衰老小鼠、肾虚生殖低下大鼠体内EPO的变化,以及外源性rhEPO的逆转作用;2.观察“补肾益精”经典方右归饮对EPO基因敲除小鼠、雄性自然衰老小鼠、肾虚生殖低下大鼠的改善作用,并探讨其作用机制是否与HIF1α-STAT5通路相关;3.拟通过上述试验揭示EPO对肾虚雄性生殖功能的影响。从而从生殖的角度证明“EPO可能是‘肾精’的重要物质基础”,阐释“肾精藏生殖之精”的中医理论。方法与结果1.EPO与肾虚雄性动物生殖功能低下的相关性研究方法:（1）建立EPO基因全身条件性敲除小鼠:本研究设计并委托基因公司定制获得“目标基因锚定鼠EPO（flox/flox）小鼠”和“敲除工具鼠UBC-CreERT2小鼠”,将两种小鼠进行交配,取子鼠进行鉴定,筛选得到“EPO（flox/flox）-CreERT2小鼠”。再选取其中8周龄雄性EPO（flox/flox）-CreERT2子鼠（待EPO基因敲除小鼠）和雄性EPO（flox/flox）小鼠（野生型,WT）,均腹腔注射100 mg·kg-1他莫昔芬（执行EPO基因敲除的药物）连续5天,从第6天开始小鼠正常饲养28天,每7天测定小鼠体温、体重,至第34天处死小鼠,取材检测各项指标。其中EPO（flox/flox）-CreERT2小鼠注射他莫昔芬后即成为“EPO基因条件性全身敲除（EPO-KO）小鼠”,检测该小鼠肾脏、睾丸中EPO蛋白表达,计算EPO基因在以上组织的敲除率,判断敲除成功后,用于后续各项试验。（2）复制自然衰老致肾虚雄性生殖功能低下小鼠模型,小鼠正常饲养12个月造模,模型成功判断标准:（1）与青年小鼠相比,每只衰老模型小鼠自主活动、新物体识别、转棒时间显着降低,血清中SOD、T-AOC降低,MDA升高即为衰老模型成功;（2）与青年小鼠均值相比,造模后每只小鼠血清中UREA、CREA升高,ACTH、T、T3或T4降低,即为肾虚模型成功。（3）与青年对照组小鼠均值相比,造模后每只小鼠血清中T、E2、LDH、DHT降低,精子数量减少、精子畸形率升高,即为生殖功能损害模型成功。（4）同时满足上述（1）（2）（3）三个判断标准即为自然衰老小鼠肾虚雄性生殖功能低下模型成功。取自然衰老肾虚雄性生殖功能损害模型成功的小鼠用于后续试验。（3）复制腺嘌呤致肾虚雄性生殖功能低下大鼠模型。雄性SD大鼠随机分为正常组与造模组,造模组用腺嘌呤150 mg·kg-1连续灌胃14天。模型成功判断标准:（1）与正常组大鼠均值相比,造模后每只大鼠血清中UREA、CREA含量升高,ACTH、T、T3或T4含量降低,即为肾虚模型成功。（2）与正常组大鼠均值相比,造模后每只大鼠血清中T、E2、LDH、DHT、FSH降低,精子畸形率升高、数量降低;性行为:骑跨次数、插入次数、射精次数降低,即为生殖功能损害模型成功。（3）同时满足上述（1）（2）两个判断标准即为肾虚雄性生殖功能损害模型成功。取肾虚雄性生殖功能损害模型成功的大鼠用于后续试验。对比检查以上3个动物模型的外观形态,血常规,血清生化指标,脏器病理学,精子数量、畸形率,肾脏、睾丸HIF1α-STAT5通路关键蛋白含量。结果:（1）EPO基因条件性全身敲除小鼠成功建立,具有肾精亏虚证及雄性生殖功能低下的临床表现。EPO基因在EPO基因敲除小鼠肾脏和睾丸中的敲除率分别为77.53%、76.86%。与野生型小鼠相比,EPO基因敲除小鼠毛色变差,出现腹水,体重、体温、摄食量显着减少;肝、脾、肺、肾、脑垂体、睾丸、附睾、前列腺、精囊、脊柱组织形态显着改变;精子数量显着下降、畸形率显着上升,精子外观、内部形态显着病变;血清EPO显着降低,SEPOR显着升高,EPO/SEPOR的比值显着降低;血常规指标Gran%、Gran、MID、MID%、RBC、HCT、PCT显着降低、HGB、LY、LY%、MCH、WBC显着升高;肾功能指标UREA、CREA显着升高;甲状腺指标ACTH、CORT、T3、T4的显着降低;氧化应激指标MDA显着升高,SOD、GSH-Px、T-AOC、LPO显着降低;免疫指标C3、C4、IL-2、IL-6、IGA、IGG、IGM显着降低;生殖指标T、E2、LH、DHT、FSH显着降低;肾脏、睾丸中HIF1α-STAT5通路蛋白显着下降（均p<0.05）。（2）自然衰老致肾虚雄性生殖功能低下小鼠EPO及其信号通路蛋白显着降低。与青年小鼠相比,衰老模型小鼠,外观形态、毛色较差,体重和体温降低;肾小球空泡、炎性因子较多;睾丸小体形态不完整,曲精管萎缩、充血;精子数量显着下降、畸形率显着上升;血常规RBC、HCT、HGB、MID、MID%、MCH、PCT显着降低;血清UREA、CREA显着升高;ACTH、CORT、T3、T4显着降低;MDA、LPO显着升高,SOD、GSH-PX、T-AOC显着降低;T、E2、LH、DHT、FSH显着降低;自主活动次数、转棒时间显着降低、新物体识别指数显着升高;血清EPO显着降低,SEPOR显着升高,EPO/SEPOR比值显着降低;肾脏与睾丸HIF-1α、EPO、p-EPOR（Tyr368）、p-JAK2（Tyr570）、p-STAT5（Ser725）蛋白表达量显着降低（均p<0.05）。（3）腺嘌呤致肾虚雄性生殖功能低下大鼠EPO显着下降,HIF1α-STAT5通路蛋白显着异常。与正常组相比,模型组大鼠外观形态、毛色较差,体重、体温降低;肾外观变白,肾小球囊腔较大,肾小管内腺嘌呤结晶、坏死、炎性细胞浸润较多;睾丸小体管腔内蓝染的钙盐沉积,曲精管萎缩、管腔疏松,充血;精子外观、内部病变;精子数量显着降低,精子畸形率显着上升;血常规Gran%、Gran、MID、MID%、RBC、HCT、PCT、MCH显着下降,LY、LY%、WBC显着上升;血清UREA、CREA显着上升;ACTH、CORT、T3、T4的含量显着降低;T、E2、LH、DHT、FSH均显着降低;骑跨次数、插入次数、射精次数均显着降低;血清EPO显着降低,SEPOR显着升高,EPO/SEPOR比值显着降低;肾脏和睾丸HIF-1α、EPO蛋白表达含量显着降低,p-EPOR（Tyr368）、p-JAK2（Tyr570）、p-STAT5（Ser725）蛋白表达量显着升高（均p<0.05）。2.外源性rhEPO对肾虚雄性生殖功能低下动物体质及EPO信号通路逆转作用观察方法:（1）外源性rhEPO对EPO基因敲除雄性小鼠的逆转试验:取8周龄雄性EPO基因敲除小鼠及其野生型小鼠,分为4组:EPO-KO组、WT组、EPO-KO+rhEPO 500 IU·kg-1、WT+rhEPO 500 IU·kg-1,每组5只。rhEPO组每三日皮下注射rhEPO,EPO-KO组、WT组给予等体积生理盐水,连续28天。检测动物外观、体重、体温,测定行为学、血常规、血清生化指标,脏器病理学,精子形态、数量、畸形率,肾脏、睾丸HIF1α-STAT5通路关键蛋白含量。（2）外源性rhEPO对自然衰老肾虚雄性生殖功能低下小鼠的逆转试验:自然衰老模型小鼠分为4组:衰老模型组、rhEPO 250 IU·kg-1、500 IU·kg-1、1000 IU·kg-1、每组15只,2月龄雄性小鼠15只为青年对照组。rhEPO组每三日皮下注射相应剂量rhEPO,衰老模型组给予等体积生理盐水,持续28天。检测动物外观、体重、体温,测定行为学、血常规、血清生化指标,肾脏、睾丸病理学,精子数量、畸形率,肾脏、睾丸HIF1α-STAT5通路关键蛋白含量。（3）外源性rhEPO对腺嘌呤致肾虚雄性生殖功低下大鼠的逆转试验:将造模成功大鼠随机分为4组:模型组、rhEPO 500 IU·kg-1、1000IU·kg-1、1500 IU·kg-1每组15只,正常组15只大鼠。第15天开始,除正常组外,隔日150 mg·kg-1腺嘌呤灌胃维持模型,rhEPO每三天皮下注射一次,模型组给予等体积生理盐水,持续30天。检测大鼠外观、体重、体温,测定性行为学、血常规、血清生化指标,肾脏、睾丸病理学,精子形态、数量、畸形率,肾脏、睾丸HIF1α-STAT5通路关键蛋白含量。（4）外源性rhEPO对3种TM4细胞损伤模型的保护作用及其机制研究:TM4细胞为模型,分别进行三种干预:采用Crispr Cas9技术敲除EPO基因;JAK2及STAT5蛋白抑制剂分别处理细胞,缺氧缺糖损伤。细胞干预后观察给予外源性rhEPO 12.5 U·mL-1后细胞增殖情况、LDH泄漏率、线粒体膜电位及对HIF1α-STAT5通路的影响。结果:（1）外源性rhEPO显着改善肾虚雄性生殖功能低下动物的体质及生殖功能。（1）外源性rhEPO显着改善EPO基因敲除雄性小鼠体质及生殖功能。与EPO基因敲除组相比,外源性rhEPO 500 IU·kg-1组外观形态、毛色较好,体重、体温升高;肾小球饱满,空泡较少,炎性因子较少;睾丸小体形态较完整,曲精管萎缩、充血较轻;精子数量显着上升、畸形率显着下降;血常规Gran%、Gran、MID、MID%、RBC、HCT显着升高、HGB、LY、MCH、WBC显着降低;血清UREA、CREA显着降低;ACTH、CORT、T3、T4显着升高;MDA显着降低,SOD、GSH-PX、T-AOC、LPO显着升高;T、E2、LH、DHT、FSH均显着升高;自主活动次数、转棒时间显着上升、新物体识别指数显着降低（均p<0.05）。（2）外源性rhEPO显着改善自然衰老肾虚雄性生殖功能低下小鼠体质及生殖功能。与衰老模型组相比,rhEPO 250、500、1000 IU·kg-1组小鼠,外观形态、毛色较好,体重、体温升高;肾小球饱满,空泡较少,炎性因子较少;睾丸小体形态较完整,曲精管萎缩、充血较轻;精子数量显着上升、畸形率显着下降;血常规RBC、HCT、HGB、MID、MID%、MCH、PCT显着升高;血清UREA、CREA显着降低;ACTH、CORT、T3、T4显着升高;MDA、LPO显着降低,SOD、GSH-PX、T-AOC显着升高;T、E2、LH、DHT、FSH显着升高;小鼠自主活动次数、转棒时间显着上升、新物体识别指数显着降低（均p<0.05）。（3）外源性rhEPO显着改善腺嘌呤致肾虚雄性生殖功能低下大鼠体质及生殖功能。与模型组相比,rhEPO 500、1000、1500 IU·kg-1组大鼠,外观形态、毛色较好,体重、体温升高;肾外观形态显着改善,肾小球囊腔变小,肾小管内腺嘌呤结晶变少,凝固性坏死减少,炎性细胞浸润减少;睾丸小体形态趋于正常,管腔内钙盐沉积减少,曲精管缩、管腔疏松,血管壁增厚,充血的情况减轻;精子形态及组织结构病变显着缓解;精子数量显着上升、畸形率显着下降;血常规Gran%、Gran、MID、MID%、RBC、HCT、PCT、MCH显着上升,LY、LY%、WBC显着降低;血清UREA、CREA显着降低;ACTH、CORT、T3、T4的含量显着升高;T、E2、LH、DHT、FSH均显着升高;骑跨次数、插入次数、射精次数均显着升高（均p<0.05）;（2）外源性rhEPO显着调节肾虚雄性生殖低下动物EPO信号通路。（1）外源性rhEPO显着升高EPO基因敲除雄性小鼠EPO含量及其信号通路蛋白的表达。与EPO基因敲除小鼠相比,rhEPO 500 IU·kg-1组小鼠EPO显着上升,SEPOR显着下降,EPO/SEPOR的比值显着上升,肾脏与睾丸中EPO、p-EPOR（Tyr368）、p-JAK2（Tyr570）、p-STAT5（Ser725）蛋白表达量增加（均P<0.01）。（2）外源性rhEPO显着升高自然衰老肾虚雄性生殖功能低下小鼠EPO含量及其信号通路蛋白的表达。与自然衰老组小鼠相比,rhEPO 250、500、1000 IU·kg-1组小鼠,血清EPO显着上升,SEPOR显着下降,EPO/SEPOR的比值显着上升;肾脏与睾丸中HIF-1α、EPO、p-EPOR（Tyr368）、p-JAK2（Tyr570）、p-STAT5（Ser725）蛋白表达量增加（均P<0.01）。（3）外源性rhEPO显着调节腺嘌呤致肾虚雄性生殖功能低下大鼠EPO及其信号通路蛋白的表达。与模型组相比,rhEPO 250 IU·kg-1、500 IU·kg-1组血清EPO显着上升,rhEPO1500 IU·kg-1组EPO显着下降,rhEPO各组SEPOR显着下降、EPO/SEPOR的比值显着上升;肾脏与睾丸HIF-1α、EPO蛋白表达量增加,p-EPOR（Tyr368）、p-JAK2（Tyr570）、p-STAT5（Ser725）蛋白表达量下降（均p<0.05）。（3）外源性rhEPO对EPO基因敲除或缺氧缺糖损伤的TM4细胞具有显着的保护作用,对EPO下游通路抑制的TM4细胞无改善作用。（1）外源性rhEPO对EPO基因敲除损伤的TM4细胞有显着保护作用。与模型组相比,rhEPO 12.5 IU·mL-1显着促进TM4细胞增殖;显着抑制LDH泄漏率和线粒体膜电位的改变;使EPO、p-EPOR（Tyr368）、p-JAK2（Tyr570）、p-STAT5（Ser725）蛋白表达量增加（均p<0.05）。（2）外源性rhEPO对JAK2、STAT5蛋白抑制的TM4细胞无显着保护作用。与模型组相比,rhEPO 12.5 IU·mL-1对TM4细胞增殖、LDH泄漏率、线粒体膜电位及HIF-1α、EPO、p-EPOR（Tyr368）、p-JAK2（Tyr570）、p-STAT5（Ser725）蛋白表达量均无显着改变。（3）外源性rhEPO对缺氧缺糖损伤的TM4细胞有显着保护作用。与模型组相比,rhEPO 12.5 IU·mL-1显着促进TM4细胞增殖;显着抑制LDH泄漏率和线粒体膜电位的改变;使HIF1α、EPO、p-EPOR（Tyr368）、p-JAK2（Tyr570）、p-STAT5（Ser725）蛋白表达量增加（均p<0.05）。提示EPO及其信号通路对雄性生殖功能细胞具有重要调节作用。3.右归饮对肾虚雄性生殖低下动物的改善及对EPO信号通路的调节作用观察方法:（1）右归饮对EPO基因敲除雄性小鼠的试验:取8周龄雄性EPO基因敲除小鼠及其野生型小鼠,分为4组:EPO-KO组、WT组、EPO-KO+右归饮20 g·kg-1、WT+右归饮20 g·kg-1每组5只。右归饮组每日灌胃相应剂量右归饮,EPO-KO组、WT组每日给予等体积生理盐水,持续28天。检测方法和指标同“方法2（1）”。（2）右归饮对自然衰老肾虚雄性生殖功能低下小鼠的试验:造模成功的自然衰老雄性生殖功能低下模型小鼠分为4组:模型组、右归饮10 g·kg-1、20 g·kg-1、40 g·kg-1组,每组15只,以2月龄雄性C57BL/6J小鼠15只为青年对照组。检测方法及指标同“方法2（2）”。（3）右归饮对腺嘌呤致肾虚雄性生殖功能低下大鼠的试验:腺嘌呤造模成功的肾虚雄性生殖功能低下大鼠随机分为5组:模型组、右归饮10 g·kg-1、20 g·kg-1、40 g·kg-1组、阳性药对照组(龟鹿二仙膏10 g·kg-1组),以正常大鼠15只为正常组。第15天开始,除正常组外,各组隔日给予150 mg·kg-1腺嘌呤灌胃维持模型,右归饮与龟鹿二仙膏组灌胃给药每日1次至第46天。检测方法及指标同“方法2（3）”。（4）右归饮对3种TM4细胞模型的保护作用及其机制研究:干预方式同“方法2（4）”。细胞干预后,考察给予右归饮100 ug·mL-1后细胞增殖情况、LDH泄漏率、线粒体膜电位及HIF1α-STAT5通路的影响。结果:（1）右归饮显着改善肾虚雄性生殖低下动物的体质及生殖能力。（1）右归饮对EPO基因敲除雄性小鼠体质及生殖能力无显着改善作用。与EPO基因敲除组相比,右归饮20 g·kg-1组小鼠外观形态、毛色、体温无改善;肾脏、睾丸病理形态无改善;精子数量、精子畸形率无改善;血常规MCH、LY、RBC、HCT、PCT、Gran、Gran%、Mid、Mid%无显着改变,WBC、HGB、LY%显着降低（均p<0.05）,血清UREA、CREA、ACTH、CORT、T3、T4、MDA、LPO、SOD、GSH-PX、T-AOC、T、E2、DHT、FSH均无显着改变,LH显着升高（p<0.05）;自主活动次数、转棒时间无显着改变,新物体识别指数显着下降（p<0.05）。（2）右归饮显着改善自然衰老肾虚雄性生殖功能低下小鼠体质及生殖能力。与衰老模型组相比,右归饮10、20、40 g·kg-1组小鼠,外观形态、毛色较好,体重、体温升高;肾小球饱满,空泡较少,炎性因子较少;睾丸小体形态较完整,曲精管萎缩、充血较轻;精子数量显着上升,精子畸形率显着下降;血常规RBC、HCT、HGB、MID、MID%、MCH、PCT显着降低;血清UREA、CREA显着降低;ACTH、CORT、T3、T4显着升高;MDA、LPO显着降低,SOD、GSH-PX、T-AOC显着升高;T、E2、LH、DHT、FSH均显着升高;小鼠自主活动次数、转棒时间显着上升、新物体识别指数显着降低（均p<0.05）。（3）右归饮显着改善腺嘌呤致肾虚雄性生殖功能低下大鼠体质及生殖能力。与模型组相比,右归饮10、20、40 g·kg-1组大鼠外观形态、毛色较好,体重、体温升高;肾外观形态显着改善,肾小球囊腔变小,肾小管内腺嘌呤结晶变少,坏死减少,炎性细胞浸润减少;睾丸小体形态趋于正常,管腔内蓝染的钙盐沉积减少,曲精管萎缩减轻、管腔疏松,血管壁增厚,充血的情况减轻;精子形态及组织结构病变显着缓解;精子数量显着上升,精子畸形率显着下降;血常规Gran%、Gran、MID、MID%、RBC、HCT、PCT、MCH显着上升,LY、WBC显着降低;血清UREA、CREA显着降低;ACTH、CORT、T3、T4的含量显着升高;T、E2、LH、DHT、FSH均显着升高;骑跨次数、插入次数、射精次数均显着升高（均p<0.05）。（2）右归饮显着调节肾虚雄性生殖低下动物EPO及其信号通路。（1）右归饮对EPO基因敲除雄性小鼠EPO含量及其信号通路蛋白表达无显着调节作用。与EPO基因敲除小鼠相比,右归饮20 g·kg-1组小鼠血清EPO、SEPOR无显着改变;肾脏与睾丸中HIF-1α、EPO、p-EPOR（Tyr368）、p-JAK2（Tyr570）、p-STAT5（Ser725）蛋白表达量无显着改变;（2）右归饮显着升高自然衰老肾虚雄性生殖功能低下小鼠EPO及其信号通路蛋白的表达。与自然衰老组小鼠相比,右归饮10、20、40 g·kg-1组小鼠血清EPO显着上升,SEPOR显着下降,EPO/SEPOR的比值显着上升,肾脏与睾丸HIF-1α、EPO、p-EPOR（Tyr368）、p-JAK2（Tyr570）、p-STAT5（Ser725）蛋白表达量增加（均p<0.01）;（3）右归饮显着升高腺嘌呤致肾虚生殖雄性功能低下大鼠EPO及其信号通路蛋白的表达。与模型组相比,右归饮10、20、40 g·kg-1组小鼠血清EPO显着上升、SEPOR显着下降,EPO/SEPOR的比值显着上升;肾脏与睾丸HIF-1α、EPO、p-EPOR（Tyr368）、p-JAK2（Tyr570）、p-STAT5（Ser725）蛋白表达量下降（均P<0.05）。（3）右归饮对缺氧缺糖损伤的TM4细胞有显着保护作用,对EPO基因敲除或EPO下游信号通路阻断的TM4细胞无改善的作用。（1）右归饮对EPO基因敲除的TM4细胞无显着改善。与模型组相比,右归饮100 ug·mL-1对TM4细胞的增殖、LDH泄漏率、线粒体膜电位及HIF-1α、EPO、p-EPOR（Tyr368）、p-JAK2（Tyr570）、p-STAT5（Ser725）蛋白表达量无显着改变。（2）右归饮对JAK2、STAT5蛋白抑制的TM4无显着改善作用。与模型组相比,右归饮100 ug·mL-1对TM4细胞的增殖、线粒体膜电位及HIF-1α、EPO、p-EPOR（Tyr368）、p-JAK2（Tyr570）、p-STAT5（Ser725）蛋白表达量均无显着改变。（3）右归饮对缺氧缺糖的TM4细胞有显着保护作用。与模型组相比,右归饮100 ug·mL-1显着促进TM4细胞增殖;显着抑制模型细胞损伤导致的LDH泄漏率和线粒体膜电位的改变;使HIF-1α、EPO、p-EPOR（Tyr368）、p-JAK2（Tyr570）、p-STAT5（Ser725）蛋白表达量增加（均p<0.05）。提示右归饮对雄性生殖细胞的保护作用依赖于EPO及其信号通路。结论1.体内EPO的丢失或降低,与EPO基因敲除模型、自然衰老模型、腺嘌呤模型3种试验动物的肾虚体质及其雄性生殖功能低下密切相关;2.补充外源性rhEPO对EPO基因敲除模型、自然衰老模型、腺嘌呤模型3种试验动物的肾虚体质及其雄性生殖功能低下具有显着的逆转作用;3.补肾益精经典方右归饮对自然衰老模型、腺嘌呤模型2种肾虚雄性生殖功能低下动物的体质及其生殖功能具有显着的改善作用,其作用与升高EPO及其下游信号通路HIF-1α-STAT5的蛋白表达密切相关,对EPO基因敲除雄性小鼠模型无显着改善作用;4.外源性rhEPO和右归饮对EPO基因敲除、JAK2及STAT5蛋白抑制、缺氧缺糖损伤3种TM4细胞模型的干预试验结果显示,EPO及其下游信号通路是保护细胞损伤的关键环节,也是右归饮发挥作用的关键环节。5.本文建立了EPO基因条件性全身敲除小鼠模型,证明了EPO基因缺失雄性动物表型与“肾精亏虚证”患者临床表现的相似性,支持“EPO可能是肾精的重要生物物质基础”的假设。6.本文报道了EPO对肾虚动物雄性生殖功能的影响,从生殖的角度验证了“EPO可能是‘肾精’的重要物质基础”的假设,阐释了“肾精藏生殖之精”的中医理论。
孔竞谊[8]（2019）在《硝菔通结方促进慢传输型便秘大鼠肠神经系统网络结构修复的实验研究》文中提出目的:观察硝菔通结方对慢传输型便秘（STC）模型大鼠结肠动力、肠神经系统网络结构（ENS-ICC-SMC）及结肠细胞自噬与凋亡的影响,从细胞自噬与凋亡调控组织结构功能稳态的角度探讨硝菔通结方治疗STC的作用机制,为补肾益精法治疗便秘提供新的研究思路。方法:1.随机将SD大鼠110只分为空白组40只,造模组70只。运用大黄粉混悬液递增剂量三轮循环法对造模组大鼠进行慢传输型便秘模型复制,并在造模过程中粪便形质改变的3个时间节点每组各取10只大鼠处死,HE染色观察结肠病理,免疫荧光铺片观察肌间神经丛,透射电镜观察ENS-ICC-SMC超微结构及自噬体,Western-Blot检测结肠肌层ENS-ICC相关蛋白PGP9.5、c-kit、Cx43、Sy,自噬相关蛋白Beclin-1、LC3、p62及凋亡相关蛋白bax、bcl-2、caspase-3表达水平,TUNEL法检测结肠肌层细胞凋亡情况。造模结束后根据大鼠首粒黑便排出时间,判断造模是否成功。2.造模成功后将剩余大鼠分为空白组（K组）,模型组（M组）、莫沙必利组（S组）、张锡纯硝菔通结汤原方组（Z组）及硝菔通结方组（X组）,予以对应药物灌胃4周。观察各组大鼠的体质量、首粒黑便排出时间、便量,检测在体结肠肌电。取结肠组织,HE染色观察病理学,免疫荧光铺片观察肌间神经丛,透射电镜观察ENS-ICC-SMC超微结构;免疫荧光及Western-Blot检测肌层PGP9.5、c-kit、Sy、Cx43、Beclin-1、LC3、p62、bax、bcl-2、caspase-3、mTOR的表达水平;RT-PCR检测肌层Beclin-1、LC3、p62、bax、bcl-2、caspase-3mRNA的表达水平。结果:1.STC模型大鼠ENS-ICC-SMC与结肠细胞自噬、凋亡的变化（1）ENS-ICC-SMC形态学变化:随着造模程度的发展,HE染色出现炎性细胞浸润,固有膜肿胀,肌层纤维坏死,肌细胞核固缩、深染或溶解消失,肌间神经丛神经细胞空泡变性、数量减少;肌间神经铺片显示结肠肌间神经丛神经分布逐渐稀疏,神经元变少,纤维及胞体细小;透射电镜显示肠神经细胞线粒体肿胀,甚则形成空泡样结构,偶见自噬小体及凋亡现象;ICC少见,偶有可见其细胞核较大,核内染色质边集,细胞质内少量线粒体,线粒体肿胀,胞质内空泡形成;平滑肌细胞细胞核染色质边集,胞质内可见大量空泡等病理性改变;细胞间隙变宽。（2）ENS-ICC相关蛋白的变化:相较于空白组,造模1阶段大鼠PGP9.5、Cx43有减少趋势（P>0.05）,c-kit、Sy表达减少（P<0.05）,造模2、3阶段大鼠PGP9.5、c-kit、Sy、Cx43表达均减少（P<0.05/P<0.01）。（3）自噬相关蛋白的变化:相较于空白组,造模1阶段大鼠Beclin-1表达增多,LC3Ⅰ/LC3Ⅱ的比值减小（P<0.05）,p62表达有减少趋势（P>0.05）;造模2阶段大鼠Beclin-1表达减少（P<0.05）,LC3Ⅰ/LC3Ⅱ的比值有增大趋势,p62表达有增多趋势（P>0.05）;造模3阶段大鼠Beclin-1表达减少,LC3Ⅰ/LC3Ⅱ的比值增大,p62表达增多（P<0.01）。（4）凋亡相关蛋白的变化:相较于空白组,造模1阶段大鼠bcl-2/bax的比值及caspase-3表达无明显变化（P>0.05）;造模2、3阶段大鼠bcl-2/bax的比值减小,caspase-3表达增多（P<0.05/P<0.01）;TUNEL法显示造模2、3阶段大鼠结肠肌层中细胞凋亡增多（P<0.01）。2.硝菔通结方对大鼠体质量、首粒黑便排出时间、便量及结肠肌电的影响（1）对体质量的影响:相较于K组,M组体重增长缓慢（P<0.01）;相较于M组,各给药组大鼠体重增长加快（P<0.01）。相较S组及Z组,X组大鼠体重增长较快（P<0.05）。（2）对首粒黑便及便量的影响:相较于M组,各组大鼠首粒黑便排出时间变短,便量增多（P<0.01）;相较于Z组,X组大鼠便量增加（P<0.05）。（3）对结肠肌电的影响:相较于K组,M组频率减慢、振幅减小（P<0.01）;相较于M组,S组及X组频率增加,振幅加大（P<0.05/P<0.01）,Z组频率增加（P<0.05）,振幅有加大趋势（P>0.05）。3.硝菔通结方对STC模型大鼠结肠ENS-ICC-SMC的影响（1）对ENS-ICC-SMC形态学的影响:各给药组HE染色显示炎性浸润减轻,肌层纤维坏死减少,肌细胞及肌间神经丛神经细胞变性减轻;肌间神经丛铺片显示神经丛神经分布增多,神经元数量及形态恢复;透射电镜显示神经细胞、ICC、SMC内线粒体肿胀等病变减轻,ICC增多,细胞连接增强,以X组最明显。（2）对ENS-ICC相关蛋白的影响:M组PGP9.5、c-kit、Sy、Cx43荧光强度弱于K组,各给药组荧光强度强于M组;蛋白印迹法显示S组及X组PGP9.5、c-kit、Sy、Cx43的表达增多（P<0.05/P<0.01）,Z组PGP9.5表达有增多趋势（P>0.05）,c-kit、Sy、Cx43的表达增多（P<0.05）;相较于Z组,X组PGP9.5、Sy、c-kit的表达增多（P<0.05）。4.硝菔通结方对STC模型大鼠结肠自噬与凋亡的影响（1）对自噬相关蛋白的影响:M组Beclin-1、LC3荧光强度弱于K组,p62荧光强度强于K组,各给药组Beclin-1、LC3荧光强度强于M组,p62荧光强度弱于M组;蛋白印迹法显示S组及X组Beclin-1表达增多（P<0.05/P<0.01）,Z组及X组p62表达减少（P<0.05/P<0.01）,LC3Ⅰ/Ⅱ的比值减小（P<0.05）;相较于Z组,X组Beclin-1表达增多,p62表达减少（P<0.05）,相较于S组,X组p62表达减少（P<0.05）。（2）对自噬相关mRNA的影响:相较于K组,M组大鼠Beclin-1、LC3、p62 mRNA的表达量降低（P<0.01）;相较于M组,S组及X组大鼠Beclin-1mRNA的表达量增多（P<0.05/P<0.01）,相较于Z组,X组大鼠Beclin-1 mRNA的表达量增多（P<0.05）,各组LC3、p62 mRNA无明显变化（P>0.05）。（3）对凋亡相关蛋白的影响:M组bcl-2、bax、caspase-3荧光强度强于K组,各给药组荧光强度弱于M组;蛋白印迹法显示S组及X组bcl-2/bax的比值增大（P<0.01）,caspase-3表达减少（P<0.05/P<0.01）,Z组bcl-2/bax的比值有增大趋势,caspase-3表达有减少趋势（P>0.05）,相较于Z组,X组bcl-2/bax的比值增大（P<0.05）。（4）对凋亡相关mRNA的影响:相较于K组,M组bcl-2、bax、caspase-3 mRNA表达升高（P<0.01）;相较于M组,各组bcl-2 mRNA表达有减少趋势（P>0.05）,bax mRNA减少（P<0.05）,Z组caspase-3 mRNA表达有减少趋势（P>0.05）,S组及X组caspase-3 mRNA表达减少（P<0.05）。（5）对mTOR的影响:M组荧光强于K组,各给药组荧光弱于M组;蛋白印迹法显示相较于K组,M组p-mTOR表达增多,p-mTOR/mTOR的比值增大（P<0.01）;相较于M组,S组及Z组p-mTOR/mTOR的比值有减小趋势（P>0.05）,X组p-mTOR蛋白表达减少,p-mTOR/mTOR的比值减小（P<0.05）。结论:1.慢传输型便秘模型大鼠结肠动力障碍与肠神经系统网络结构损伤程度有关,自噬与凋亡异常可能参与其肠神经系统网络结构损伤过程。2.硝菔通结方能改善慢传输型便秘模型大鼠的便秘症状,缩短首粒黑便排出时间,增加粪便量,增强结肠肌电频率和振幅,促进肠神经系统网络结构修复,提高PGP9.5、c-kit、Sy、Cx43表达。3.硝菔通结方可能通过抑制结肠肌层mTOR磷酸化,增多Beclin-1的表达,减小LC3Ⅰ/Ⅱ比值,减少p62的表达,增强细胞自噬活性,减少bax表达,增大bcl-2/bax比值,减少caspase-3表达,减少细胞凋亡。4.硝菔通结方可能通过调控结肠细胞自噬及凋亡,促进肠神经系统网络结构修复,进而纠正慢传输型便秘模型大鼠结肠动力障碍,改善便秘症状,补肾益精法在其中发挥重要作用。
郜然然[9]（2019）在《补肾养血活血法经PI3K/AKT/mTOR信号通路调控凋亡及自噬流促卵泡发育的分子机制》文中研究表明实验一补肾养血活血法经PI3K/AKT/mTOR信号通路促卵泡发育修复卵巢损伤的实验研究目的:观察补肾养血活血中药复方新加苁蓉菟丝子丸（XJCRTSZW）经PI3K/AKT/mTOR信号通路促卵泡发育修复卵巢损伤的药物疗效。方法:1、从购进的100只健康雌性SD大鼠中筛选出动情周期正常的56只大鼠作为受试动物,随机抽取8只为正常对照组予蒸馏水灌胃,其余48只按照预实验结果,予雷公藤甲素（triptolide,TP）400μg/kg.d的剂量连续灌胃60d构建卵泡发育障碍模型。2、造模后大鼠随机分为6组,每组8只:Triptolide模型组、西药戊酸雌二醇+醋酸甲羟孕酮（EV+DMPA）组、XJCRTSZW低剂量组、XJCRTSZW高剂量组,抑制剂（NVP-BEZ235）组,XJCRTSZW高剂量+抑制剂（NVP-BEZ235）组。西药对照组给予戊酸雌二醇和醋酸甲羟孕酮序贯治疗;中药低、高剂量组分别给予新加苁蓉菟丝子丸低、高剂量浸膏治疗;抑制剂组予NVP-BEZ235灌胃;XJCRTSZW高剂量+抑制剂（NVP-BEZ235）组给予高剂量中药及NVP-BEZ235灌胃;正常对照组和TP模型组给予等量的蒸馏水灌胃。所有动物均灌胃2周,灌胃期间行阴道脱落细胞涂片检查观察大鼠动情周期变化。3、灌胃结束后采血,ELISA法检测血清E2、P、FSH、LH、AMH、ET水平,硝酸还原酶法检测NO水平并计算ET/NO比值;采血后处死大鼠,摘取双侧卵巢组织,称取卵巢湿重,计算卵巢指数;卵巢切片HE染色,光学显微镜下计数初级、次级卵泡、窦状卵泡、闭锁卵泡及黄体的数目,并测量窦状卵泡颗粒细胞层厚度;采用WB法检测卵巢组织中p-PI3K、p-AKT、p-mTOR的蛋白含量。结果:1、新加苁蓉菟丝子丸对大鼠血清性激素的影响:与正常对照组相比,TP模型组大鼠血清中E2、P、AMH含量显着下降,FSH、LH含量显着增加（p<0.01）;而和模型组相比,XJCRTSZW给药后可增加E2、P、AMH含量,降低FSH、LH含量（p<0.01）,且XJCRTSZW高剂量组和西药组效果相当（p>0.05）,而使用通路抑制剂NVP-BEZ235后,XJCRTSZW高剂量组升高E2、P、AMH及降低FSH、LH的能力消失（p<0.01）。2、新加苁蓉菟丝子丸对大鼠血清中ET、NO及ET/NO的影响:与正常对照组相比,TP模型组大鼠血清中ET含量上升,NO含量下降,ET/NO比值显着升高（p<0.01）;而和TP模型组相比,XJCRTSZW给药后可增加NO含量,降低ET含量以及ET/NO比值（p<0.01）,且XJCRTSZW高剂量组与西药组效果相当（p>0.05）。而使用PI3K/AKT/mTOR通路抑制剂NVP-BEZ235后,大鼠卵巢中NO含量所下降,ET含量及ET/NO值有所升高,但无统计学意义（p>0.05）,XJCRTSZW高剂量组对卵巢的保护能力出现了一定程度的消失。3、新加苁蓉菟丝子丸对大鼠卵巢湿重、卵巢指数的影响:与正常对照组相比,TP模型组大鼠卵巢湿重和卵巢指数显着下降（p<0.01）;而和TP模型组相比,XJCRTSZW给药后可一定程度上增加大鼠卵巢湿重和卵巢指数（p<0.01）,且XJCRTSZW高剂量组和西药组效果相当（p>0.05）。而使用PI3K/AKT/mTOR通路抑制剂NVP-BEZ235后,XJCRTSZW高剂量组提升卵巢湿重和卵巢指数的能力消失（p<0.01）。4、新加苁蓉菟丝子丸对大鼠卵泡发育、黄体数及窦状卵泡颗粒细胞层厚度的影响:与正常对照组相比,TP模型组大鼠次级卵泡及窦状卵泡数量减少,黄体数和窦状卵泡颗粒细胞层的厚度降低（p<0.01）,闭锁卵泡数量上升（p<0.01）,而对初级卵泡数目无明显影响（p>0.05）;与TP模型组相比,XJCRTSZW给药后可一定程度上增加大鼠次级卵泡和窦状卵泡数,增加黄体数和窦状卵泡颗粒细胞层的厚度（p<0.01）,减少闭锁卵泡数（p<0.01）,且XJCRTSZW高剂量组和西药组效果相当（p>0.05）。而使用PI3K/AKT/mTOR通路抑制剂NVP-BEZ235后,XJCRTSZW高剂量组的对卵泡发育的保护能力消失（p<0.01）。5、新加苁蓉菟丝子丸对大鼠卵巢组织中p-PI3K、p-AKT、p-mTOR的影响:与正常对照组相比,TP模型组大鼠卵巢组织中p-PI3K、p-AKT、p-mTOR的蛋白水平显着下降（p<0.05或p<0.01）,XJCRTSZW高剂量组可不同程度改善TP造模后对上述分子的影响（p<0.05或p<0.01）,而使用通路抑制剂NVP-BEZ235后,XJCRTSZW高剂量组上调上述分子的能力消失（p<0.05或p<0.01）。结论:雷公藤甲素400μg/kg.d连续灌胃60天,可成功构建大鼠卵泡发育障碍的在体动物模型,其分子机制可能是雷公藤甲素通过下调PI3K/AKT/mTOR信号通路中的关键蛋白p-PI3K、p-AKT、p-mTOR而对该通路进行了抑制。补肾养血活血中药复方新加苁蓉菟丝子丸可通过激活PI3K/AKT/mTOR信号通路改善大鼠的性激素水平,增加大鼠的卵巢湿重和卵巢指数,恢复大鼠的各级卵泡数、黄体数及生长卵泡的颗粒细胞层厚度,改善大鼠的“血瘀”状态,保护大鼠的卵泡发育,修复TP所致的卵巢损伤。实验二补肾养血活血法经PI3K/AKT/mTOR信号通路调控卵巢颗粒细胞凋亡及自噬流促卵泡发育的分子机制目的:探讨补肾养血活血中药复方新加苁蓉菟丝子丸经PI3K/AKT/mTOR信号通路调控大鼠卵巢颗粒细胞（GCs）凋亡及自噬流促卵泡发育的分子机制。方法:1、将体外培养的原代大鼠卵巢GCs分为9组:正常对照组、TP模型组、西药FSH组、XJCRTSZW低高剂量组、自噬诱导剂组、XJCRTSZW高剂量+自噬诱导剂组、凋亡诱导剂组、XJCRTSZW高剂量+凋亡诱导剂组。正常对照组给予蒸馏水灌胃的大鼠血清,其余8组先加TP诱导12h后,模型组给予蒸馏水灌胃的大鼠血清,西药FSH组加入含FSH大鼠血清,中药低、高剂量组分别加入相应剂量的大鼠含药血清,自噬、凋亡诱导剂组分别加入蒸馏水灌胃的大鼠血清及自噬、凋亡诱导剂,XJCRTSZW高剂量+自噬诱导剂组加入XJCRTSZW高剂量血清和自噬诱导剂RAPA,XJCRTSZW高剂量+凋亡诱导剂组加入XJCRTSZW高剂量血清和凋亡诱导剂CPT。2、上述药物及相应大鼠血清孵育48小时后做如下检测。CCK8法检测细胞活力,流式细胞术检测各组GCs的凋亡率,ELISA法检测细胞培养上清中E2、P和AMH水平,mRFP-GFP-LC3腺病毒转染后激光共聚焦显微镜下观察自噬流并计数自噬小体、自噬溶酶体数目,透射电子显微镜下观察各组GCs中的自噬小体及自噬溶酶体形成,WB及RT-qPCR法检测Caspase-3、Cleaved Casepase-3、LC3-II、LC3-I、Beclin-1、p62、LAMP2、Cathepsin-D及PI3K/AKT/mTOR信号通路轴相关分子的蛋白表达及mRNA水平,并计算LC3-II/LC3-I的比值。结果:1、新加苁蓉菟丝子丸对颗粒细胞增殖、凋亡的影响:（1）细胞活力检测:TP造模后,卵巢GCs的细胞活力显着下降（p<0.01）,说明TP对GCs的增殖存在明显抑制。XJCRTSZW高剂量血清组可显着提升GCs活力（p<0.05）。而加用CPT处理细胞后,XJCRTSZW高剂量血清组保护细胞活力的能力出现了明显消失（p<0.05或p<0.01）。说明XJCRTSZW正是通过抑制GCs的凋亡提升了细胞活力,促进了细胞增殖。（2）WB:TP造模后,凋亡相关分子Cleaved Caspase-3（CC3）蛋白表达显着上调（p<0.01）,但对Casepase-3无明显影响,XJCRTSZW高剂量组可明显改善TP造模后对CC3的影响（p<0.01）,而使用CPT后,XJCRTSZW高剂量组下调CC3蛋白表达的能力消失,说明中药通过下调凋亡因子CC3保护了GCs的增殖。（3）流式细胞术:TP造模后GCs凋亡率高达39.54%（仅次于加用了凋亡诱导剂的CPT组）,TP造模后,凋亡率显着上升（p<0.01）。XJCRTSZW高、低剂量组干预后,大鼠GCs凋亡率显着下降（p<0.01）,且XJCRTSZW高剂量组下降最为明显（凋亡率12.67%）,与西药FSH组效果无差异（p>0.05）。加用凋亡诱导剂CPT后,XJCRTSZW高剂量血清组降低细胞凋亡率、抑制细胞凋亡的能力消失（p<0.01）。2、新加苁蓉菟丝子丸对颗粒细胞自噬流的影响:（1）WB法和RT-qPCR法:TP造模后,自噬流相关分子LC3Ⅱ、Beclin1、LAMP2、Cathepsin-D的蛋白表达及mRNA水平显着上调,LC3-II/LC3-I比值上升（p<0.05或p<0.01）,p62的蛋白表达及mRNA水平显着下调（p<0.01）;XJCRTSZW高剂量组可显着下调LC3Ⅱ、Beclin1、LAMP2、Cathepsin-D的蛋白表达及mRNA水平（p<0.05或p<0.01）,上调p62的蛋白表达及mRNA水平（p<0.01）。而使用自噬诱导剂RAPA后,XJCRTSZW高剂量组保护GCs的能力消失。（2）电镜:和正常对照组相比,TP模型组大鼠卵巢GCs中自噬小体以及自噬溶酶体数量增加;和TP模型组相比,XJCRTSZW血清组大鼠卵巢颗粒细胞中自噬小体以及自噬溶酶体数量减少;而加用RAPA处理细胞后,XJCRTSZW高剂量组抑制自噬小体以及自噬溶酶体产生的能力下降。（3）mRFP-GFP-LC3腺病毒转染:TP造模后,大鼠卵巢GCs中自噬小体（黄色斑点）以及自噬溶酶体（红色斑点）数量显着增加（p<0.01）;和TP模型组相比,XJCRTSZW高、低剂量组大鼠卵巢颗粒细胞中自噬小体以及自噬溶酶体数量显着减少（p<0.01）,且XJCRTSZW高剂量组与西药FSH组无差异（p>0.05）。在加用自噬诱导剂RAPA处理细胞后,XJCRTSZW高剂量组抑制自噬小体以及自噬溶酶体产生的能力显着下降（p<0.01）。3、新加苁蓉菟丝子丸对大鼠卵巢颗粒细胞上清中E2、P、AMH分泌的影响:与正常对照组相比,TP模型组大鼠卵巢颗粒细胞上清中E2、P和AMH的含量显着下降（p<0.01）;和模型组相比,XJCRTSZW高剂量组大鼠卵巢GCs上清中E2、P和AMH的含量显着升高（p<0.01或p<0.05）,且XJCRTSZW高剂量组与FSH组效果相当（p>0.05）;在加用RAPA和CPT处理细胞后,XJCRTSZW高剂量组对E2、P、AMH含量的上调作用出现了一定程度的消失,但无统计学意义（p>0.05）。4、新加苁蓉菟丝子丸对大鼠卵巢颗粒细胞PI3K/AKT/mTOR信号通路轴相关分子的影响:通过WB检测我们发现,TP造模后,PI3K/AKT/mTOR通路轴相关蛋白PI3K、AKT、mTOR的磷酸化水平显着下降（p<0.05或p<0.01）;XJCRTSZW高剂量组可明显改善TP造模后对上述分子的影响（p<0.05或p<0.01）;而使用RAPA及CPT后,XJCRTSZW高剂量组的治疗能力消失（p<0.05或p<0.01）。结论:雷公藤甲素可能通过抑制PI3K/AKT/mTOR信号通路一方面增加GCs凋亡率、上调凋亡相关分子Cleaved Caspase-3促进了GCs凋亡,另一方面增加GCs自噬小体和自噬溶酶体的数量,上调自噬相关因子LC3Ⅱ、Beclin1、LAMP2、Cathepsin-D并下调p62激活了GCs自噬流,从而损伤了大鼠卵巢GCs,抑制了卵泡发育。补肾养血活血中药复方新加苁蓉菟丝子丸可能通过激活PI3K/AKT/mTOR信号通路一方面降低GCs凋亡率、下调凋亡相关分子Cleaved Caspase-3抑制了GCs凋亡,另一方面减少GCs自噬小体和自噬溶酶体的数量,下调自噬相关因子LC3Ⅱ、Beclin1、LAMP2、Cathepsin-D并上调p62抑制了GCs自噬流的过度活化,从而修复了TP所致的大鼠卵巢GCs损伤,保护了大鼠卵泡发育,为卵泡发育障碍类疾病提供了防治新靶点,为雷公藤导致的卵巢损伤提供了新的可能的修复方案。
韩敬端,邓婉莹,谢颂苗,邱路萍,黄嘉祺,程子璇,眭道顺,齐庆[10]（2018）在《基于Fli1调节的补肾益精法对硬皮病小鼠EndMT的影响》文中研究说明目的研究补肾益精法中药复方通过干预Fli1表达调控TGF-β信号,抑制系统性硬皮病血管内皮细胞内皮间质转化（endothelial to mesenchymal transition,End MT）的机制。方法采用博来霉素构建硬皮病小鼠模型,分为正常组、模型组、黄芪甲苷组、中药复方组、Fli1 siRNA+中药复方组,其中正常组不予造模。分别采用HE、Masson染色检测小鼠皮肤血管与胶原,采用实时荧光定量聚合酶链式反应法检测各组小鼠皮肤组织Fli1、VE-cadherin和FSP-1 mRNA表达水平;采用蛋白印迹法（Western Blot）检测各组小鼠皮肤组织Fli1、VE-cadherin、FSP-1蛋白表达水平。结果成功建立硬皮病小鼠模型,HE染色与Masson染色结果显示:中药复方组显着降低小鼠皮肤厚度（P<0.01）,胶原纤维减少,血管增多,提示中药复方能改善小鼠皮肤纤维化程度及保护血管; QPCR结果显示:补肾益精中药复方能提高Fli1 mRNA、VE-cadherin mRNA表达,降低FSP-1 mRNA表达。Western Blot结果显示:补肾益精中药复方能提高Fli1、VE-cadherin蛋白表达,降低FSP-1蛋白表达。结论补肾益精法中药复方通过上调Fli1表达,抑制血管内皮间质转化。
二、补肾益精的分子生物学研究（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、补肾益精的分子生物学研究（论文提纲范文）
（1）慢性筋骨病的防治研究——上海中医药大学王拥军教授团队研究思路与方法概述（论文提纲范文）
| 一、学术研究概述 |
| 1. 学术思想与研究方向 |
| 2. 研究成果 |
| (1）发现了椎间盘退变的三期变化规律，建立了脊柱病的分期治疗方案和“非手术+手术+围手术”序贯防治方案。 |
| (2）发现了调控骨代谢的分子机制，建立了补肾益精法治疗骨质疏松症的临床规范化方案和评价体系。 |
| (3）发现了关节炎的发病机制，建立了补肾祛瘀法防治关节炎的临床规范化方案和评价体系。 |
| (4）发现了“肾精亏虚型慢性病”共同发病规律，并建立了中西医结合临床规范化治疗方案，创新发展了“肾藏精”理论。 |
| (5）基于肾主骨现代生物学体系和肾精亏虚型慢性病临床防治体系，构建了中医肾骨表型组学生理、病理参数，系统绘制了生长壮老已“肾骨表型图谱”。 |
| 二、技术平台概况 |
| 三、科研团队及管理制度 |
| 四、主要科研成果及国内外技术交流与合作 |
（2）基于ROS-MAPK-线粒体途径探讨补肾益精方治疗少弱精子症的作用机制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略词 |
| 文献综述 |
| 综述一 中医药治疗少弱精子症的临床研究进展 |
| 1 少弱精子症的定义 |
| 2 病因病机 |
| 3 辨证论治 |
| 4 结语 |
| 参考文献 |
| 综述二 氧化应激对男性精子质量的影响及研究进展 |
| 1 精液中氧化应激的产生 |
| 2 氧化应激对精子质量的影响 |
| 3 氧化应激对精子发生的影响 |
| 4 抗氧化应激治疗策略 |
| 5 结语 |
| 参考文献 |
| 第一部分 基于网络药理学探讨补肾益精方治疗少弱精子症的作用机制 |
| 前言 |
| 1 资料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 参考文献 |
| 第二部分 实验研究 |
| 第一章 补肾益精方对环磷酰胺诱导少弱精子症小鼠模型的作用及抗氧化应激研究 |
| 前目 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第二章 补肾益精方对p38MAPK沉默后TM3细胞凋亡信号的影响 |
| 前言 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第三章 补肾益精方对p38MAPK沉默后Sertoli细胞凋亡信号的影响 |
| 前言 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 参考文献 |
| 结论 |
| 创新点 |
| 不足与展望 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
| 附件：YJD中药成分潜在靶点信息列表（共190个靶点） |
| 中医药科技查新报告书 |
（3）右归饮益精生血的作用机制及其与EPO的相关性（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 第一章 肾精亏虚贫血大鼠模型评价及其与EPO的相关性 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 腺嘌呤致大鼠肾精亏虚评价 |
| 3.2 腺嘌呤致大鼠贫血评价 |
| 3.3 腺嘌呤致肾精亏虚贫血大鼠模型成功的判定依据 |
| 3.4 腺嘌呤致肾精亏虚贫血大鼠EPO减少 |
| 本章讨论 |
| 本章小结 |
| 第二章 右归饮对肾精亏虚贫血大鼠的的改善作用 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 右归饮对肾精亏虚贫血大鼠体质的改善 |
| 3.2 右归饮对肾精亏虚贫血大鼠血常规指标的改善 |
| 3.3 右归饮对肾精亏虚贫血大鼠炎症指标的改善 |
| 3.4 右归饮对肾精亏虚贫血大鼠肾脏纤维化的改善 |
| 本章讨论 |
| 本章小结 |
| 第三章 右归饮改善肾精亏虚贫血大鼠的作用机制 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 右归饮显着升高肾精亏虚贫血大鼠血清和肾脏中EPO的水平 |
| 3.2 右归饮能调控肾精亏虚贫血大鼠肾脏中EPO上游PHD2/HIF2α通路中相关蛋白的表达 |
| 3.3 右归饮能显着上调肾精亏虚贫血大鼠肾脏中EPO上游PI3K/AKT/m TOR/HIF1α通路中相关蛋白的表达 |
| 3.4 右归饮能显着上调肾精亏虚贫血大鼠肾脏中EPO下游JAK2/STAT5 通路中相关蛋白的表达 |
| 本章讨论 |
| 本章小结 |
| 第四章 右归饮益精生血作用机制与EPO相关的逻辑探讨(理论分析) |
| 1.肾精与EPO的主要生成来源相似 |
| 2.肾精与EPO对于机体生理功能均具有非同一般的重要作用 |
| 3.肾精亏虚与EPO降低对机体疾病的发生发展均具有重要影响 |
| 4.补充外源性EPO能够改善肾精亏虚证贫血大鼠的体质 |
| 5.补肾益精名方右归饮改善肾精亏虚贫血大鼠体质的同时伴随着EPO升高 |
| 全文总结 |
| 创新点及意义 |
| 思考与展望 |
| 参考文献 |
| 促红细胞生成素与中医肾精的相似性探讨 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 硕士期间科研工作汇报 |
| 附录:中英文缩略词对照表 |
| 动物外观图片 |
（4）补肾益精汤对弱精症大鼠精子线粒体功能的影响及其相关机制研究（论文提纲范文）
| 1 资料与方法 |
| 1.1 动物 |
| 1.2 药物及试剂 |
| 1.3 主要仪器 |
| 1.4 研究方法 |
| 1.4.1 用药方法 |
| 1.4.2 精子标本的获取 |
| 1.5 统计学处理 |
| 2 结果 |
| 2.1 各组大鼠精液参数比较 |
| 2.2 各组精子RCR、ATP及Cat Sper1 RNA含量比较 |
| 2.3 Pearson相关性分析 |
| 3 讨论 |
（5）促孕安怡方对初老雌性大鼠卵巢储备功能及子宫内膜容受性影响的实验研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 第一部分 理论研究 |
| 一、中医学对于女性生育力的研究 |
| 1 中医对女性生育力发展过程的认识 |
| 2 中医对女性生育力下降乃至不孕的机理探究 |
| 3 中医药对改善高龄女性生育力下降的对策研究 |
| 二、西医学对女性生育力的研究 |
| 1 西医对女性基础生殖内分泌的研究 |
| 2 女性生育力及其影响因素 |
| 3 改善女性生育力的西医疗法 |
| 参考文献 |
| 第二部分 实验研究 |
| 实验一 初老雌性大鼠模型的建立与评价 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 实验二 促孕安怡方对初老雌性大鼠生殖内分泌调控的影响 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 数据统计与处理 |
| 4 结果 |
| 5 讨论 |
| 参考文献 |
| 实验三 促孕安怡方对初老雌性大鼠的卵巢组织形态学及卵巢 SCF、GDF-9 表达的影响 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 数据统计与处理 |
| 4 结果 |
| 5 讨论 |
| 参考文献 |
| 实验四 促孕安怡方对初老雌性大鼠的子宫内膜组织形态学及LIF、HOXA-10m RNA 表达的影响 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 数据统计与处理 |
| 4 结果 |
| 5 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 讨论 |
| 一、促孕安怡方的组方依据及配伍特点 |
| 1 促孕安怡方的组方依据 |
| 2 促孕安怡方的配伍特点 |
| 二、促孕安怡方的治疗优势 |
| 参考文献 |
| 第四部分 结语 |
| 一、研究结论 |
| 二、创新点 |
| 三、不足与展望 |
| 附1 |
| 附2 |
| 文献综述 高龄女性生育力下降的研究进展 |
| 参考文献 |
| 个人简历 |
| 致谢 |
（6）补肾养血活血法治疗卵泡发育障碍类疾病的导师临床经验总结及实验研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略词表 |
| 引言 |
| 第一部分 理论研究 |
| 1.中医对卵泡发育障碍疾病的认识 |
| 1.1 中医病因病机 |
| 1.2 中医治疗及现代研究进展 |
| 2.西医认识及相关研究进展 |
| 2.1 西医对卵泡发育及排出障碍类疾病的认识 |
| 2.2 西医病因 |
| 2.3 西医治疗 |
| 第二部分 导师对卵巢功能低下类疾病的治疗经验特色及病案举隅 |
| 1.病因病机 |
| 2.诊疗经验 |
| 2.1 中西整合,审证求因 |
| 2.2 名方新裁,积极创新 |
| 2.3 善用成药,简便有效 |
| 2.4 助孕保胎,流程明确 |
| 2.5 预防其衰,身心调节 |
| 3.病案三则 |
| 3.1 案例一 |
| 3.2 病案二 |
| 3.3 病案三 |
| 4.小结 |
| 第三部分 实验研究 |
| 1.实验材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 主要实验药品 |
| 1.3 实验主要试剂 |
| 1.4 实验主要设备 |
| 1.5 主要溶液配制 |
| 2.实验方法 |
| 2.1 实验模型 |
| 2.2 实验分组情况及给药方法 |
| 2.3 模型确认与指标检测 |
| 3.数据统计与分析 |
| 4.实验结果 |
| 4.1 雷公藤甲素对各组大鼠动情周期的影响 |
| 4.2 中药组对大鼠一般情况的影响 |
| 4.3 中药组对大鼠卵巢湿重及卵巢指数的影响 |
| 4.4 新加苁蓉菟丝子丸对大鼠各级卵泡,闭锁卵泡、黄体数、次级卵泡和窦状卵泡颗粒细胞层的厚度的影响 |
| 4.5 中药对大鼠血清中各项性激素的影响 |
| 4.6 各组大鼠血液流变学的变化 |
| 4.7 中药对各组大鼠卵巢颗粒细胞自噬小体形成的影响 |
| 4.8 中药对雷公藤甲素诱导的自噬机制确定 |
| 5.讨论 |
| 5.1 补肾养血活血法治疗卵泡发育障碍类疾病的立法依据 |
| 5.2 雷公藤甲素造模依据 |
| 5.3 西药对照药物的选择 |
| 5.4 本实验前期研究背景 |
| 5.5 实验指标结果分析 |
| 7.结论 |
| 问题与展望 |
| 一、存在的问题 |
| 二、展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附件一 |
| 综述一 补肾养血活血法治疗卵泡发育障碍型不孕研究进展 |
| 参考文献 |
| 综述二 中医药调控颗粒细胞自噬研究进展 |
| 参考文献 |
| 附件二 在读期间公开发表的学术论文、专着及科研成果 |
（7）EPO与肾虚雄性生殖功能低下的相关性及右归饮的改善作用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一章 EPO与肾虚雄性生殖功能低下的相关性研究 |
| 第一节 EPO基因敲除雄性小鼠表型与“肾精亏虚证”的相似性观察 |
| 1 试验材料和方法 |
| 2 试验结果 |
| 2.1 EPO基因敲除小鼠的鉴定 |
| 2.2 EPO基因敲除雄性小鼠外观形态、体重、饮食量显着差于野生型小鼠 |
| 2.3 EPO基因敲除雄性小鼠主要脏器组织形态显着差于野生型小鼠 |
| 2.4 EPO基因敲除雄性小鼠精子数量、畸形率、形态显着差于野生型小鼠 |
| 2.5 EPO基因敲除雄性小鼠血液指标显着差于野生型小鼠 |
| 2.6 EPO基因敲除雄性小鼠HIF1α-STAT5 通路蛋白显着低于野生型小鼠 |
| 3 试验讨论 |
| 4 试验小结 |
| 第二节 自然衰老致肾虚雄性生殖功能低下小鼠体质及体内EPO的变化 |
| 1 试验材料和方法 |
| 2 试验结果 |
| 2.1 自然衰老肾虚雄性生殖功能低下小鼠建立成功 |
| 2.2 自然衰老肾虚雄性生殖功能低下小鼠EPO及其信号通路显着变化 |
| 3 试验讨论 |
| 4 试验小结 |
| 第三节 腺嘌呤致肾虚雄性生殖功能低下大鼠体质及体内EPO的变化 |
| 1 试验材料和方法 |
| 2 试验结果 |
| 2.1 腺嘌呤致肾虚雄性生殖功能低下大鼠模型建立成功 |
| 2.2 腺嘌呤致肾虚雄性生殖功能低下大鼠EPO及其信号通路显着变化 |
| 3 试验讨论 |
| 4 试验小结 |
| 第二章 外源性rhEPO对肾虚雄性生殖功能低下动物体质改善及EPO的调节作用观察 |
| 第一节 外源性rhEPO对肾虚雄性生殖功能低下模型动物体质改善作用 |
| 1 试验材料和方法 |
| 2 试验结果 |
| 2.1 外源性rhEPO能显着改善EPO基因敲除雄性小鼠体质 |
| 2.2 外源性rhEPO能显着改善自然衰老肾虚雄性生殖功能低下小鼠体质 |
| 2.3 外源性rhEPO能显着改善腺嘌呤致肾虚雄性生殖功能低下大鼠体质 |
| 3 试验讨论 |
| 4 试验小结 |
| 第二节 外源性rhEPO对肾虚雄性生殖功能低下动物EPO及其信号通路的调节作用 |
| 1 试验材料和方法 |
| 2 试验结果 |
| 2.1 外源性rhEPO显着升高EPO基因敲除雄性小鼠EPO及信号通路 |
| 2.2 外源性rhEPO显着升高自然衰老肾虚雄性生殖低下小鼠EPO及其信号通路 |
| 2.3 外源性rhEPO显着调节腺嘌呤致肾虚雄性生殖低下大鼠EPO及信号通路 |
| 3 试验讨论 |
| 4 试验小结 |
| 第三节 外源性rhEPO对 TM4 细胞缺氧缺糖损伤的保护作用及机制研究 |
| 1 试验材料和方法 |
| 2 试验结果 |
| 2.1 TM4细胞模型条件及给药剂量选择 |
| 2.2 外源性rhEPO能显着保护EPO基因敲除损伤的TM4 细胞 |
| 2.3 外源性rhEPO不能显着保护JAK2、STAT5 蛋白抑制的TM4 细胞 |
| 2.4 外源性rhEPO能显着保护缺氧缺糖损伤的TM4 细胞 |
| 3 试验讨论 |
| 4 试验小结 |
| 第三章 右归饮对肾虚雄性生殖功能低下动物体质改善及EPO的调节作用观察 |
| 第一节 右归饮对肾虚雄性生殖功能低下动物体质改善作用 |
| 1 试验材料和方法 |
| 2 试验结果 |
| 2.1 右归饮不能显着改善EPO基因敲除雄性小鼠体质 |
| 2.2 右归饮能显着改善自然衰老肾虚雄性生殖功能低下小鼠体质 |
| 2.3 右归饮能显着改善腺嘌呤致肾虚雄性生殖功能低下大鼠体质 |
| 3 试验讨论 |
| 4 试验小结 |
| 第二节 右归饮对肾虚雄性生殖功能低下动物体内EPO及其信号通路的调节作用 |
| 1 试验材料和方法 |
| 2 试验结果 |
| 2.1 右归饮不能显着影响EPO基因敲除雄性小鼠EPO及信号通路 |
| 2.2 右归饮能升高自然衰老肾虚雄性生殖低下小鼠EPO及信号通路 |
| 2.3 右归饮能升高腺嘌呤致肾虚雄性生殖低下大鼠体内EPO及调节信号通路 |
| 3 试验讨论 |
| 4 试验小结 |
| 第三节 右归饮对TM4细胞缺氧缺糖损伤的保护作用及机制研究 |
| 1 试验材料和方法 |
| 2 试验结果 |
| 2.1 TM4细胞模型条件及给药剂量选择 |
| 2.2 右归饮不能显着保护EPO基因敲除损伤的TM4细胞 |
| 2.3 右归饮不能显着保护JAK2或STAT5 蛋白抑制损伤的TM4 细胞 |
| 2.4 右归饮能显着保护缺氧缺糖损伤的TM4细胞 |
| 3 试验讨论 |
| 4 试验小结 |
| 全文总结 |
| 创新及意义 |
| 思考与展望 |
| 参考文献 |
| 文献综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 博士期间科研工作汇报 |
| 附录 :中英文缩略词对照表 |
（8）硝菔通结方促进慢传输型便秘大鼠肠神经系统网络结构修复的实验研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 引言 |
| 1 研究背景 |
| 2 研究目的与意义 |
| 3 研究内容 |
| 第一部分 理论研究 |
| 1 现代医学对慢传输型便秘的认识 |
| 1.1 概念 |
| 1.2 流行病学 |
| 1.3 病因与病机 |
| 1.3.1 精神心理因素 |
| 1.3.2 生活习惯因素 |
| 1.3.3 结肠平滑肌损伤 |
| 1.3.4 肠神经系统异常 |
| 1.3.5 神经递质紊乱 |
| 1.3.6 Cajal间质细胞病变 |
| 1.4 临床治疗 |
| 2 慢传输型便秘与结肠细胞自噬及凋亡 |
| 2.1 肠神经系统网络结构损伤是慢传输型便秘主要病理表现 |
| 2.2 结肠细胞自噬影响肠神经系统网络结构形态功能 |
| 2.3 结肠细胞凋亡影响肠神经系统网络结构形态功能 |
| 2.4 自噬与凋亡的关系 |
| 3 中医学对慢传输型便秘的认识 |
| 3.1 病名源流 |
| 3.2 病因病机 |
| 3.2.1 病因 |
| 3.2.1.1 感受外邪 |
| 3.2.1.2 饮食不节 |
| 3.2.1.3 情志不畅 |
| 3.2.1.4 年老体虚 |
| 3.2.1.5 瘀血阻滞 |
| 3.2.2 病机 |
| 3.2.2.1 津液不足 |
| 3.2.2.2 气机郁滞 |
| 3.2.2.3 阳虚寒凝 |
| 3.2.2.4 气血亏虚 |
| 3.2.2.5 阴阳失调 |
| 3.3 辨证论治 |
| 3.3.1 六经辨证论治 |
| 3.3.2 八纲辨证论治 |
| 3.3.3 气血津液辨证论治 |
| 3.3.4 脏腑辨证论治 |
| 3.3.4.1 从肺论治 |
| 3.3.4.2 从脾胃论治 |
| 3.3.4.3 从肝论治 |
| 3.3.4.4 从肾论治便秘 |
| 4 分析与总结 |
| 第二部分 实验研究 |
| 实验一 STC大鼠模型的复制及过程中结肠细胞自噬与凋亡的变化 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 实验药物及制备 |
| 1.3 实验主要试剂 |
| 1.4 实验主要仪器 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 模型建立及评估方法 |
| 2.1.1 模型建立 |
| 2.1.2 模型评估 |
| 2.2 标本采集方法 |
| 2.3 指标观察方法 |
| 2.3.1 病理形态学观察 |
| 2.3.2 肌间神经丛铺片制作方法 |
| 2.3.3 透射电镜标本制作方法 |
| 2.3.4 TUNEL法检测结肠肌层凋亡细胞指数 |
| 2.3.5 Western bolt检测结肠肌层PGP9.5、c-kit、Cx43、Sy、Beclin-1、LC3、p62、bax、bcl-2、caspase-3 蛋白表达的方法 |
| 2.4 统计学处理 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 一般情况的变化 |
| 3.2 首粒黑便排出时间的变化 |
| 3.3 24h便量的变化 |
| 3.4 结肠组织病理形态变化 |
| 3.5 肌间神经丛形态的变化 |
| 3.6 肠神经系统网络结构的变化 |
| 3.6.1 肠神经系统网络超微结构的变化 |
| 3.6.2 肠神经系统网络结构相关蛋白的表达变化 |
| 3.7 自噬相关蛋白Beclin-1、LC3、p62 的表达变化 |
| 3.8 结肠肌层细胞凋亡变化 |
| 3.8.1 TUNEL法检测结肠肌层细胞凋亡变化 |
| 3.8.2 凋亡相关蛋白bcl-2、bax、caspase-3 的表达变化 |
| 4 分析与小结 |
| 4.1 模型成功判断 |
| 4.2 造模过程中结肠形态及肠神经系统网络结构变化 |
| 4.3 造模过程中细胞自噬变化 |
| 4.4 造模过程中细胞凋亡变化 |
| 4.5 造模过程中肠神经系统网络结构损伤与自噬及凋亡关系 |
| 实验二 硝菔通结方对STC模型大鼠肠动力及肠神经系统网络结构的影响 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 实验药物及制备 |
| 1.2.1 硝菔通结方组成 |
| 1.2.2 药物煎煮方法 |
| 1.3 实验主要试剂及器材 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 动物分组及给药方法 |
| 2.1.1 动物分组方法 |
| 2.1.2 造模及给药方法 |
| 2.2 标本采集方法 |
| 2.3 指标检测方法 |
| 2.3.1 一般行为学观察及体质量 |
| 2.3.2 首粒黑便观测方法 |
| 2.3.3 结肠肌电检测方法 |
| 2.3.4 病理形态学观察 |
| 2.3.5 肌间神经丛铺片制作方法 |
| 2.3.6 透射电镜标本制作方法 |
| 2.3.7 免疫荧光检测结肠PGP9.5、c-kit、Sy、Cx43 方法 |
| 2.3.8 Western bolt检测结肠PGP9.5、c-kit、Sy、Cx43 蛋白表达的方法 |
| 2.4 统计学处理 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 对一般行为学及体质量的影响 |
| 3.2 对首粒黑便排出时间的影响 |
| 3.3 对24 小时便量的影响 |
| 3.4 对在体结肠肌电的影响 |
| 3.5 对结肠组织病理形态的影响 |
| 3.6 对肌间神经丛的影响 |
| 3.7 对肠神经系统网络超微结构的影响 |
| 3.8 对结肠肠神经系统网络结构相关蛋白表达水平的影响 |
| 3.8.1 免疫荧光法检测PGP9.5、c-kit、Sy、Cx43 表达水平 |
| 3.8.2 Western Blot法检测结肠PGP9.5、c-kit、Sy、Cx43 蛋白表达水平 |
| 4 分析与小结 |
| 4.1 硝菔通结方对STC大鼠一般情况的影响 |
| 4.2 硝菔通结方对STC大鼠便秘症状的影响 |
| 4.3 硝菔通结方对STC大鼠结肠肌电的影响 |
| 4.4 硝菔通结方对STC大鼠肠神经系统网络结构的影响 |
| 实验三 硝菔通结方对STC模型大鼠结肠细胞自噬与凋亡的影响 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 实验药品及制备 |
| 1.3 实验主要试剂 |
| 1.4 实验主要仪器 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 动物分组及给药方法 |
| 2.2 标本采集方法 |
| 2.3 指标检测方法 |
| 2.3.1 免疫荧光检测Beclin-1、LC3、p62、bax、bcl-2、caspase-3、mTOR方法 |
| 2.3.2 Western Blot检测结肠组织Beclin-1、LC3、p62、bax、bcl-2、caspase-3、p-mTOR、mTOR蛋白表达的方法 |
| 2.3.3 RT-PCR法检测检测结肠组织Beclin-1、LC3、p62、bax、bcl-2、caspase-3 mRNA表达的方法 |
| 2.4 统计学处理 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 硝菔通结方对结肠自噬相关蛋白表达水平的影响 |
| 3.1.1 免疫荧光法检测自噬相关蛋白Beclin-1、LC3、p62 表达水平 |
| 3.1.2 Western Blot法检测自噬相关蛋白Beclin-1、LC3、p62 表达水平 |
| 3.1.3 RT-PCR法观察结肠自噬相关蛋白Beclin-1、LC3、p62mRNA表达水平 |
| 3.2 硝菔通结方对结肠凋亡相关蛋白bcl-2、bax、caspase-3 表达水平的影响 |
| 3.2.1 免疫荧光法检测凋亡相关蛋白bcl-2、bax、caspase-3 表达水平 |
| 3.2.2 Western Blot法检测凋亡相关蛋白bcl-2、bax、caspase-3 表达水平 |
| 3.2.3 RT-PCR法观察结肠肌层凋亡相关蛋白bcl-2、bax、caspase-3 mRNA表达水平 |
| 3.3 硝菔通结方对结肠mTOR表达水平的影响 |
| 3.3.1 免疫荧光法观察结肠组织mTOR的表达水平 |
| 3.3.2 Western Blot法观察结肠肌层p-mTOR的表达水平 |
| 4 分析与小结 |
| 4.1 硝菔通结方对自噬相关蛋白的影响 |
| 4.2 硝菔通结方对凋亡相关蛋白的影响 |
| 4.3 硝菔通结方对mTOR的影响 |
| 第三部分 讨论 |
| 1 大黄灌胃复制慢传输型便秘模型的选择 |
| 2 肠神经系统网络结构损伤与自噬及凋亡变化的探讨 |
| 2.1 肠神经系统网络结构损伤的探讨 |
| 2.2 自噬变化的探讨 |
| 2.3 凋亡变化的探讨 |
| 2.4 自噬、凋亡与肠神经系统网络结构损伤关系的探讨 |
| 3 硝菔通结方治疗慢传输型便秘的理论依据 |
| 3.1 补肾益精法是治疗慢传输型便秘的常用治法 |
| 3.2 硝菔通结方是补肾益精,润肠通便的有效方剂 |
| 3.3 硝菔通结方单味药物分析 |
| 4 对照药物的选择 |
| 5 硝菔通结方治疗慢传输型便秘作用探讨 |
| 5.1 硝菔通结方对STC大鼠一般情况的影响 |
| 5.2 硝菔通结方对STC大鼠便秘症状的影响 |
| 5.3 硝菔通结方对STC大鼠结肠肌电的影响 |
| 5.4 硝菔通结方对STC大鼠结肠病理形态的影响 |
| 5.5 硝菔通结方对STC大鼠肠神经系统网络结构的影响 |
| 5.6 硝菔通结方对STC大鼠结肠细胞自噬与凋亡的影响 |
| 6 补肾益精法作用探讨 |
| 结论 |
| 创新点 |
| 问题与展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附图 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 在读期间公开发表的学术论文、专着及科研成果 |
（9）补肾养血活血法经PI3K/AKT/mTOR信号通路调控凋亡及自噬流促卵泡发育的分子机制（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩略词表 |
| 引言 |
| 第一部分 理论研究 |
| 1.卵泡发育障碍类疾病的研究进展 |
| 1.1 西医认识及研究进展 |
| 1.2 中医认识及研究进展 |
| 2.卵泡发育障碍相关分子机制研究进展 |
| 2.1 细胞凋亡、自噬与卵泡发育、闭锁相关性研究 |
| 2.2 中医药经PI3K/AKT/mTOR通路调控细胞凋亡与自噬 |
| 3.导师对卵巢功能低下与卵泡发育障碍类疾病的认识 |
| 3.1 病因病机 |
| 3.2 诊治经验 |
| 第二部分 实验研究 |
| 本课题研究基础及创新性 |
| 1.课题基础 |
| 2.课题创新点 |
| 实验一 补肾养血活血法经PI3K/AKT/mTOR信号通路促卵泡发育修复卵巢损伤的实验研究 |
| 1.技术路线 |
| 2.实验材料 |
| 2.1 实验动物及实验条件 |
| 2.2 主要药物、试剂及仪器 |
| 3.实验方法 |
| 3.1 实验模型的构建 |
| 3.2 实验分组情况及给药方法 |
| 3.3 检测指标与方法 |
| 4.统计分析 |
| 5.实验结果 |
| 5.1 XJCRTSZW对大鼠一般情况的影响 |
| 5.2 XJCRTSZW对大鼠血清中性激素的影响 |
| 5.3 XJCRTSZW对大鼠血清中ET、NO及ET/NO的影响 |
| 5.4 XJCRTSZW对大鼠卵巢湿重、卵巢指数及卵巢组织的影响 |
| 5.5 XJCRTSZW对大鼠卵巢组织p-PI3K、p-AKT、p-mTOR的影响 |
| 6.讨论 |
| 6.1 补肾养血活血法对于卵泡发育障碍类疾病的干预 |
| 6.2 雷公藤甲素造模 |
| 6.3 阳性药物的选择 |
| 6.4 补肾养血活血法经PI3K/AKT/mTOR信号通路促卵泡发育修复卵巢损伤的结果分析 |
| 7.结论 |
| 实验二 补肾养血活血法经PI3K/AKT/mTOR信号通路调控颗粒细胞凋亡及自噬流促卵泡发育的分子机制 |
| 1.技术路线 |
| 2.实验材料 |
| 2.1 实验动物及实验条件 |
| 2.2 主要药物、试剂及仪器 |
| 3.实验方法 |
| 3.1 大鼠含药血清制备 |
| 3.2 大鼠原代颗粒细胞的提取与培养 |
| 3.3 体外培养大鼠卵巢颗粒细胞鉴定 |
| 3.4 含药血清培养颗粒细胞分组、TP诱导及其他受试药物的添加 |
| 3.5 检测指标与方法 |
| 4.统计分析 |
| 5.实验结果 |
| 5.1 体外培养大鼠卵巢颗粒细胞形态学观察 |
| 5.2 大鼠卵巢颗粒细胞的鉴定 |
| 5.3 XJCRTSZW对大鼠卵巢颗粒细胞活力的影响 |
| 5.4 XJCRTSZW对大鼠卵巢颗粒细胞凋亡率的影响 |
| 5.5 XJCRTSZW对大鼠卵巢颗粒细胞上清中性激素分泌的影响 |
| 5.6 XJCRTSZW对大鼠卵巢颗粒细胞自噬流的影响 |
| 5.7 XJCRTSZW对大鼠卵巢颗粒细胞自噬小体、自噬溶酶体形成的影响 |
| 5.8 XJCRTSZW对大鼠卵巢颗粒细胞凋亡及自噬流相关因子蛋白表达水平的影响 |
| 5.9 XJCRTSZW对大鼠卵巢颗粒细胞中凋亡及自噬流相关因子的mRNA相对表达量的影响 |
| 5.10 XJCRTSZW对大鼠卵巢颗粒细胞p-PI3K、p-AKT、p-mTOR蛋白表达的的影响 |
| 5.11 XJCRTSZW对大鼠卵巢颗粒细胞PI3K/AKT/mTOR信号通路轴相关分子mRNA相对表达量的影响 |
| 6.讨论 |
| 6.1 颗粒细胞被选为研究对象的原因 |
| 6.2 阳性对照药的选择 |
| 6.3 自噬诱导剂与凋亡诱导剂的选择 |
| 6.4 自噬流的检测 |
| 6.5 补肾中药通过细胞信号转导通路调节卵泡发育 |
| 6.6 调控细胞凋亡与自噬是中医药发挥药理作用的重要分子机制 |
| 6.7 补肾养血活血法经PI3K/AKT/mTOR信号通路调控颗粒细胞凋亡及自噬流促卵泡发育的分子机制 |
| 7.结论 |
| 问题与展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附件 |
| 附件一 综述 |
| 综述一 |
| 参考文献 |
| 综述二 |
| 参考文献 |
| 附件二 在读期间公开发表的学术论文、专着及科研成果 |
（10）基于Fli1调节的补肾益精法对硬皮病小鼠EndMT的影响（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.1.1 实验动物 |
| 1.1.2 实验试剂 |
| 1.1.3 实验药物 |
| 1.1.4 实验设备 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.3 实验指标的观察测定 |
| 1.3.1 小鼠皮肤厚度测量 |
| 1.3.2 小鼠皮肤组织病理学观察 |
| 1.3.3 Masson染色 |
| 1.3.4 QPCR提取组织RNA |
| 1.3.5 QPCR检测小鼠皮肤组织Fli1、VE-cadherin、FSP-1 m RNA的表达 |
| 1.3.6 Western Blot检测蛋白表达 |
| 1.4 统计学处理 |
| 2 结果 |
| 2.1 小鼠皮肤厚度 |
| 2.2 HE染色和Masson胶原染色 |
| 2.3 QPCR检测各组小鼠皮肤组织Fli1、VE-cadherin和FSP-1 m RNA的表达 |
| 2.4 Western Blot检测各组小鼠皮肤组织相关蛋白的表达 |
| 3 讨论 |
四、补肾益精的分子生物学研究（论文参考文献）
- [1]慢性筋骨病的防治研究——上海中医药大学王拥军教授团队研究思路与方法概述[J]. 上海中医药大学“慢性筋骨病研究中心”. 世界科学技术-中医药现代化, 2021(10)
- [2]基于ROS-MAPK-线粒体途径探讨补肾益精方治疗少弱精子症的作用机制[D]. 曹. 中国中医科学院, 2021(02)
- [3]右归饮益精生血的作用机制及其与EPO的相关性[D]. 杨欢. 西南大学, 2021(01)
- [4]补肾益精汤对弱精症大鼠精子线粒体功能的影响及其相关机制研究[J]. 王世平,李倩云,崔言秀,吕涛,徐光玉,王策正. 中国中西医结合外科杂志, 2020(06)
- [5]促孕安怡方对初老雌性大鼠卵巢储备功能及子宫内膜容受性影响的实验研究[D]. 马丹凤. 湖北中医药大学, 2020(08)
- [6]补肾养血活血法治疗卵泡发育障碍类疾病的导师临床经验总结及实验研究[D]. 贺宇. 成都中医药大学, 2020(02)
- [7]EPO与肾虚雄性生殖功能低下的相关性及右归饮的改善作用[D]. 李卓恒. 西南大学, 2020
- [8]硝菔通结方促进慢传输型便秘大鼠肠神经系统网络结构修复的实验研究[D]. 孔竞谊. 成都中医药大学, 2019(04)
- [9]补肾养血活血法经PI3K/AKT/mTOR信号通路调控凋亡及自噬流促卵泡发育的分子机制[D]. 郜然然. 成都中医药大学, 2019(04)
- [10]基于Fli1调节的补肾益精法对硬皮病小鼠EndMT的影响[J]. 韩敬端,邓婉莹,谢颂苗,邱路萍,黄嘉祺,程子璇,眭道顺,齐庆. 环球中医药, 2018(10)