一、间质纤维母细胞的增殖活性在肺癌转移中的意义（论文文献综述）
陈鹏[1]（2021）在《陕西汉族非编码RNA基因多态性与结直肠癌风险相关性及MIR17HG与其microRNAs在结直肠癌中的作用研究》文中研究说明目的:通过非编码RNA基因多态性筛选出陕西汉族结直肠癌易感人群,筛选与结直肠癌发生密切相关microRNA,并对其在结直肠癌发生发展中的作用进行探讨,为临床预防及早期诊断结直肠癌提供理论依据。方法:1.设计一项包括514例CRC患者和510例健康对照的病例-对照关联研究,选取9个lnc RNAs基因[MIR137HG、MIR143HG（CARMN）、MIR3142HG、LINC-PINT、MIR124-1HG、MIR675HG（H19）、MIR17HG、MIR497HG和MIR133A1HG]、7个miRNAs基因（MIR577、MIR608、MIR675、MIR192、MIR618、MIR492和MIR423）及GREM1基因的49个SNPs,采用Agena Mass ARRAY基因分型技术,对所筛选的SNPs位点进行基因分型,通过卡方检验、logistic回归分析在遗传模型和分层分析下这些位点与中国陕西汉族人群CRC发病风险及临床病理参数之间的关系。并进行单倍型分析及MDR分析寻找预测CRC风险的最佳模型。2.分析MIR17HG及miR-17-92a簇在CRC病例及对照组的组织及血液中的表达。从TCGA和GDC数据库下载肿瘤RNA-seq数据,分析MIR17HG的mRNA表达。在TCGA数据库中下载生存数据用于生存分析,下载miRNA-seq表达量数据用于分析不同疾病分期的差异。从SRA和GEO数据库中下载数据用于健康人和患者血清及不同临床分期患者血清中游离miR-17-92a簇的丰度比较。3.纳入未经过任何治疗的陕西汉族病例50例,健康对照50例,用RT-qPCR对其血清中miR-17-92a簇的microRNAs表达进行检测,用ROC曲线判断这些microRNAs在诊断结直肠癌病例中的作用。4.用hsa-miR-18a-5p mimics和hsa-miR-18a-5p inhibitor对结直肠癌HCT116和SW480进行处理,研究hsa-miR-18a-5p对结直肠癌细胞的作用。利用shortest path算法分析蛋白互作网络中各基因与表达差异基因之间的网络关系,筛选结直肠癌的候选关键靶基因并进行初步验证。结果:1.rs73376930与增加中国陕西汉族CRC发病风险相关;而rs7549905、rs7318578、rs633727和rs58658771与降低中国陕西汉族CRC发病风险相关。单倍型GA较CA（rs3024270和rs2075744）、单倍型CT较TA（rs4779584和rs58658771）、单倍型AA较AG（rs2293581和rs73376930）均与降低CRC风险相关。含5个SNPs位点的模型（rs9440302,rs353300,rs1582417,rs157928,rs3024270）为预测CRC最佳模型,其交叉检验一致性为9/10,平衡精确性为:0.719,可预测患CRC的风险OR为6.65（95%CI:4.96-8.91）。2.MIR17HG在CRC组织中高表达,在Ⅳ期病例及黑种人中最高。miR-17-92a簇在CRC组织及血清中高表达,hsa-miR-20a-5p表达量最高。3.在陕西汉族结直肠癌病例血清中hsa-miR-18a-5p和has-miR-92a-1相对表达量高于正常人群。hsa-miR-18a-5p表达量与临床分期相关。血清hsa-miR-18a-5p+CEA+AFP诊断早期结直肠癌的AUC=0.899（95%CI:0.836-0.962,P<0.001）,灵敏度=0.88,特异性=0.738,优于单一指标。4.hsa-miR-18a-5p能降低CRC细胞的增殖、克隆形成能力,增加细胞凋亡的发生。用最短距离算法评估hsa-miR-18a-5p可能的11个靶基因,hsa-miR-18a-5p可能通过靶向LIF起到抑制CRC发展的作用。结论:1.非编码RNA基因多态性与结直肠癌风险相关。含五个SNPs的模型可以预测CRC的发病风险。2.MIR17HG与结直肠癌发生密切相关。MIR17HG及其microRNAs在CRC组织中高表达,表达量与临床分期及种族相关。miR-17-92a簇在CRC血清中高表达。3.在陕西汉族CRC血清中hsa-miR-18a-5p、hsa-miR-92a-3p表达量增加,hsa-miR-18a-5p+CEA+AFP在诊断早期结直肠癌中具有优越性。4.hsa-miR-18a-5p的高表达能降低结直肠癌细胞的增殖、克隆形成能力,促进细胞凋亡的发生。
曾琼瑶[2]（2020）在《百里酚通过Wnt/β-catenin信号通路抗结直肠癌作用研究》文中进行了进一步梳理目的:结直肠癌（colorectal cancer,CRC）是最常见的恶性肿瘤之一。过去5-10年中由于饮食结构的改变、老龄化及环境污染等因素,我国结直肠癌的发病率和死亡率迅速上升。对于早期结直肠癌患者手术切除是首选的治疗方案。但在我国约20-25%的结直肠癌患者被诊断时即为IV期出现了转移,另有25%左右的患者在治疗期间出现转移,失去根治性手术治疗的机会,该类型的患者如果不给予任何治疗,其平均生存期仅为6-9个月。除外科手术外,药物治疗在结直肠癌的生长和转移抑制中具有重要的地位。目前化疗联合西妥昔单抗或者贝伐珠单抗在一定程度上能够阻止结直肠癌的进展,但由于肿瘤细胞耐药性的出现及药物本身的毒副作用,导致长期效果差,结直肠癌的术后复发率和死亡率仍较高。因此,寻找一种新的、安全有效的药物显得尤为重要。百里酚（Thymol）是一种天然酚类化合物,在食品、医疗和化妆品领域被认为是安全无毒的。既往研究表明,百里酚在肝癌、胃癌、乳腺癌、肺癌、卵巢癌等多种肿瘤中具有明显的抑制作用,但其作用机制尚不明确。而且,百里酚对结直肠癌是否具有抑制作用、潜在作用机制如何,目前研究甚少。方法:首先利用甲醇对百里香全株进行提取,然后经柱层析及半制备型HPLC纯化后获得活性成分百里酚。利用CCK-8检测百里酚对HCT116和Lovo细胞的增殖抑制及对FHC的细胞毒性作用;平板克隆形成实验检测百里酚对HCT116和Lovo细胞克隆形成能力的影响;流式细胞术检测百里酚对HCT116和Lovo细胞周期分布和凋亡的影响;Transwell迁移和侵袭实验检测百里酚对HCT116和Lovo细胞迁移和侵袭能力的抑制作用。利用针对β-catenin的过表达质粒和小干扰RNA（small interference RNA,si RNA）将HCT116和Lovo细胞中的β-catenin基因分别进行过表达和沉默,进一步分析改变β-catenin的表达对百里酚CRC细胞增殖、迁移和侵袭抑制作用的影响。另外通过皮下注射和尾静脉注射HCT116细胞构建裸鼠皮下移植瘤模型和结直肠癌转移模型,分析百里酚对裸鼠移植瘤生长和结直肠癌血行播散转移的抑制作用。进一步我们采用实时荧光定量PCR、免疫印迹以及免疫组化的方法,从m RNA水平和蛋白水平上检测百里酚对CRC细胞内、瘤体组织及肺转移组织中增殖、凋亡及转移相关基因表达的影响。结果:百里香中主要活性成分-百里酚对HCT116和Lovo细胞的增殖具有明显的抑制作用,且这种抑制作用呈现出一定的时间和浓度依耐性。百里酚（0-120mg/ml）对正常结直肠粘膜FHC细胞无明显的细胞毒作用。与对照组相比较,百里酚各组中细胞克隆形成数明显降低,有显着统计学差异（P<0.001）。细胞周期实验结果显示,百里酚能够有效地将HCT116和Lovo细胞阻滞于G0/G1期。Hoechst33258染色和流式细胞技术分析结果显示百里酚能够诱导CRC细胞的凋亡。Transwell小室迁移和侵袭实验结果显示百里酚能够降低HCT116和Lovo细胞的迁移和侵袭能力,且具有剂量依耐性。百里酚能够通过激活Bax/Bcl-2信号通路诱导CRC细胞凋亡。此外,百里酚能够通过抑制Wnt/β-catenin通路的激活,抑制CRC细胞上皮-间质转化（EMT）、侵袭和转移;β-catenin的过表达能够部分阻遏百里酚对结直肠癌细胞的增殖、迁移、侵袭和EMT抑制作用,反之,β-catenin的沉默能够增加百里酚对结直肠癌细胞的增殖、迁移、侵袭和EMT抑制作用。另外,在体内百里酚能够剂量依耐性的抑制裸鼠移植瘤的生长,同时抑制结直肠癌HCT116细胞的肺转移,其机制可能与百里酚抑制Wnt/β-catenin通路的激活,从而抑制CRC细胞增殖、迁移、侵袭和EMT有关。结论:本研究以百里酚为研究对象,采用多种研究方法证实了百里酚体内外对结直肠癌细胞生长和转移的抑制作用及机制。百里酚能有效的将HCT116和Lovo细胞周期阻滞于G0/G1期,从而抑制增殖。百里酚能够通过下调CRC细胞内Bcl-2/Bax比值,诱导HCT116和Lovo细胞凋亡。百里酚能够降低HCT116和Lovo的迁移和侵袭能力,阻碍EMT进程。在体内百里酚能够抑制裸鼠移植瘤的生长及结直肠癌的肺转移。百里酚抑制CRC细胞的增殖、转移和EMT,其机制可能与百里酚抑制Wnt/β-catenin信号通路的活性有关,β-catenin介导了百里酚的抗结直肠癌作用。综上所述,百里酚能够显着抑制结直肠癌的细胞增殖、侵袭、转移和EMT,其机制可能是通过抑制Wnt/β-catenin通路来实现的;百里酚有望能够作为单一药物或与其他抗癌药物联合用于CRC的治疗。
闫欢[3]（2020）在《基因修饰卵巢癌细胞株的构建及PTK2对卵巢癌细胞生物学行为影响的研究》文中研究指明研究背景卵巢癌（ovarian cancer）是女性生殖系统最常见的恶性肿瘤之一,世界范围内,其发病率在发达国家为9.1/10万,在发展中国家为5.0/10万,死亡率居妇科恶性肿瘤之首。卵巢上皮性癌（ovarian epithelial cancer）占卵巢癌的85～90%,在早期诊断时,卵巢癌患者可以采用手术联合化疗药物治疗,5年生存率接近90%,由于卵巢癌的频繁复发和转移,晚期患者5年生存率降至30%左右。肿瘤的起始和进展与多种抑癌基因失活或者促癌“诱导”基因的过度激活密切相关。近年来,分子靶向治疗发展迅猛,以分子靶向药物治疗为代表的生物治疗模式可以从分子水平调控肿瘤进展,为改善卵巢癌患者预后带来希望。因此,迫切需要探索卵巢癌发生和转移相关的分子机制,探究卵巢癌分子靶向治疗的潜在靶点,提高卵巢癌患者早期诊断率。抑癌基因p53位于17号染色体17p13.1的位置,p53是人类癌细胞中突变率最高的基因。以往的研究发现,p53功能缺陷(p53-/-)在诱导小鼠卵巢上皮细胞发生转化,使其获得肿瘤细胞的形态和功能中发挥重要作用。促癌基因c-Myc位于8号染色体8q24.21位点,在早期应答中发挥重要作用。c-Myc过表达可使细胞出现无限增殖、分化以及恶性转化。研究发现,约30%的卵巢肿瘤存在c-Myc扩增。蛋白酪氨酸激酶（protein tyrosine kinase,PTK2）,又称局灶性粘附激酶（focal adhesion kinase,FAK）,位于染色体8q24.3位点。PTK2在人类多种实体瘤中表达上调,发挥着促癌的作用。研究发现,PTK2过表达与p53突变在人乳腺癌中高度相关,PTK2 N端结构域与p53 N端反式激活结构域可相互作用。PTK2和c-Myc协同调控肿瘤细胞侵袭,抑制整合素/PTK2信号轴和c-Myc可以协同调控卵巢癌恶性生物学行为。有趣的是,我们分析了癌症基因组图谱（the cancer genome atlas,TCGA）,发现在同一组卵巢浆液性癌患者中,包括PTK2、c-Myc和p53在内的三种基因同时发生异常改变,其中88%的卵巢癌患者p53基因发生突变,45%的卵巢癌患者c-Myc基因上调或扩增,同时,超过60%的卵巢癌患者PTK2上调或扩增。因此,我们提出猜想,在p53功能缺陷(p53-/-)的小鼠卵巢上皮细胞中,将癌基因c-Myc和PTK2同时过表达（p53敲除+c-Myc过表达+PTK2过表达）,是否可以促使卵巢上皮细胞发生转化,使其获得卵巢癌恶性生物学功能,是否可以模拟卵巢癌的发生和进展过程,形成卵巢癌细胞?如果该细胞株构建成功,希望能广泛应用于人类卵巢上皮性癌起始和转移的分子机制研究。本研究试图通过基因修饰构建一种小鼠卵巢癌细胞株。课题组利用CRISPR/Cas9系统敲除p53基因,构建了p53敲除质粒,同时构建了c-Myc和PTK2过表达质粒,本研究利用慢病毒载体系统包装质粒并将修饰后的目的基因,以单个或组合方式转染小鼠卵巢上皮细胞,观察其细胞功能性改变,将具有潜在肿瘤生成作用的细胞株种植到小鼠卵巢组织内,建立小鼠卵巢癌模型,进一步观察其在小鼠体内的成瘤效果和肿瘤转移情况。卵巢癌的分子靶向治疗近年来引起人们的广泛关注以及深入研究。基于本课题以上研究,我们看到PTK2在卵巢癌细胞增殖、迁移和侵袭中发挥重要作用,那么,以PTK2为治疗靶点的研究将指导我们更好地理解卵巢癌发生和发展的过程,为卵巢癌的分子靶向治疗带来新的思路。GSK2256098是一种靶向抑制PTK2激酶活性以及Y397位点磷酸化的小分子抑制剂。本研究利用CRISPR/Cas9系统敲除PTK2基因,同时选用GSK2256098靶向抑制PTK2 Y397位点的磷酸化,首次评估敲除和靶向抑制PTK2对卵巢癌细胞增殖、迁移和侵袭等细胞生物学行为的影响及可能机制,以及对卵巢癌小鼠原位移植瘤形成和转移的作用。通过以上研究,希望为卵巢癌的分子靶向治疗及分子机制研究提供研究基础和理论支持。本课题分为三个部分,对以上内容进行探讨。第一部分基因修饰小鼠卵巢癌细胞株的构建目的本部分旨在构建小鼠卵巢癌细胞株,并利用该细胞株建立小鼠卵巢原位移植瘤模型进行功能验证。材料与方法1.材料1.1细胞株:C57BL/6小鼠卵巢上皮细胞,购自美国Cell Biologics公司。1.2质粒:在实验前期,课题组成功构建了p53基因敲除质粒、c-Myc基因过表达质粒以及PTK2基因过表达质粒。1.3动物:选用4周大小的NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/Sz J（NSG）免疫缺陷雌性小鼠,购自Jackson实验室。2.方法2.1将成功构建的质粒进行转化和提取,利用慢病毒载体系统包装p53敲除质粒、c-Myc过表达质粒以及PTK2过表达质粒。2.2建立稳定转染细胞株及分组将包装后的质粒以单个、两两组合、三者组合的形式分别转染正常小鼠卵巢上皮细胞,共分为8组:p53敲除组(p53-/-组)、c-Myc过表达组（c-Myc组）、PTK2过表达组（PTK2组）、p53敲除+c-Myc过表达组(p53-/-+c-Myc组)、p53敲除+PTK2过表达组(p53-/-+PTK2组)、PTK2过表达+c-Myc过表达组（PTK2+c-Myc组）、p53敲除+c-Myc过表达+PTK2过表达组(p53-/-+c-Myc+PTK2组)以及空质粒载体转染组（对照组）。Western blot方法检测8组细胞p53、c-Myc以及PTK2蛋白水平。2.3 MTT方法、单层细胞克隆形成试验和软琼脂细胞克隆形成试验检测8组基因修饰小鼠卵巢上皮细胞增殖能力和细胞克隆形成能力。细胞迁移和侵袭实验检测8组基因修饰细胞迁移和侵袭能力。2.4筛选出具有潜在肿瘤生成能力的基因修饰细胞株,将该组细胞种植到免疫缺陷NSG小鼠卵巢组织,观察其成瘤效果及转移情况。2.5采用SPSS 22.0进行统计分析,结果统计采用（x±s）表示,进行正态性检验,两组比较采用独立样本t检验,超过两组采用单因素方差分析。以α=0.05为检验水准。结果1 PTK2、c-Myc和p53蛋白在基因修饰小鼠卵巢上皮细胞株的表达与对照组（0.06±0.02）相比,PTK2蛋白在PTK2组（1.22±0.11）、PTK2+c-Myc组（1.11±0.11）、p53-/-+PTK2组（0.86±0.09）及p53-/-+c-Myc+PTK2组（1.34±0.16）基因修饰细胞株表达水平升高,差异均具有统计学意义（P<0.001）。与对照组（0.08±0.02）相比,c-Myc蛋白在c-Myc组（0.56±0.04）、PTK2+c-Myc组（1.01±0.12）、p53-/-+c-Myc组（0.76±0.09）及p53-/-+c-Myc+PTK2组（1.23±0.15）基因修饰细胞株表达水平升高,差异均具有统计学意义（P<0.001）。与对照组（0.45±0.05）相比,p53蛋白在p53-/-组（0.01±0.01）、p53-/-+c-Myc组（0.02±0.01）、p53-/-+PTK2组（0.03±0.01）及p53-/-+c-Myc+PTK2组（0.04±0.01）基因修饰细胞株表达水平下降,差异均具有统计学意义（P<0.001）。2基因修饰小鼠卵巢上皮细胞增殖能力与对照组及其他6组基因修饰细胞相比,p53-/-+c-Myc+PTK2组细胞增殖能力显着上升,差异具有统计学意义（P<0.01）。与对照组相比,p53-/-+PTK2组、p53-/-+c-Myc组及PTK2+c-Myc组细胞增殖能力上升（P<0.01）。与对照组相比,p53-/-组、c-Myc组及PTK2组细胞增殖能力在整个测定期内均无统计学差异（P>0.05）。3基因修饰小鼠卵巢上皮细胞克隆形成结果与对照组（4.33±1.53）及其他6组基因修饰细胞相比,p53-/-+c-Myc+PTK2组单层细胞克隆形成数量（93.67±6.11）显着增加（P<0.001）。与对照组（4.33±1.53）相比,p53-/-组（15.00±0.07）、p53-/-+PTK2组（23.33±3.06）及p53-/-+c-Myc组（36.00±2.65）单层细胞克隆形成数量增加,差异有统计学意义（P<0.01）。与对照组相比,PTK2+c-Myc组、PTK2组及c-Myc组单层细胞克隆形成数量无明显增加,差异无统计学意义（P>0.05）。与对照组（6.67±1.53）及其他6组基因修饰细胞相比,p53-/-+c-Myc+PTK2组细胞软琼脂中克隆形成数量显着增加（82.67±6.81）,差异有统计学意义（P<0.001）。与对照组相比,其他6组基因修饰细胞软琼脂中克隆形成数量无明显增加,差异无统计学意义（P>0.05）。4基因修饰小鼠卵巢上皮细胞迁移和侵袭结果与对照组（16.00±1.00）及其他6组基因修饰细胞相比,p53-/-+c-Myc+PTK2组细胞迁移数量（85.33±5.03）显着增加,差异有统计学意义（P<0.001）。与对照组（16.00±1.00）相比,p53-/-+PTK2组（26.00±2.00）和p53-/-+c-Myc组（34.00±3.60）细胞迁移数量增加（P<0.01）。与对照组（16.00±1.00）相比,p53-/-组（15.33±1.53）、PTK2组（14.00±2.00）、c-Myc组（18.67±2.08）及PTK2+c-Myc组（17.33±1.53）细胞迁移数量无明显增加,差异无统计学意义（P>0.05）。与对照组（11.00±1.00）及其他6组基因修饰小鼠卵巢上皮细胞株相比,p53-/-+c-Myc+PTK2组细胞侵袭数量（60.30±6.11）显着增加,差异有统计学意义（P<0.001）。与对照组（11.00±1.00）相比,p53-/-组（20.33±2.52）、PTK2+c-Myc组（21.00±3.46）、p53-/-+PTK2组（20.67±3.06）及p53-/-+c-Myc组（21.00±2.65）细胞侵袭数量增加（P<0.05）。与对照组（11.00±1.00）相比,PTK2组（12.33±0.58）和c-Myc组（14.00±1.00）细胞侵袭数量无明显增加,差异无统计学意义（P>0.05）。5基因修饰小鼠卵巢上皮细胞株的筛选诱发小鼠原代细胞发生转化,使其获得肿瘤细胞特征,能在悬浮状态下成簇生长是本研究能否成功的关键。p53-/-+c-Myc+PTK2组细胞增殖能力、细胞克隆形成能力、迁移能力、侵袭能力显着高于对照组和其他6组基因修饰细胞株（P<0.01）。虽然p53-/-+PTK2组和p53-/-+c-Myc组单层细胞克隆形成、细胞侵袭和迁移数量高于对照组（P<0.05）,然而p53-/-+PTK2和p53-/-+c-Myc组软琼脂细胞克隆形成数量与单基因修饰组相比,无统计学差异（P>0.05）,而p53-/-+c-Myc+PTK2组软琼脂细胞克隆形成数量显着多于其他各组（P<0.001）。软琼脂中克隆形成试验结果可以反应细胞锚定非依赖性生长能力,即悬浮状态下细胞成簇生长能力,可以作为评判细胞是否具有肿瘤生长特性的金标准。结果说明只有p53-/-+c-Myc+PTK2组细胞获得了肿瘤细胞锚定非依赖性生长的特性。因此,我们认为在8组基因修饰组合细胞中,p53-/-+c-Myc+PTK2组细胞具有潜在成瘤能力,本课题筛选出p53-/-+c-Myc+PTK2组细胞株进行小鼠卵巢原位移植瘤模型构建。6荧光素酶基因标记小鼠卵巢上皮细胞利用慢病毒载体包装荧光素酶基因,分别转染正常小鼠卵巢上皮细胞和p53-/-+c-Myc+PTK2组细胞株,传代培养后测定细胞荧光强度值,结果显示两组细胞的荧光值均大于106,说明荧光素酶基因已经整合到小鼠细胞DNA中,可以进行后续移植瘤模型的构建。7基因修饰p53-/-+c-Myc+PTK2细胞在NSG小鼠成瘤将p53-/-+c-Myc+PTK2细胞在显微镜下种植到NSG小鼠单侧卵巢组织,构建小鼠卵巢原位移植瘤模型。每周进行荧光强度值监测,12周后可以观察到基因修饰p53-/-+c-Myc+PTK2小鼠卵巢组织形成肿瘤。处死小鼠,发现基因修饰p53-/-+c-Myc+PTK2小鼠出现血性腹水。剥离卵巢,发现卵巢组织周围出现肿瘤组织。查看肿瘤转移情况,发现p53-/-+c-Myc+PTK2组小鼠出现广泛腹腔转移,转移的脏器包括肝脏、脾脏和肠等。结论本部分成功构建了p53-/-+c-Myc+PTK2细胞株,并应用p53-/-+c-Myc+PTK2细胞株成功建立了小鼠卵巢癌模型,模拟了卵巢癌体内形成和转移的过程,该细胞株有望用于卵巢癌发生和发展的分子机制研究。第二部分PTK2在卵巢癌细胞增殖、迁移和侵袭中的作用研究目的研究PTK2在卵巢癌细胞增殖、迁移和侵袭等生物学行为中的作用。材料与方法1材料1.1细胞株:SKOV3、OVCAR8细胞购于美国菌种中心。1.2质粒:PTK2基因敲除质粒。2方法2.1统计分析Kaplan Meir Plot数据库PTK2在卵巢癌组织中的表达情况及与预后的关系;采用免疫荧光方法检测卵巢癌组织及癌旁组织中PTK2的表达。2.2利用慢病毒载体包装PTK2基因敲除质粒。建立PTK2基因敲除质粒稳定转染细胞株,对照组为空质粒转染组。同时采用小分子抑制剂GSK2256098抑制PTK2关键激活位点（p-FAK）Y397,进行靶向抑制PTK2活化,对照组为DMSO对照。2.3敲除PTK2或使用GSK2256098抑制PTK2活性后,MTT方法、细胞克隆形成实验检测细胞增殖、克隆形成能力变化情况。Transwell迁移/侵袭实验检测细胞迁移和侵袭能力变化情况。2.4统计方法见第一部分。结果1 PTK2在卵巢癌组织中高表达且与卵巢癌患者预后相关PTK2高表达组患者生存期显着低于PTK2低表达组（P<0.05）。PTK2在肿瘤细胞胞浆中强染色,与癌旁组织相比,PTK2在卵巢癌组织中高表达。2敲除PTK2或使用GSK2256098抑制PTK2活性后,降低卵巢癌细胞中PTK2蛋白及磷酸化水平敲除PTK2基因,在SKOV3和OVCAR8细胞系中均检测不到PTK2的表达。检测GSK2256098对PTK2的主要激活位点Y397的抑制效果,GSK2256098给药浓度分别为0、5、10、20、40μmol/L,作用时间24 h。与对照组相比,当GSK2256098浓度为40μmol/L时对卵巢癌细胞中p-FAK抑制效果显着,差异具有统计学意义（P<0.001）。3敲除PTK2或使用GSK2256098抑制PTK2活性后,降低卵巢癌细胞的增殖能力与敲除对照组相比,卵巢癌SKOV3和OVCAR8细胞的增殖能力在PTK2敲除组显着降低（P<0.05）。与加药对照组相比,卵巢癌SKOV3和OVCAR8细胞的增殖能力在GSK2256098组显着降低（P<0.05）。4敲除PTK2或使用GSK2256098抑制PTK2活性后,降低卵巢癌细胞的克隆形成能力与敲除对照组（75.67±5.50）、（46.33±6.50）相比,PTK2敲除组SKOV3和OVCAR8细胞单层克隆形成数量（18.67±4.50）、（11.00±4.60）显着降低（P<0.05）。与加药对照组（53.67±4.16）、（34.00±4.00）相比,GSK2256098组SKOV3和OVCAR8细胞单层克隆形成数量（17.00±4.00）、（13.7±4.04）显着降低（P<0.05）。5敲除PTK2或使用GSK2256098抑制PTK2活性后,降低卵巢癌细胞的迁移和侵袭能力与敲除对照组（106.30±8.50）、（39.67±8.08）相比,PTK2敲除组SKOV3和OVCAR8细胞迁移数量（43.70±8.50）、（20.67±4.51）显着降低（P<0.05）。与加药对照组（73.33±8.02）、（55.00±7.21）相比,GSK2256098组SKOV3和OVCAR8细胞迁移数量（27.67±3.51）、（28.00±7.00）显着降低,差异具有统计学意义（P<0.05）。细胞侵袭实验结果表明,与敲除对照组（79.33±6.03）、（42.00±4.58）相比,PTK2敲除组SKOV3和OVCAR8细胞侵袭数量（19.00±2.00）、（23.00±3.00）显着降低（P<0.05）。与加药对照组（80.30±8.96）、（36.33±5.69）相比,GSK2256098组SKOV3和OVCAR8细胞侵袭数量（22.67±2.52）、（18.33±2.52）显着降低（P<0.05）。结论PTK2在卵巢癌中发挥促癌作用;PTK2敲除或靶向抑制降低了卵巢癌细胞的增殖、克隆形成、迁移和侵袭能力;PTK2有望成为卵巢癌的早期治疗靶点。第三部分PTK2在卵巢癌小鼠原位移植瘤形成和转移中的作用研究目的研究PTK2在卵巢癌小鼠原位移植瘤形成和转移中的作用。材料与方法1材料动物:实验选用4周大小的NSG免疫缺陷雌性小鼠。2方法2.1敲除PTK2基因后,构建人卵巢癌SKOV3细胞NSG免疫缺陷小鼠原位移植瘤模型,每周使用Xenogen在体成像系统监测肿瘤生长和转移情况。2.2将人卵巢癌细胞OVCAR8种植到小鼠卵巢组织,随机分成两组,一组采用GSK2256098治疗（灌胃,75 mg/kg/d,每周治疗5天,共4周）,另一组采用DMSO进行对照治疗,每周使用Xenogen在体成像系统监测肿瘤生长和转移情况。2.3统计方法同第一部分。结果1 PTK2敲除后抑制卵巢癌小鼠原位移植瘤形成和转移与敲除对照组相比,PTK2敲除组卵巢肿瘤组织平均最大荧光强度值显着降低（P<0.001）。分离肿瘤组织,与敲除对照组相比,PTK2敲除组小鼠卵巢肿瘤组织重量显着降低（P<0.001）。对照组小鼠肝脏、脾脏和肠等多个器官均出现肿瘤组织转移,而PTK2敲除组小鼠未发现肿瘤组织转移情况。2抑制PTK2活性后降低卵巢癌小鼠原位移植瘤形成和转移与治疗对照组相比,GSK2256098治疗组小鼠卵巢肿瘤组织平均最大荧光强度值显着降低（P<0.001）。分离小鼠肿瘤组织,与治疗对照组相比,GSK2256098治疗组小鼠原位卵巢肿瘤组织重量显着降低（P<0.001）。治疗对照组出现肝脏、脾脏及肠肿瘤组织转移,而GSK2256098治疗组未发现肿瘤组织转移现象。结论PTK2敲除或靶向抑制降低卵巢癌小鼠原位移植瘤的形成和转移能力
李佳林[4]（2020）在《FOXD3与SCF-β-TRCP1对肺癌与结肠癌骨转移等恶性生物学行为影响和机制研究》文中提出第一部分FOXD3蛋白对肺癌骨转移等恶性生物学行为影响及机制研究研究目的:肺癌分别是全球男女性发病率排名第二的恶性肿瘤;骨转移尤其是脊柱转移是导致肺癌不良预后的重要因素。肿瘤干细胞与肿瘤发生发展、侵袭转移密切相关。FOXD3与胚胎发育及恶性瘤发生有相关性,但其对肺癌的作用机制有待进一步探究。同时FOX（forkhead box）蛋白家族是常用临床药物治疗靶点,本研究的目的是探究FOXD3对肺癌干细胞的调控机制及对骨转移相关恶性生物学行为影响,为临床药物开发提供理论支持。研究方法:本研究利用前期实验室构建的特异性脊柱转移肺癌细胞系,评估此细胞系的肿瘤干细胞特性,通过癌球形成和再分化实验、细胞耐药性分析和细胞迁移实验对FOXD3在肺癌肿瘤干细胞内的功能进行分析评价;通过细胞实验及载瘤动物模型进一步将FOXD3对肿瘤恶性生物学行为影响进行探究,同时使用全基因组RNASeq和Ch IP-Seq分析来预测FOXD3在肺癌干细胞中的直接作用靶基因位点,并通过双荧光素酶报告系统及细胞功能实验验证其相互作用及参与调控的信号通路。结果:肺癌脊柱转移细胞具有肿瘤干细胞特征;FOXD3在脊柱转移细胞及肿瘤干细胞内表达下调。同时发现,FOXD3在体外和体内水平均与肿瘤干细胞的扩增和迁移、肿瘤细胞耐药性以及骨转移灶破骨细胞分化呈负相关关系。FOXD3通过对WDR5的转录阻遏,实现对其表达调控的作用,最终达到对肺癌干细胞相关生物学功能调控。结论:本研究揭示了FOXD3作为肺癌肿瘤抑制因子的作用机制,我们证明了FOXD3可以通过抑制WDR5在肺癌中的表达来抑制肿瘤干细胞的积累,从而影响肺癌生物学进程,进而参与肺癌骨转移、骨破坏等恶性生物学行为发生与发展的调控。WDR5做为临床常用药物开发靶点,该研究为进一步探索肺癌治疗,特别针对骨转移相关事件的靶向药物治疗提供了潜在靶点及理论基础。第二部分乙酰化依赖的SCF-β-TRCP1功能调节与其对结直肠癌恶性生物学行为影响及机制研究研究目的:结直肠癌是第三大常见恶性肿瘤性疾病,是全球恶性肿瘤导致死亡的主要原因。SCF-β-TRCP1泛素化系统与结直肠癌关系密切,可通过泛素化降解β-catenin等癌基因实现对结直肠癌调控。本研究主要探讨β-TRCP1的乙酰化调节途径对结直肠癌恶性生物学行为的影响,探索β-TRCP1新的调节途径,为结直肠癌治疗提供可行的靶点与思路。研究方法:我们通过WB实验、免疫共沉淀、泛素化实验、CHX蛋白降解等实验找到参与β-TRCP1乙酰化调控的相关乙酰化/去乙酰化酶,进而通过细胞功能实验探究β-TRCP1乙酰化水平对结直肠癌恶性生物学行为的影响,并通过临床标本免疫组化染色进行验证;最后找到β-TRCP1反向调控乙酰化酶稳定性的具体机制,构建完整反馈调节环路。结果:本研究阐明GCN5-SIRT1系统介导的SCF-β-TRCP1乙酰化修饰路径:乙酰化酶GCN5参与β-TRCP1乙酰化过程,去乙酰化酶SIRT1参与β-TRCP1去乙酰化过程。乙酰化影响β-TRCP1蛋白稳定性的同时增强结肠癌中β-TRCP1的抑癌功能;β-TRCP1可通过CKⅡ磷酸化依赖的泛素化途径降解SIRT1,同时这种效果可以被Pin1蛋白所拮抗。这项研究阐明了控制β-TRCP1稳定性及其E3连接酶功能活性的新上游途径。结论:研究揭示TRCP/GCN5/SIRT1相互作用的新机制,由此GCN5/SIRT1可以以乙酰化依赖性的方式调控β-TRCP1的功能与蛋白稳定性。除充当调节剂外,SIRT1还充当β-TRCP1的底物,进而影响自身乙酰化过程;GCN5/SIRT1活性的启动推动了反馈回路的产生,影响β-TRCP1功能。在β-TRCP1调节过程中,CKⅡ磷酸化通路和SIRT1乙酰化途径之间存在潜在的联系,CKⅡ可以磷酸化SIRT1,介导其被β-TRCP1识别并通过泛素化途径降解从而影响去乙酰化酶活性。该研究确定了乙酰化依赖的β-TRCP1功能调控新机制,并提供了有关乙酰化系统调控E3连接酶活性的新线索。
郭佳[5]（2020）在《活性氧促进肺支气管细胞上皮间质转化和肺腺癌细胞迁移的机制研究》文中研究指明环境污染物、偶然的化学接触以及电离和紫外线辐射都可以直接或间接增加细胞内活性氧（ROS）的水平,作为气体交换的重要器官,肺常常受到ROS的攻击。ROS会加速肺的纤维化进程,也可以促进肺癌细胞的迁移能力,但ROS参与肺纤维化和肺癌细胞迁移的具体机制有待深入研究。其中,上皮间质转化（EMT）在肺纤维化过程中具有重要的作用。过量的ROS会引起DNA的氧化损伤。因此,对DNA损伤修复产物8-氧鸟嘌呤（8-oxoG）与肺EMT关系的研究十分必要;另外,肺癌细胞迁移是造成肺癌病人死亡的主要原因。趋化因子SDF-1与其特异性受体CXCR4和ACKR3参与肿瘤细胞向靶器官的迁移和侵袭。然而,在肺癌细胞迁移过程中ROS与CXCR4和ACKR3的关系尚不明确。因此,本论文重点研究了:（1）8-oxoG与肺支气管上皮细胞发生EMT的关系;（2）ROS对肺腺癌细胞迁移能力、CXCR4和ACKR3的影响。一方面,通过免疫荧光技术和实时荧光定量PCR检测了8-oxoG对肺支气管上皮细胞形态的影响和EMT标志基因的影响;随后,向小鼠气管灌注GOx或者8-oxoG,观察了对肺组织显微结构的影响;另一方面,通过Transwell实验研究了GOx对A549细胞向SDF-1迁移能力的影响,并通过实时荧光定量PCR检测了GOx对CXCR4和ACKR3的影响。主要结果如下:1.8-oxoG使HBEC细胞由经典的鹅卵石上皮细胞形态转变为间质细胞形态,使α-SMA的蛋白表达量上升、SNAI1蛋白表达量上升和E-cadherin蛋白表达量下降,也使α-SMA和SNAI1的mRNA表达量显着升高,这些EMT标志蛋白的变化共同表明8-oxoG处理会诱导HBEC细胞发生EMT;虽然E-cadherin的mRNA表达量显着升高,但不排除经过更长的时间会表现出下降的可能性;β-catenin的mRNA表达量虽然无显着变化,但有由细胞质进入细胞核的现象;collagen I和FSP1的mRNA表达量显着升高,也与EMT相符。2.GOx处理一周的小鼠肺组织的肺泡出现大量白细胞;GOx和8-oxoG处理两周的小鼠肺组织成纤维细胞增多,伴有胶原沉积,表明ROS和8-oxoG能够引起肺纤维化。3.SDF-1能够显着地引起A549细胞迁移;GOx能够使A549细胞产生ROS,并显着增加A549细胞对SDF-1的敏感性;GOx刺激可以使CXCR4的mRNA表达量在12和24 h时均显着上升,ACKR3的mRNA表达量在12 h显着上升和24 h时显着下降。结果提示我们,A549对于SDF-1敏感性的增加可能是CXCR4的表达量上调引起的。综合以上结果,ROS的DNA损伤修复产物8-oxoG引起肺支气管上皮细胞发生EMT和肺纤维化。此外,ROS增加了SDF-1的受体CXCR4的表达量,并增加了肺腺癌细胞的迁移能力。本论文的完成对于深入了解ROS引起肺纤维化和肺腺癌转移的机制具有一定的理论意义。
杜江[6]（2020）在《MiRNA-451调控c-Myc在三阴性乳腺癌侵袭转移作用的研究》文中认为目的:分别观察miRNA-451、c-Myc以及E-cadherin在三阴性乳腺癌、癌旁组织中的表达情况以及相互关系,验证miRNA-451与c-Myc表达之间可能存在的调控关系,通过慢病毒转染,观察miRNA-451不同表达水平下c-Myc、E-cadherin蛋白表达变化,以及调控c-Myc表达对三阴性乳腺癌细胞增殖活性、细胞迁移、侵袭能力以及细胞周期、凋亡的影响。方法:（1）收集2016-08至2018-02新疆医科大学附属肿瘤医院三阴性乳腺癌标本16例,采用自身配对的方式对乳腺癌组织以及癌旁组织中作为实验组以及对照组PCR方法和Western Blot检测miRNA-451、c-Myc及E-cadherin的基因、蛋白表达水平;（2）首先构建c-Myc 3’UTR野生及突变质粒,生物信息方法分析并预测可能的转录因子结合位点,PCR方法扩增c-Myc基因3’-UTR序列,连接于荧光素酶报告检测各组荧光素酶活性,以海肾荧光素酶作为对照,检测细胞干预前后萤光素酶变化情况。双荧光素酶报告结果,以萤火虫/海肾荧光素酶比值表示;（3）构建稳定的MDA-MB-231细胞,培养稳定传代2-3代后,分为五组:1)BLANK组（不转染任何质粒）;2)miRNA-451-mimics-NC（拟似物阴性对照组）;3)miRNA-451-mimics4（拟似物组）;4)miRNA-451-inhibitor-NC（抑制物阴性对照组）;5)miRNA-451-inhibitor（抑制物组）,使用PCR方法和Western Blot分别检测各组中miRNA-451、c-Myc及E-cadherin的基因及蛋白表达水平,CCK8方法检测细胞增殖,Transwell法检测细胞迁移侵袭,流失细胞仪检测细胞周期变化和凋亡情况。结果:1)三阴性乳腺癌组织中c-Myc表达水平显着高于癌旁组织（t=-2.447,P=0.022）,三阴性乳腺癌组织中miRNA-451表达水平显着低于癌旁组织（t=3.799,P=0.001）,三阴性乳腺癌组织中E-cadherin表达水平显着低于癌旁组织（t=2.309,P=0.028）,c-Myc、miRNA-451与E-cadherin存在负相关关系（相关系数=-2.489,P=0.021）,c-Myc、miRNA-451以及E-cadherin表达情况与临床资料统计分析未见明显相关性（P>0.05）。2)数据库检测结果显示miRNA--451与c-Myc存在互补结合位点,荧光素酶活性检测结果表明miRNA-451mimic能够与c-Myc基因3’-UTR结合并抑制荧光素酶活性;与对照组相比,野生型载体中的报告荧光活性显着下降,差异具有统计学意义（P<0.05）。miRNA-451与c-Myc基因存在互补区域,miRNA-451通过结合c-Myc3’UTR区下调c-Myc的表达,c-Myc是miRNA-451抑制乳腺癌EMT和侵袭转移的主要靶标基因。3)RT-PCR以及Western Blot检测显示,与空白对照组相比,三阴性乳腺癌MDA-MB-231细胞系转染miRNA-451-mimics后,c-Myc表达量显着降低（P<0.05）,E-cadherin表达量显着升高（P<0.05）;转染miRNA-451-inhibitor后,c-Myc表达量显着升高（P<0.05）,E-cadherin表达量显着降低（P<0.05）。三阴性乳腺癌细胞过表达miRNA-451后,不仅明显抑制细胞的增殖能力、迁移、侵袭能力,流式细胞检测提示细胞G0/G1期比例增加,从而促进细胞凋亡。三阴性乳腺癌中miRNA-451过表达可抑制肿瘤活性。c-Myc在高转移潜能的三阴性乳腺癌中过表达,miRNA-451的过表达可抑制肿瘤细胞EMT和侵袭转移。结论:（1）三阴性乳腺癌组织中c-Myc呈高表达状态,三阴性乳腺癌组织中miR-451以及E-cadherin呈低表达状态,并呈负向相关的关系;（2）miRNA-451与c-Myc具有互补结合位点,并存在负向靶标调节关系,c-Myc是miRNA-451的下游靶基因;（3）在三阴性乳腺癌中,miRNA-451的表达沉默可导致c-Myc的过表达,从而下调E-cadherin的表达,导致EMT以及肿瘤侵袭转移的发生。
任莹慧[7]（2020）在《肿瘤相关成纤维细胞的自噬水平在其促进肺癌细胞转移中的作用机制研究》文中研究指明研究目的:肺癌是最常见、死亡率最高的恶性肿瘤。肿瘤转移是阻碍肺癌临床有效治疗的关键问题,因此深入探究肺癌转移机制并开发针对性的治疗策略刻不容缓。肿瘤微环境因其可以从多个方面参与肿瘤的发生发展过程,近些年受到广泛关注。肿瘤相关成纤维细胞（cancer-associated fibroblasts,CAFs）是肿瘤微环境中最丰富的细胞成分之一,其能够通过直接接触或旁分泌的方式促进肿瘤的进展,因此成为实体肿瘤治疗的潜在靶点。细胞自噬是一种在进化上高度保守的细胞过程,其可以使细胞在面对营养物质缺乏等压力时通过批量降解细胞内容物得以存活。研究发现自噬过程在肿瘤发生、发展和治疗中至关重要。然而,CAFs的自噬水平以及其对肺癌细胞的增殖和侵袭转移的影响尚不清楚。因此,本研究从肺癌CAFs的自噬水平入手,利用自噬抑制和激活剂等材料和方法,系统探究CAFs的自噬水平在CAFs对肺癌细胞增殖和侵袭转移的影响中的作用,并进一步探究发挥作用的关键因子及作用机制。本研究可以加深对肺癌转移机制的理解,并为肺癌的治疗提供新策略。方法:一、体外研究1.CAFs的分离培养和自噬水平的检测:从肺癌临床标本中分离、培养、鉴定CAFs和正常成纤维细胞（normal fibroblasts,NFs）,通过Western blot、GFP-LC3斑点化实验以及吖啶橙染色等实验方法,检测NFs和CAFs的自噬水平。2.抑制CAFs的自噬对CAFs促进肺癌细胞增殖、侵袭和迁移作用的影响:运用自噬特异性抑制剂3-甲基腺嘌呤（3-methyladenine,3-MA）、氯喹（chloroquine,CQ）干预CAFs,或者通过RNAi方法敲低CAFs中自噬基因ATG5的表达,收集干预后CAFs的条件培养基（CAF-conditioned medium,CAF-CM）,用此CAF-CM培养肺癌细胞。通过CCK-8实验、细胞划痕实验和Transwell小室实验检测抑制自噬后CAFs对肺癌A549细胞和H661细胞增殖、侵袭和迁移的影响。同时通过定量PCR和Western blot检测肺癌细胞中转移相关基因（MMP2、Twist、MMP9）和上皮间质转化（epithelial-mesenchymal transition,EMT）相关标志物（E-cadherin、N-cadherin、Vimentin）的表达水平变化。3.激活CAFs的自噬对CAFs促进肺癌细胞增殖、侵袭和迁移作用的影响:运用自噬特异性激活剂雷帕霉素（rapamycin,RAPA）干预CAFs,收集干预后的CAF-CM,用此CAF-CM培养肺癌细胞。通过CCK-8实验、细胞划痕实验、Transwell小室实验以及Western blot检测激活自噬后,CAFs对肺癌细胞增殖和侵袭转移作用的影响以及对肺癌细胞中转移和EMT相关基因蛋白表达水平的影响。4.CAFs的自噬水平对高迁移率族蛋白B1（high mobility group box protein 1,HMGB1）分泌的影响:Western blot检测NFs和CAFs中HMGB1的表达水平,通过ELISA检测肺癌细胞、NFs和CAFs等不同细胞的HMGB1分泌水平。运用3-MA、CQ、RAPA干预CAFs或者通过RNAi方法敲低CAFs中ATG5的表达,通过ELISA检测调控CAFs自噬水平后对CAFs分泌HMGB1的影响。5.HMGB1对CAFs自噬水平的影响:用HMGB1重组蛋白处理CAFs,通过GFP-LC3斑点化实验及Western blot检测用HMGB1干预后CAFs自噬水平的变化。6.CAFs分泌的HMGB1对肺癌细胞增殖和侵袭转移的影响:用加入HMGB1中和抗体或HMGB1抑制剂的CAF-CM,或者用加入HMGB1重组蛋白的正常培养基培养肺癌细胞,通过CCK-8实验、细胞划痕实验、Transwell小室实验以及Western blot检测CAFs分泌的HMGB1对肺癌细胞增殖和侵袭转移的影响。7.CAFs分泌的HMGB1对肺癌细胞TLR4/NF-κB信号通路的影响:收集3-MA、CQ、RAPA或si ATG5干预CAFs后的CAF-CM培养肺癌细胞,Western blot检测调控CAFs自噬水平后CAFs对肺癌细胞中TLR4/NF-κB信号通路中关键信号分子TLR4、p-IκBα、IκBα和p-p65表达水平的影响,并结合HMGB1中和抗体及HMGB1重组蛋白评估CAFs分泌的HMGB1在肺癌细胞TLR4/NF-κB信号通路中的作用。二、体内研究裸鼠体内实验验证:将经CQ预处理的CAFs与A549混种于裸鼠背部皮下建立皮下瘤模型,同时设立未处理的CAFs为对照,饲养5周后剥离肿瘤组织,测量肿瘤组织的体积及重量,并通过Western blot检测肿瘤组织中TLR4/NF-κB信号通路中关键信号分子、转移相关基因、EMT相关标志物的表达水平。结果:1.肺癌CAFs的基础自噬水平高于NFs。2.降低CAFs的自噬水平可以减弱CAFs对肺癌细胞增殖和侵袭转移的促进作用,削弱CAFs对肺癌细胞中转移相关基因MMP2、Twist、MMP9和间质标记物N-cadherin、Vimentin表达的上调作用以及上皮标记物E-cadherin表达的下调作用。3.提高CAFs的自噬水平可以增强CAFs对肺癌细胞增殖和侵袭转移的促进作用,促进CAFs对肺癌细胞中转移相关基因和间质标记物表达的上调作用以及上皮标记物表达的下调作用。4.与NFs和肺癌细胞相比,CAFs能够分泌更多的HMGB1。调控CAFs的自噬水平可影响CAFs分泌HMGB1;并且HMGB1能够进一步上调CAFs的自噬水平,表明CAFs和HMGB1之间具有正反馈调节作用。5.CAFs分泌的HMGB1激活肺癌细胞中的TLR4/NF-κB信号通路,进而促进肺癌细胞的增殖和侵袭转移。6.体内研究显示,CAFs促进肺癌细胞的体内生长。抑制CAFs的自噬水平能够有效减弱CAFs对肺癌细胞EMT及TLR4/NF-κB信号通路的激活作用,进而减弱CAFs促进肺癌细胞体内生长的作用。结论:1.肺癌的CAFs具有较高的基础自噬水平。2.CAFs高水平的自噬介导了CAFs促进肺癌细胞增殖及侵袭转移的作用。3.CAFs的高自噬水平与CAFs分泌的HMGB1之间存在正反馈调控关系。4.CAFs通过分泌HMGB1,激活肺癌细胞中TLR4/NF-κB信号通路,促进肺癌细胞增殖及侵袭转移。5.抑制CAFs的自噬水平能够有效减弱CAFs促进肺癌细胞在体内的生长。
尹磊[8]（2020）在《白藜芦醇预处理人脐带间质干细胞的外泌体对非小细胞肺癌的作用及机制研究》文中认为目的:肺癌是全球发病率和死亡率最高的恶性肿瘤,仍缺乏有效的治疗手段。人脐带间质干细胞（human umbilical cord mesenchymal stem cell,huc MSC）可抑制肺癌进展,huc MSCs分泌的外泌体（huc MSC-derived exosomes,huc MSC-Ex）同huc MSCs生物功能相似,可用于用于肺癌治疗。小分子药物白藜芦醇（resveratrol,Res）可增强huc MSCs的生物功能,我们猜测Res预处理的huc MSCs分泌的exosomes（Res-huc MSC-Ex）对于肺癌可能具备更好的治疗效果。为此,本课题拟进一步研究Res对huc MSCs生物学特性的影响,并探究Res-huc MSC-Ex对肺癌的抑制作用,揭示相关的作用机制。方法:（1）Res对huc MSC生物特性的影响（1）huc MSCs的原代培养及鉴定:脐带组织贴壁培养获取原代huc MSCs,成骨成脂诱导培养基分别诱导huc MSCs成骨成脂分化;流式细胞术检测huc MSC表面抗原（CD44、CD105、CD45、CD34）的表达。（2）Res对huc MSC增殖、分化潜能的影响:Res处理huc MSCs后,CCK8实验和克隆形成实验检测huc MSCs的增殖,成骨成脂诱导培养分析分化潜能的改变。（3）Res对huc MSC细胞因子（IL-6、IL-8、VEGF、MCP-1）表达的影响:Res处理huc MSCs后,Luminex实验筛选分泌改变的细胞因子,酶联免疫吸附实验（enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）和荧光定量PCR（q RT-PCR）分别检测细胞因子（IL-6、IL-8、MCP-1、VEGF）分泌及m RNA表达。（4）Res影响huc MSC增殖分化的机制（Wnt/β-catenin信号）的研究:Res单独或联合β-catenin激动剂CP21处理huc MSCs后,western blot或免疫荧光检测β-catenin及Wnt信号下游蛋白Cyclin D1、Cyclin D3的表达,克隆形成实验、成骨成脂诱导实验分别检测huc MSC增殖、分化能力的改变。（2）Res-huc MSC-Ex对肺癌细胞增殖、凋亡、转移的影响（1）Res-huc MSC-Ex的纯化、鉴定:收集Res预处理huc MSCs的上清,采用超速离心法提取exosomes,用透射电镜观察exosomes的形态;Nanosight可视型纳米颗粒分析仪检测exosomes的粒径分布、数量、膜电位;western blot检测exosome标志性蛋白CD9、CD63的表达;采用高效液相色谱法检测Res-huc MSC-Ex内Res的含量。（2）肺癌细胞A549对Res-huc MSC-Ex的摄取:转染慢病毒GFP表达载体,构建GFP稳定表达的细胞株（GFP-A549）;用Di R标记huc MSC-Ex及Res-huc MSC-Ex,与GFP-A549共培养,激光共聚焦显微镜下观察A549细胞对exosomes的摄取。（3）Res-huc MSC-Ex对肺癌细胞迁移、增殖、凋亡的影响:huc MSC-Ex及Res-huc MSC-Ex作用于肺癌细胞株（A549、H1299）后,Transwell迁移实验、实时无标记细胞分析（RTCA）系统检测肺癌细胞迁移,CCK8实验和Annexin V/PI凋亡染色分别检测细胞增殖和凋亡。（4）小鼠肺癌模型构建及治疗:C57小鼠尾静脉注射小鼠肺癌细胞株LLC1/2,构建了肺癌转移模型;静脉注射huc MSC-Ex或Res-huc MSC-Ex进行治疗。（3）Res-huc MSC-Ex抑制肺癌进展机制的研究（1）Res-huc MSC-Ex对肺癌信号通路的影响:Res-huc MSC-Ex作用肺癌细胞（A549、H1299）后,western blot检测细胞PI3K、p-Akt、p-STAT3、p-NF-КB及Wnt信号相关分子（β-catenin、Cyclin D1、Cyclin D3）的表达;免疫荧光检测肺癌细胞（A549、H1299）β-catenin的表达;免疫组织化学染色检测Res-huc MSC-Ex及huc MSC-Ex治疗后小鼠肺癌组织β-catenin的表达。（2）Res-huc MSC-Ex抑制肺癌Wnt/β-catenin信号通路关键分子的筛查:Res处理huc MSCs,q RT-PCR筛选变化显着且可抑制Wnt/β-catenin信号通路的分子（DKK3）,采用ELISA或western blot检测huc MSCs上清和exosomes内DKK3表达;免疫组织化学染色检测Res-huc MSC-Ex及huc MSC-Ex治疗后小鼠肺癌组织DKK3的表达;Western blot检测肺癌细胞（A549、H1299、H460）和正常细胞（人胚肺成纤维细胞MRC-5、hucMSC）DKK3表达差异;H1299转染慢病毒DKK3干扰载体（sh DKK3）构建H1299 DKK3表达缺陷细胞株（sh DKK3-H1299）;荧光显微镜下观察GFP的表达以评估慢病毒转染效率;q RT-PCR检测H1299细胞DKK3 m RNA表达评估DKK3敲减效率;Transwell迁移实验分析H1299细胞DKK3表达缺陷后迁移能力改变。（3）Res-huc MSC-Ex内关键分子（DKK3）敲减后对肺癌转移及肺癌Wnt/β-catenin信号通路的影响:huc MSCs转染慢病毒DKK3干扰载体（sh DKK3）构建DKK3表达缺陷细胞株（sh DKK3-huc MSC）,Res处理sh DKK3-huc MSC,收集上清,提取DKK3表达缺陷的huc MSC-Ex及Res-huc MSC-Ex;Transwell迁移实验、小鼠肺癌转移模型评估Res-huc MSC-Ex DKK3表达缺陷后对肺癌转移的影响;Western blot、免疫组织化学染色检测Res-huc MSC-Ex DKK3表达缺陷后对肺癌（组织/细胞）β-catenin、Cyclin D1、Cyclin D1表达的影响。结果:Huc MSCs贴壁生长,呈长梭形,可诱导成骨成脂分化,表面阳性表达CD44、CD105,阴性表达CD45、CD34;Res可抑制huc MSC IL-6、IL-8、MCP-1 m RNA表达及蛋白分泌,促进huc MSC增殖及成骨成脂分化,抑制huc MSCsβ-catenin（总蛋白/胞核蛋白）及Wnt信号下游分子（Cyclin D1、Cyclin D3）表达;利用CP21抑制β-catenin降解,可降低Res对huc MSCs的促增殖、促分化作用。Res-huc MSC-Ex直径在110 nm左右,呈杯装,表达CD9和CD63;Res可促进huc MSC-Ex分泌,提高huc MSC-Ex的膜电位。Res-huc MSC-Ex被肺癌细胞摄取后,可抑制肺癌细胞迁移,不影响细胞增殖、凋亡;肺癌模型显示Res-huc MSC-Ex及huc MSC-Ex均可降低小鼠肺部肿瘤结节数量,但Res-huc MSC-Ex的抑制作用更强。Res-huc MSC-Ex不影响肺癌炎症相关的信号通路（STAT3、NF-КB、Akt、PI3K信号通路）,抑制肺癌细胞或小鼠肺癌组织Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白（β-catenin、Cyclin D1、Cyclin D3）的表达;利用CP21抑制β-catenin降解,可逆转Cyclin D3的表达,废除Res-huc MSC-Ex对肺癌细胞迁移的抑制作用;Res促进huc MSCs DKK3 m RNA表达及蛋白分泌,使DKK3在Res-huc MSC-Ex中富集;DKK3在肺癌细胞株（A549、H1299、H460）中的表达显着低于MRC-5和huc MSCs,DKK3表达缺陷可促进肺癌细胞迁移。Res-huc MSC-Ex DKK3表达缺陷后不能抑制肺癌转移,不能诱导小鼠肺癌组织DKK3表达,对肺癌细胞或小鼠肺癌组织Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白（β-catenin、Cyclin D1、Cyclin D3）表达的抑制作用也消失。结论:Res降低huc MSC炎症因子（IL-6、IL-8、MCP-1）表达,抑制Wnt/β-catenin信号通路,促进huc MSCs增殖、分化,诱导huc MSC-Ex分泌,促进huc MSC-Ex内富集DKK3蛋白;Res-huc MSC-Ex可转运DKK3蛋白拮抗肺癌Wnt/β-catenin信号,抑制肺癌转移。
闵璐[9]（2019）在《miRNA/RNF8轴在癌症转移过程中的作用研究》文中研究指明癌症已经发展成为当前死亡率最高的疾病,其中,侵袭转移是癌症患者死亡的主要原因。越来越多的证据表明,上皮-间质转化（EMT:Epithelial-Mesenchymal Transition）在癌症转移中起着重要作用。RNF8（RING finger protein8）是一种E3连接酶,通过泛素化作用参与DNA损伤修复和精子形成。近期有研究发现RNF8在癌症转移中发挥重要作用,然而此类作用仅在乳腺癌和肝细胞癌中被报道;同时,癌症中RNF8的上游调控因子的相关报道也并不多见。本论文研究了RNF8在肺癌这一世界范围内致死率最高的恶性肿瘤中的作用,并进一步探索了特定Micro RNAs（miRNA）对于RNF8的调控及其在癌症转移中的作用。首先,预实验及数据库数据分析表明,RNF8在肺癌组织中高表达,并且与患者的总体生存率呈负相关。通过慢病毒介导的基因表达策略,我们发现RNF8过表达促进了肺癌细胞的EMT进程,提高了细胞迁移能力;而si RNA介导的RNF8敲低则呈现了相反的结果。进一步研究表明,RNF8过表达激活了PI3K/Akt和ERK信号通路,而敲低RNF8降低Akt和MAPK的活性,同时下调Snail、Zeb1和Slug的表达。为了进一步揭示RNF8在肺癌转移过程中的信号通路,我们对RNF8过表达的细胞进行了免疫共沉淀,结果表明,RNF8可以直接与Slug和MAPK1相互作用,RNF8与Slug直接作用,促进了Slug的K63-Ub。抑制Slug可以消除RNF8依赖的A549细胞的EMT过程,过表达Slug可以重现RNF8依赖的H1299细胞的MET（Mesenchymal-Epithelial Transition间质上皮转化）过程。综上所述,这些结果表明RNF8通过多个机制协同促进EMT,从而促进肺癌发生,RNF8可能是肺癌潜在的治疗靶点。MiRNA是一类内源性非编码基因,在转录后水平调控基因表达。近几十年来,研究表明miRNAs调控了许多重要的生物学过程,如EMT。因此,为了探索RNF8的上游调控机制,我们进一步探索了靶向RNF8的miRNA及其在癌症转移中的作用。本文使用5个在线数据库预测了靶向RNF8 m RNA的miRNA,结果显示RNF8m RNA的3’非翻译区存在miR-214和miR-622的多个潜在结合位点,提示miR-214和miR-622可能靶向RNF8。进一步研究表明乳腺癌组织中miR-214的表达较癌旁非癌组织明显增加。过表达miR-214可以抑制乳腺癌细胞的增殖和迁移,而通过化学修饰拮抗剂抑制miR-214的作用则可以增强乳腺癌细胞的增殖和迁移。我们也证实了miR-214可以通过下调RNF8调控EMT过程,而敲减RNF8可以逆转下调miR-214所诱导的EMT进程。同时,我们也首次发现miR-622可以抑制乳腺癌细胞中的EMT过程。miR-622可以通过下调RNF8调控EMT进程,而敲减RNF8可以逆转下调miR-622所诱导的EMT进程。我们的结果显示miR-622/miR-214与RNF8不论是在表达水平上还是在EMT过程中的作用都呈负相关,证实了RNF8是miR-622/miR-214的直接靶点,重新定义了miR-214在乳腺癌转移中的作用,并提示人为提高miR-622/miR-214的表达可能是潜在的治疗乳腺癌的方法。综上所述,本论文揭示了miR-622/miR-214-RNF8轴在癌症转移中的作用,我们的结果提示人为介入并影响该信号通路可能是抑制肿瘤转移的有效策略。
赵超[10]（2019）在《microRNA-424抑制胶质瘤细胞侵袭迁移和上皮间质转化的研究》文中研究说明胶质瘤是最常见的原发性中枢神经系统肿瘤,约占所有颅内原发肿瘤的一半,是我国颅内肿瘤发病率最高的肿瘤。其侵袭性强,复发率高,即使对胶质瘤患者采用手术切除联合术后放化疗的综合治疗,五年存活率只有10%左右,严重威胁人类健康。miRNA已被发现在生物细胞代谢、凋亡、生长和增殖等病理和生物学过程中发挥重要作用。在不同种类的肿瘤中发现了异常的miRNA表达,它们通过直接调控靶基因发挥肿瘤抑制功能或致癌作用。但目前miRNA-424在胶质瘤细胞侵袭、迁移和上皮间质转化中的机制尚不清楚。我们选取miRNA-424作为研究对象,目的在于研究miRNA-424抑制胶质瘤细胞侵袭迁移和上皮间质转化（epithelial-to-mesenchymal transition,EMT）的可能的内在机制,寻找并验证miRNA-424下游靶点,为寻找新的靶点治疗方法提供依据。KIF23是驱动蛋白家族的一员,定位于核内。其对肿瘤侵袭能力密切相关,有研究表明KIF23可能激活Akt信号通路促进肝细胞癌增殖、侵袭,胶质瘤细胞增殖。但是,KIF23与miR-424之间的关系,以及KIF23与胶质瘤患者预后的关系目前不清楚。我们将通过实时定量PCR检测比较KIF23基因在胶质瘤组织和正常脑组织、胶质瘤细胞系和人星形细胞系之间表达差异;通过实时定量PCR、Western blot试验验证KIF23在miR-424mimcs组、miR-4245 inhibitors组分别相较各自NC组之间mRNA和蛋白水平变化情况,再通过双萤光素酶报告基因试验验证KIF23是miR-424的下游靶点,我们因此猜测KIF23与胶质瘤的发生发展可能相关,miR-424对胶质瘤的作用可能是通过靶向调控KIF23引起的。通过Kaplan-Meier分析KIF23基因表达差异与患者生存时间的关系,验证KIF23与患者预后的关系。本研究从临床水平、体外细胞水平和体内动物水平上探讨了miR-424在胶质瘤中的生物学性质,其在miR-424的胶质瘤细胞侵袭迁移、EMT调控中发挥了重要作用,也为以后更深入地研究miR-424的功能提供了重要的线索。第一部分miR-424抑制胶质瘤细胞上皮间质转化和侵袭迁移目的明确miR-424在神经胶质瘤组织和胶质瘤细胞系中的表达情况,及其与病人预后相关性,寻找新的胶质瘤可能的标志物;研究miR-424表达量与胶质瘤侵袭迁移和EMT过程的关系。方法1.组织标本:选取2015年5月至2017年4月在日照市人民医院诊断为胶质瘤的患者54例,经过颅内肿瘤切除术,共收集54例胶质瘤患者的胶质瘤组织标本。患者的组织病理学诊断均根据修订的国际肿瘤分级进行。同期,选取适当的（经影像学证实体内无肿瘤）外伤性脑损伤手术患者,获得12例非肿瘤、正常脑组织做为对照组。所有患者术前均未接受放疗或化疗,并提供书面知情同意书,本研究经日照市人民医院伦理委员会批准。2.细胞系:人神经胶质瘤细胞系（A172,SHG-44,T98,LN18和LN229）和正常人星形胶质细胞（normal human astrocytes,NHA）购买自美国ATCC细胞库。3.细胞培养:将冻存的细胞经过复苏、传代后,培养在37℃、5%二氧化碳,饱和湿度细胞培养箱中。4.提取RNA及实时定量RT-PCR:采用Trizol法提取RNA。将胶质瘤组织与正常脑组织相比较,胶质瘤细胞系与正常星形细胞系相比较,采用实时定量RT-PCR检测miR-424分别在其中的表达差异。5.培养LN229和A172细胞系用于体外细胞功能学试验。本试验用胶质瘤细胞系中,miR-424表达量在LN229细胞系中最低,A172细胞系最高。将miR-424 mimics及其阴性对照转染入LN229,miR-424 inhibitor及其阴性对照转染入A172。6.稳定转染后,我们通过Transwell法研究了上调和下调miR-424表达量对胶质瘤细胞侵袭迁移能力的影响。7.稳定转染后,分别采用荧光定量PCR和Western blot试验分别检测miR-424高表达和低表达时EMT标志物mRNA和蛋白水平相应变化,研究miR-424表达量对胶质瘤细胞发生EMT的影响。8.分析miR-424在神经胶质瘤患者中的临床意义:采用t检验将胶质瘤患者不同WHO分级、术前KPS评分等级、性别、年龄和肿瘤体积与miR-424表达水平比较。Kaplan–Meier分析法估计中位生存时间和总生存率,用Log-rank检验单因素分析miR-424表达与胶质瘤患者总体生存率的关系。结果1.与正常脑组织标本相比,miR-424在胶质瘤组织标本中明显下调,差别有显着统计学意义（P<0.01）。在A172、SHG-44、T98、LN229和LN18细胞系中miR-424的表达较正常细胞系NHA表达明显下降,差别均有显着统计学意义（P<0.05）2.通过Transwell试验,稳定转染miR-424拟物后,miR-424在LN229细胞中高表达,细胞的侵袭和迁移能力受抑制（P<0.05）;稳定转染miR-424抑制物后,miR-424在A172细胞低表达,细胞的侵袭和迁移能力提高（P<0.01）。3.经过荧光定量PCR检测,在LN229细胞系转染miR-424拟物后,与阴性对照组相比,miR-424拟似物组中的E-cadherin的mRNA表达水平升高,差别有统计学意义（P<0.05）,N-cadherin和Vimentin的mRNA表达水平降低,差别有统计学意义（P<0.05）;在A172细胞系转染miR-424抑制物后,与阴性对照组相比,miR-424抑制物组中的E-cadherin的mRNA表达水平降低,差别有统计学意义（P<0.05）,N-cadherin和Vimentin的mRNA表达水平升高,差别有统计学意义（P<0.05）。4.经过Western blot试验,miR-424高表达LN229细胞中E-cadherin蛋白水平明显增加,而N-cadherin和vimentin蛋白水平明显减少;此外,在A172细胞中,miR-424低表达显着降低了E-cadherin的蛋白水平,增高了N-cadherin和vimentin的蛋白水平。5.按照α=0.05检验水准,高、低miR-424的表达水平与不同WHO分级（P=0.0065）和术前KPS评分等级（P=0.0171）组间比较有统计学差异。胶质瘤患者性别、年龄和肿瘤体积与miR-424表达水平无明显统计学差异。Kaplan–Meier分析法估计中位生存时间和总生存率,经Log-rank检验单因素分析显示,miR-424低表达的胶质瘤患者总体生存率明显降低。结论1.与正常脑组织标本相比,miR-424在胶质瘤组织标本中明显下调;与正常人类星形胶质细胞系对比,miR-424在胶质母细胞瘤细胞系中的相对表达水平明显下调,差异有统计学意义。推测其在胶质瘤的发生发展中可能有早期诊断价值。2.miR-424可以负性调控胶质瘤细胞的侵袭和迁移能力。3.miR-424是胶质瘤EMT过程的抑制因子,EMT可能是miR-424调节胶质细胞瘤细胞的侵袭和迁移的潜在机制。4.miR-424低表达的胶质瘤患者总体生存率明显降低,与高WHO分级和低术前KPS评分等级相关,差异有统计学意义;miR-424表达水平可能是影响患者预后的因素之一。第二部分KIF23为miR-424的直接作用靶点,其表达水平与病人预后负相关目的明确KIF23在神经胶质瘤组织和细胞系中的表达情况,及其与病人预后相关性,寻找新的胶质瘤可能的标志物;验证了KIF23是miR-424在胶质瘤细胞中的直接靶点。验证在动物体内miR-424高表达与胶质瘤生长速度的关系。方法1.组织标本:选取2015年5月至2017年4月在日照市人民医院诊断为胶质瘤的患者54例,经过颅内肿瘤切除术,共收集54例胶质瘤患者的胶质瘤组织标本。患者的组织病理学诊断均根据修订的国际肿瘤分级进行。同期,选取适当的（经影像学证实体内无肿瘤）外伤性脑损伤手术患者,获得12例非肿瘤、正常脑组织做为对照组。所有患者术前均未接受放疗或化疗,并提供书面知情同意书,本研究经日照市人民医院伦理委员会批准。2.细胞系:人神经胶质瘤细胞系（A172,SHG-44,T98,LN18和LN229）和正常人星形胶质细胞（normal human astrocytes,NHA）购买自美国ATCC细胞库。3.细胞培养:将冻存的细胞经过复苏、传代后,培养在37℃、5%二氧化碳,饱和湿度细胞培养箱中。4.提取RNA及实时定量RT-PCR:采用Trizol法提取RNA。将胶质瘤组织与正常脑组织相比较,胶质瘤细胞系与正常星形细胞系相比较,采用实时定量RT-PCR检测KIF23分别在其中的表达差异。5.培养LN229和A172细胞系,将miR-424 mimics及其阴性对照转染入LN229,miR-424 inhibitor及其阴性对照转染入A172。6.稳定转染后,分别采用荧光定量PCR和Western blot试验分别检测KIF23基因的mRNA和蛋白水平相应变化,研究miR-424表达量对KIF23的影响。7.采用生物信息学方法预测miRNA-424可能的下游靶点,研究KIF23在胶质瘤与正常脑组织的表达差异,并预测其临床意义。8.双萤光素酶报告基因试验验证miR424的直接靶基因。9.采用Kaplan-Meier分析KIF23表达与胶质瘤患者的总生存率的关系。10.裸鼠成瘤实验验证miRNA-424高表达与胶质瘤生长速度之间的关系。结果1.生物信息学研究:在Targetscan数据库和microRNA网站中检索miR-424可能的靶基因,在所有候选基因中KIF23是靶基因可能性较大。检索Oncomine数据库,KIF23在胶质瘤中比在与正常脑组织中的表达增高。检索Oncolnc数据库,预测KIF23表达水平不同的胶质瘤患者的总生存时间有显着差异。采用两组间Log-rank单因素分析后,KIF23高表达组胶质瘤患者比低表达组患者的总生存时间显着降低。2.实时定量PCR方法检测:与正常脑组织标本相比,KIF23在胶质瘤组织标本中明显上调,差别有显着统计学意义（P<0.01）。与正常星形胶质细胞系对比,在A172、SHG-44、T98、LN229和LN18细胞系中KIF23的表达较正常星形细胞系表达明显增高,差别有显着统计学意义（P<0.05）。3.荧光定量PCR检验分析显示这两个转染后细胞系LN229、A172中KIF23基因mRNA分别表达下降和表达增高,差别均有显着统计学意义（P<0.05）。Western blot试验验证KIF23在转染后胶质瘤细胞系LN229、A172中KIF23蛋白水平分别下降和升高。4.双萤光素酶报告基因试验验证:KIF23为miR424直接作用的靶基因,而且miR-424可以通过直接靶向结合KIF23-3’-UTR影响KIF23的表达。5.经Kaplan-Meier分析表明,KIF23表达量与胶质瘤患者预后相关,表达高的胶质瘤患者的总生存率小于KIF23表达低的胶质瘤患者。6.裸鼠异体成瘤试验:在胶质瘤中的miR-424高表达可以明显抑制肿瘤生长。结论1.KIF23是miR-424的下游直接靶点。miR-424可能以KIF23为直接靶点抑制胶质瘤细胞的侵袭迁移和EMT。2.KIF23表达量与胶质瘤患者预后相关,表达高的胶质瘤患者的总生存率小于KIF23表达低的胶质瘤患者。3.体内试验中,胶质瘤中的miR-424高表达可以明显抑制肿瘤生长。以miR-424为靶点的分子治疗抑制EMT可能成为今后治疗胶质瘤的策略。
二、间质纤维母细胞的增殖活性在肺癌转移中的意义（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、间质纤维母细胞的增殖活性在肺癌转移中的意义（论文提纲范文）
（1）陕西汉族非编码RNA基因多态性与结直肠癌风险相关性及MIR17HG与其microRNAs在结直肠癌中的作用研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略语对照表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 结直肠癌(CRC)简述 |
| 1.2 microRNAs与CRC关系 |
| 1.3 LncRNAs与CRC关系 |
| 1.4 结直肠癌的早筛 |
| 1.4.1 目前用于平均风险人群的CRC筛查主要包括以下方法 |
| 1.4.2 microRNAs可作为肿瘤的早期筛查指标 |
| 1.5 MIR17HG及其在结直肠癌中的作用 |
| 1.6 本课题的研究目标和意义 |
| 第二章 LncRNAs,miRNAs及GREM1基因多态性与中国陕西汉族结直肠癌风险的相关性研究 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 研究方法 |
| 2.2.1 研究对象 |
| 2.2.2 主要仪器及试剂 |
| 2.2.3 实验方法 |
| 2.2.4 统计分析方法 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 参与者的基本特征 |
| 2.3.2 HWE检验结果 |
| 2.3.3 等位基因分布及与CRC风险的关系 |
| 2.3.4 遗传模型下SNPs与CRC风险的关系 |
| 2.3.5 SNPs与CRC风险相关分层分析 |
| 2.3.6 SNPs与CRC临床特征相关性 |
| 2.3.7 单倍型与CRC风险的关系 |
| 2.3.8 多个SNPs交互作用的MDR分析 |
| 2.4 讨论 |
| 2.4.1 MIR137HG和MIR577多态性与CRC的关系 |
| 2.4.2 MIR143HG多态性与CRC的关系 |
| 2.4.3 MIR3142HG多态性与CRC的关系 |
| 2.4.4 LINC-PINT多态性与CRC的关系 |
| 2.4.5 MIR124-1HG多态性与CRC的关系 |
| 2.4.6 MIR608多态性与CRC的关系 |
| 2.4.7 H19和MIR675多态性与CRC的关系 |
| 2.4.8 MIR192、MIR618和MIR492多态性与CRC的关系 |
| 2.4.9 MIR17HG多态性与CRC的关系 |
| 2.4.10 GREM1 多态性与CRC的关系 |
| 2.4.11 MIR497HG、MIR423和MIR133A1HG多态性与CRC的关系 |
| 2.5 结论 |
| 第三章 MIR17HG及其编码的micro RNAs在结直肠癌中的表达及临床信息关联的生物信息学分析 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 研究方法 |
| 3.2.1 研究对象 |
| 3.2.2 研究方法 |
| 3.2.3 统计方法 |
| 3.3 研究结果 |
| 3.3.1 MIR17HG的泛癌分析 |
| 3.3.2 MIR17HG在结直肠癌中的表达与临床预后分析 |
| 3.3.3 miR-17-92a簇在结直肠癌与癌旁正常组织中的表达及临床预后分析 |
| 3.3.4 miR-17-92a簇在结直肠癌病例与健康对照,病例不同分期中血清中的表达及预后分析 |
| 3.4 讨论 |
| 3.4.1 miR-17-92a簇在大多数肿瘤及CRC中高表达 |
| 3.4.2 miR-17-92a簇的microRNAs在大多数肿瘤及结直肠癌组织中高表达 |
| 3.4.3 miR-17-92a簇的microRNAs在CRC病例血清中高表达 |
| 3.5 结论 |
| 第四章 miR-17-92簇在结直肠癌病例与健康人群血清中的表达分析及诊断作用 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 研究方法 |
| 4.2.1 研究对象 |
| 4.2.2 主要仪器和试剂 |
| 4.2.3 实验方法 |
| 4.2.4 统计学方法 |
| 4.3 研究结果 |
| 4.3.1 研究对象基本特征 |
| 4.3.2 病例组与对照组血清学指标 |
| 4.3.3 血清中microRNA的相对表达量 |
| 4.3.4 CEA、AFP、hsa-miR-18a-5p、hsa-miR-92a-1诊断结直肠癌的ROC曲线 |
| 4.3.5 CEA、AFP、hsa-miR-18a-5p联合诊断结直肠癌的ROC曲线 |
| 4.3.6 各指标与结直肠癌分期的相关性分析 |
| 4.3.7 hsa-miR-18a-5p、CEA对早期结直肠的诊断的ROC曲线 |
| 4.3.8 各指标区分早晚结直肠癌的ROC曲线 |
| 4.4 讨论 |
| 4.4.1 糖蛋白癌胚抗原和甲胎蛋白 |
| 4.4.2 miR-17-92a簇作为血清肿瘤诊断标志物的应用 |
| 4.4.3 hsa-miR-18a-5p作为血清肿瘤诊断标志物的应用 |
| 4.5 结论 |
| 第五章 hsa-miR-18a-5p对结直肠癌细胞生物学功能的影响及候选靶基因分析 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 研究方法 |
| 5.2.1 实验材料 |
| 5.2.2 主要仪器及试剂 |
| 5.2.3 实验方法 |
| 5.2.4 统计方法 |
| 5.3 结果 |
| 5.3.1 hsa-miR-18a-5p在结直肠癌细胞系中表达上调 |
| 5.3.2 结直肠癌细胞中hsa-miR-18a-5p干预效果 |
| 5.3.3 hsa-miR-18a-5p差异表达对结直肠癌细胞增殖的影响 |
| 5.3.4 hsa-miR-18a-5p差异表达对结直肠癌细胞克隆形成能力的影响 |
| 5.3.5 hsa-miR-18a-5p差异表达对结直肠癌细胞凋亡的影响 |
| 5.3.6 结直肠癌表达差异基因及功能注释 |
| 5.3.7 hsa-miR-18a-5p靶基因及其预后分析 |
| 5.3.8 关键靶基因分析 |
| 5.3.9 靶基因LIF与hsa-miR-18a-5p结合位点预测 |
| 5.3.10 Western Blot检测LIF与hsa-miR-18a-5p表达关系 |
| 5.3.11 LIF功能预测 |
| 5.4 讨论 |
| 5.4.1 hsa-miR-18a-5p促进肿瘤发生发展 |
| 5.4.2 hsa-miR-18a-5p抑制肿瘤发生发展 |
| 5.4.3 在不同发育阶段和不同组织学亚型的同一器官的癌症中已观察到hsa-miR-18a的相反作用 |
| 5.4.4 hsa-miR-18a-5p抑制结直肠癌的发生发展 |
| 5.5 结论 |
| 结语和展望 |
| 参考文献 |
| 附录1:基因与泛癌的相关性 |
| 附录2:HCT116细胞鉴定证明 |
| 致谢 |
| 攻读博士期间的科研成果 |
| 个人简历 |
（2）百里酚通过Wnt/β-catenin信号通路抗结直肠癌作用研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略语索引 |
| 第一章 绪论 |
| 1 结直肠癌的发病率和死亡率 |
| 2 百里酚在肿瘤中的研究进展 |
| 2.1 百里酚抑制肿瘤细胞增殖 |
| 2.2 百里酚诱导肿瘤细胞凋亡 |
| 2.3 百里酚影响细胞周期进展 |
| 2.4 百里酚在肿瘤转移中的抑制作用 |
| 2.5 百里酚增加肿瘤组织放疗敏感性 |
| 3 Wnt/β-catenin信号通路生物学功能 |
| 3.1 Wnt/β-catenin信号通路与结直肠癌 |
| 3.2 Wnt/β-catenin与 NF-κB信号通路 |
| 3.3 Wnt/β-catenin与 PI3K/Akt/m TOR信号通路 |
| 3.4 Wnt/β-catenin通路调节EMT |
| 4 总结 |
| 5 本课题的研究目的及意义 |
| 6 技术路线图 |
| 第二章 百里酚提取及体外对人结直肠癌HCT116和Lovo细胞增殖抑制和凋亡诱导作用研究 |
| 1 前言 |
| 2 实验材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验细胞和主要试剂 |
| 2.1.2 主要仪器与耗材 |
| 2.1.3 植物样品 |
| 2.1.4 常用溶液配制 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 百里酚提取 |
| 2.2.2 细胞复苏、培养、冻存 |
| 2.2.3 药物配制 |
| 2.2.4 CCK-8 法检测百里酚对HCT116、Lovo细胞增殖和FHC细胞活力的影响 |
| 2.2.5 细胞克隆形成实验 |
| 2.2.6 百里酚对HCT116和Lovo细胞凋亡的影响 |
| 2.2.7 百里酚对结直肠癌HCT116和Lovo细胞周期的干预作用 |
| 2.2.8 qRT-PCR检测百里酚处理后人结直肠癌HCT116、Lovo细胞中凋亡相关基因Bcl-2和Bax m RNA表达的变化 |
| 2.2.9 Western blot检测百里酚处理对人结直肠癌HCT116、Lovo细胞中凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2、cleaved-caspase-3和cleaved-PARP表 |
| 2.2.10 统计分析 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 百里酚结构鉴定 |
| 3.2 百里酚对结直肠癌细胞增殖的影响 |
| 3.2.1 百里酚对HCT116、Lovo细胞增殖的抑制作用 |
| 3.2.2 百里酚对FHC的细胞毒性作用 |
| 3.3 百里酚对HCT116和Lovo细胞克隆形成能力的影响 |
| 3.4 Hoechst33258 检测百里酚对HCT116和Lovo细胞凋亡的影响 |
| 3.5 百里酚对结直肠癌HCT116和Lovo细胞的凋亡诱导效应 |
| 3.5.1 百里酚对HCT116细胞凋亡的影响 |
| 3.5.2 百里酚对Lovo细胞凋亡的影响 |
| 3.6 百里酚对结直肠癌HCT116和Lovo细胞周期的影响 |
| 3.6.1 百里酚对HCT116细胞周期的影响 |
| 3.6.2 百里酚对Lovo细胞周期的影响 |
| 3.7 百里酚对结直肠癌HCT116和Lovo细胞中凋亡相关分子m RNA表达的影响 |
| 3.8 百里酚对结直肠癌HCT116和Lovo细胞中凋亡相关蛋白表达的影响 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第三章 百里酚体外抑制人结直肠癌HCT116、Lovo细胞转移作用及机制 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验细胞和主要试剂 |
| 2.1.2 主要实验仪器与耗材 |
| 2.1.3 相关试剂的配制 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 细胞的冻存、复苏、传代方法 |
| 2.2.2 不同浓度的百里酚对人结直肠癌HCT116、Lovo细胞迁移能力的影响 |
| 2.2.3 不同浓度的百里酚对人结直肠癌HCT116、Lovo细胞侵袭能力的影响 |
| 2.2.4 Western blot检测百里酚对人结直肠癌HCT116、Lovo细胞中E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、snail蛋白表达的变化 |
| 2.2.5 统计学方法 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 百里酚对结直肠癌细胞迁移和侵袭能力的影响 |
| 3.1.1 百里酚对HCT116细胞迁移能力的影响 |
| 3.1.2 百里酚对Lovo细胞迁移能力的影响 |
| 3.1.3 百里酚对HCT116细胞侵袭能力的影响 |
| 3.1.4 百里酚对Lovo细胞侵袭能力的影响 |
| 3.2 百里酚对人结直肠癌HCT116和Lovo细胞中EMT相关蛋白表达的影响 |
| 3.2.1 百里酚对人结直肠癌HCT116 细胞中EMT的影响 |
| 3.2.2 百里酚对人结直肠癌Lovo细胞中EMT关键蛋白的影响 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第四章 百里酚通过抑制结直肠癌细胞内wnt/β-catenin信号通路的激活抑制细胞的增殖、迁移、侵袭和EMT |
| 1 前言 |
| 2 实验材料与方法 |
| 2.1 实验细胞和主要试剂 |
| 2.2 主要仪器与耗材 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 主要试剂的配制 |
| 2.3.2 质粒转化 |
| 2.3.3 菌种的活化 |
| 2.3.4 扩大培养 |
| 2.3.5 质粒的抽提 |
| 2.3.6 质粒转染和转染后细胞功能试验 |
| 2.3.7 RNA干扰 |
| 2.3.8 CCK-8法检测β-catenin在百里酚抑制结直肠癌细胞增殖中的作用 |
| 2.3.9 Transwell检测β-catenin在百里酚结直肠癌细胞迁移和侵袭能力抑制中的作用 |
| 2.3.10 Western blot |
| 2.3.11 qRT-PCR |
| 2.3.12 统计学分析 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 百里酚对结直肠癌细胞中Wnt/β-catenin信号通路活性的影响 |
| 3.1.1 百里酚处理后结直肠癌细胞中β-catenin、C-Myc、cyclin D1、survivin基因m RNA表达的变化 |
| 3.1.2 百里酚对结直肠癌HCT116和Lovo细胞中β-catenin、c-myc、cyclin D1、survivin蛋白表达的影响 |
| 3.2 转染结直肠癌HCT116和Lovo细胞中β-catenin的蛋白表达 |
| 3.2.1 β-catenin-siRNA对HCT116及Lovo中β-catenin 蛋白表达的影响 |
| 3.2.2 pc DNA3.1-β-catenin过表达质粒转染对HCT116及Lovo中β-catenin蛋白表达的影响 |
| 3.3 β-catenin在百里酚抑制结直肠癌细胞生长中的作用 |
| 3.3.1 β-catenin过表达降低百里酚对结直肠癌细胞生长的抑制作用 |
| 3.3.2 沉默β-catenin能够增加百里酚对结直肠癌细胞生长抑制作用 |
| 3.4 β-catenin在百里酚抑制结直肠癌细胞转移中的作用 |
| 3.4.1 β-catenin过表达减弱百里酚对结直肠癌细胞迁移和侵袭的抑制作用 |
| 3.4.2 沉默β-catenin能够增加百里酚对结直肠癌细胞迁移和侵袭的抑制作用 |
| 3.5 百里酚通过抑制β-catenin信号通路诱导细胞凋亡和抑制转移 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第五章 百里酚对人结直肠癌细胞裸鼠体内成瘤及转移的影响及作用机制的研究 |
| 1 前言 |
| 2 实验材料 |
| 2.1 实验动物和药物 |
| 2.2 实验主要试剂 |
| 2.3 主要试剂的配制 |
| 2.4 主要仪器与耗材 |
| 3 实验方法 |
| 3.1 细胞培养 |
| 3.2 裸鼠皮下移植瘤模型的建立、分组及给药方法 |
| 3.3 建立裸鼠尾静脉转移模型 |
| 3.4 动物组织石蜡切片及HE染色 |
| 3.5 qRT-PCR方法检测瘤体组织中E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、Snail、β-catenin、c-myc、cyclin D1、survivin、Bcl-2及Bax基因mRNA的表达 |
| 3.6 Western blot检测瘤体组织中E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、Snail、β-catenin、c-myc、cyclin D1、survivin、Bcl-2及Bax蛋白的表达情况 |
| 3.7 免疫组织化学(IHC)检测不同处理组裸鼠移植瘤中ki-67的表达情况 |
| 3.8 结肠癌细胞HCT116 裸鼠移植瘤TUNEL凋亡检测 |
| 3.9 qRT-PCR方法检测转移肺组织中E-cadherin、Vimentin、Snail及β-catenin m RNA的表达 |
| 3.10 免疫组织化学(IHC)检测转移肺组织中β-catenin、Vimentin及E-cadherin的表达情况 |
| 3.11 统计学分析方法 |
| 4 实验结果 |
| 4.1 百里酚抑制裸鼠HCT116移植瘤的生长 |
| 4.2 百里酚对结肠癌细胞HCT116裸鼠移植瘤组织形态结构的影响 |
| 4.3 百里酚对结肠癌HCT116细胞裸鼠移植瘤组织中Ki-67蛋白表达的影响 |
| 4.4 TUNEL染色检测各组移植瘤组织中细胞凋亡情况 |
| 4.5 百里酚对裸鼠移植瘤组织中增殖、转移相关蛋白表达的影响 |
| 4.6 裸鼠体内血行播散脏器转移观察 |
| 4.7 百里酚对HCT116 细胞肺转移瘤组织中E-cadherin、Vimentin、Snail、β-catenin m RNA表达的影响 |
| 4.8 百里酚对肺转移瘤组织中上皮性标记E-cadherin蛋白表达的影响 |
| 4.9 百里酚对肺转移瘤组织中间质性标记Vimentin蛋白表达的影响 |
| 4.10 百里酚对肺转移瘤组织中β-catenin蛋白表达的影响 |
| 5 讨论 |
| 6 小结 |
| 第六章 结论、创新点、存在的问题与展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 A:攻读学位期间发表论文和国际会议论文摘要 |
| 附录 B:攻读学位期间获奖情况 |
（3）基因修饰卵巢癌细胞株的构建及PTK2对卵巢癌细胞生物学行为影响的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 英文缩略词表 |
| 前言 |
| 第一部分 基因修饰小鼠卵巢癌细胞株的构建 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第二部分 PTK2在卵巢癌细胞增殖、迁移和侵袭中的作用研究 |
| 1 前言 |
| 2 材料和方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第三部分 PTK2 在卵巢癌小鼠原位移植瘤形成和转移中的作用 |
| 1 前言 |
| 2 材料和方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 全文结论 |
| 本课题创新点 |
| 参考文献 |
| 综述 PTK2在肿瘤中的研究新进展 |
| 参考文献 |
| 个人简历 |
| 攻读博士学位期间发表的文章 |
| 致谢 |
（4）FOXD3与SCF-β-TRCP1对肺癌与结肠癌骨转移等恶性生物学行为影响和机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 缩略词表 |
| 第一部分 FOXD3 蛋白对肺癌骨转移等恶性生物学行为影响及机制研究 |
| 前言 |
| 第一章:FOXD3在肺癌骨转移细胞及肿瘤干细胞中表达状况研究 |
| 一、材料与试剂 |
| 二、实验方法 |
| 三、实验结果 |
| 四、讨论 |
| 第二章:FOXD3对肺癌相关恶性生物学行为的影响 |
| 一、材料与方法 |
| 二、实验结果 |
| 三、讨论 |
| 第三章:FOXD3调控肺癌干细胞的机制研究 |
| 一、材料与方法 |
| 二、实验结果 |
| 三、讨论 |
| 第一部分 小结 |
| 第二部分 乙酰化依赖的 SCF-β-TRCP1 功能调节与其对结直肠癌恶性生物学行为影响的相关机制研究 |
| 前言 |
| 第一章:乙酰化修饰系统参与β-TRCP1功能调节相关研究 |
| 一、材料与方法 |
| 二、结果 |
| 三、讨论 |
| 第二章 β-TRCP1乙酰化修饰对结直肠癌恶性生物学功能影响 |
| 一、材料与方法 |
| 二、结果 |
| 三、讨论 |
| 第三章 β-TRCP1 对去乙酰化酶SIRT1 反馈调节机制研究 |
| 一、材料与方法 |
| 二、结果 |
| 三、讨论 |
| 第二部分 小结 |
| 全文总结与展望 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 综述一 FOX 蛋白家族在恶性肿瘤调控中的作用 |
| 综述二 SKP1-cullin-1-F-box-protein(SCF)E3 泛素连接酶复合体中 F-box 蛋白在肿瘤发生过程中作用 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表论文和参加科研工作情况说明 |
| 致谢 |
（5）活性氧促进肺支气管细胞上皮间质转化和肺腺癌细胞迁移的机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 综述 |
| 1 活性氧概述 |
| 1.1 活性氧 |
| 1.2 ROS与8-氧鸟嘌呤 |
| 1.3 ROS与肺腺癌 |
| 2 上皮间质转化概述 |
| 2.1 上皮间质转化 |
| 2.2 ROS与 EMT |
| 2.3 EMT在肺纤维化和肺腺癌中的作用 |
| 3 SDF-1 及其受体与肺腺癌转移概述 |
| 3.1 SDF-1/CXCR4 与肺腺癌转移 |
| 3.2 SDF-1/ACKR3 与肺腺癌转移 |
| 4 本论文的研究目的及意义 |
| 第二章 8-oxoG诱导肺支气管上皮细胞发生上皮间质转化 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要仪器 |
| 1.4 实验方法 |
| 1.5 统计分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 8-oxoG引起HBEC细胞发生类似EMT的形态改变 |
| 2.2 8-oxoG对 BEAS-2B细胞中EMT标志基因m RNA表达量的影响 |
| 2.3 8-oxoG诱导HBEC细胞发生EMT |
| 3 讨论 |
| 第三章 ROS和8-oxoG对小鼠肺组织显微结构的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要仪器 |
| 1.4 实验方法 |
| 1.5 统计分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 GOx引起BALB/c小鼠肺组织白细胞募集 |
| 2.2 GOx引起BALB/c小鼠肺组织纤维化 |
| 2.3 8-oxoG引起BALB/c小鼠肺组织纤维化 |
| 3 讨论 |
| 第四章 ROS通过上调SDF-1 受体的表达量来增加A549对SDF-1 的敏感性 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要仪器 |
| 1.4 实验方法 |
| 1.5 统计分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 GOx对 A549 细胞活力有抑制作用 |
| 2.2 GOx诱导A549 细胞产生ROS和形态学改变 |
| 2.3 SDF-1 引起A549 细胞迁移 |
| 2.4 GOx可以引起A549 细胞对SDF-1 的敏感性增加 |
| 2.5 GOx诱导A549 细胞中CXCR4和ACKR3的m RNA表达量变化 |
| 3 讨论 |
| 第五章 总结与展望 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 个人简况及联系方式 |
（6）MiRNA-451调控c-Myc在三阴性乳腺癌侵袭转移作用的研究（论文提纲范文）
| 中英文缩略词对照表 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一部分 三阴性乳腺癌、癌旁组织中miRNA-451、c-Myc与 E-cadherin的检测以及临床资料分析 |
| 1 研究内容及方法 |
| 1.1 聚合酶链反应PCR法检测三阴性乳腺癌组织、癌旁组织中miRNA-451、c-Myc以及E-cadherin基因 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.3 统计学分析 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第二部分 验证miRNA-451与c-Myc靶向调控关系 |
| 1 研究内容与方法 |
| 1.1 研究对象 |
| 1.2 实验方法及步骤 |
| 1.3 统计学分析 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第三部分 miRNA-451 基因对细胞功能影响的研究 |
| 1 研究内容与方法 |
| 1.1 研究对象 |
| 1.2 实验方法及步骤 |
| 1.3 统计学分析 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间获得的学术成果 |
| 个人简历 |
| 导师评阅表 |
（7）肿瘤相关成纤维细胞的自噬水平在其促进肺癌细胞转移中的作用机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略语/符号说明 |
| 前言 |
| 研究现状、成果 |
| (一)肺癌现状和治疗 |
| (二)CAFs及其在肿瘤转移中的作用 |
| (三)自噬依赖的分泌及其在肿瘤中的作用 |
| (四)HMGB1与肿瘤生长、转移 |
| (五)NF-κB信号通路与肿瘤生长、转移 |
| 研究目的、方法 |
| 对象和方法 |
| 1.1 细胞和实验动物 |
| 1.1.1 细胞系和组织 |
| 1.1.2 实验动物 |
| 1.2 实验试剂和器材 |
| 1.2.1 主要实验试剂 |
| 1.2.2 主要实验仪器和耗材 |
| 1.2.3 试剂配制 |
| 1.3 实验方法 |
| 1.3.1 细胞培养 |
| 1.3.2 Western blot操作步骤 |
| 1.3.3 Real-time PCR |
| 1.3.4 自噬水平检测 |
| 1.3.5 吖啶橙染色 |
| 1.3.6 细胞转染siRNA |
| 1.3.7 细胞增殖实验 |
| 1.3.8 细胞划痕实验 |
| 1.3.9 Transwell小室实验 |
| 1.3.10 酶联免疫分析(ELISA) |
| 1.3.11 小鼠成瘤实验 |
| 1.3.12 数据分析 |
| 结果 |
| 2.1 肺癌的CAFs具有较高的基础自噬水平 |
| 2.1.1 成纤维细胞的分离、培养、鉴定 |
| 2.1.2 肺癌CAFs的基础自噬水平高于NFs |
| 2.2 抑制CAFs的自噬可以减弱CAFs对肺癌细胞增殖和侵袭转移的促进作用 |
| 2.2.1 抑制CAFs的自噬能够减弱CAFs对肺癌细胞增殖的促进作用 |
| 2.2.2 抑制CAFs的自噬能够减弱CAFs对肺癌细胞侵袭转移的促进作用 |
| 2.2.3 抑制CAFs的自噬能够减弱CAFs促进肺癌细胞中转移相关基因的表达及EMT |
| 2.3 激活CAFs的自噬可以增强CAFs对肺癌细胞增殖和侵袭转移的促进作用 |
| 2.3.1 激活CAFs的自噬能够增强CAFs对肺癌细胞增殖的促进作用 |
| 2.3.2 激活CAFs的自噬能够增强CAFs对肺癌细胞侵袭转移的促进作用 |
| 2.4 CAFs分泌的HMGB1 可调节自身的自噬水平 |
| 2.4.1 调控CAFs的自噬水平可影响CAFs分泌HMGB1 |
| 2.4.2 HMGB1 可以上调CAFs的自噬水平 |
| 2.5 CAFs分泌的HMGB1 可通过激活TLR4/NF-κB信号通路促进肺癌细胞增殖和侵袭转移 |
| 2.5.1 CAFs可通过分泌HMGB1 促进肺癌细胞的增殖 |
| 2.5.2 CAFs可通过分泌HMGB1 促进肺癌细胞的侵袭转移 |
| 2.5.3 CAFs可通过分泌HMGB1 促进肺癌细胞中转移相关基因的表达及EMT的发生 |
| 2.5.4 抑制HMGB1 可减弱CAFs对肺癌细胞侵袭转移的促进作用 |
| 2.5.5 CAFs的自噬水平在CAFs激活肺癌细胞中TLR4/NF-κB信号通路中的作用 |
| 2.5.6 CAFs可通过分泌HMGB1 激活肺癌细胞中的TLR4/NF-κB信号通路 |
| 2.6 抑制CAFs的自噬能够减弱CAFs对肺癌细胞体内的生长的促进作用 |
| 2.6.1 抑制CAFs的自噬能够减弱CAFs对肺癌细胞体内生长的促进作用 |
| 2.6.2 抑制CAFs的自噬能够削弱CAFs对肺癌细胞EMT及 TLR4/NF-κB信号通路的激活作用 |
| 讨论 |
| 3.1 CAFs的自噬水平 |
| 3.2 CAFs的自噬水平在CAFs促进肿瘤细胞增殖和侵袭转移中的作用 |
| 3.3 CAFs的自噬水平影响HMGB1 的分泌且HMGB1 可调节CAFs的自噬水平 |
| 3.4 HMGB1在CAFs促进肺癌细胞增殖和转移中的作用 |
| 3.5 CAFs的自噬水平在CAFs促肿瘤生长、转移中的作用及靶向治疗 |
| 全文结论 |
| 论文创新点 |
| 参考文献 |
| 综述 肿瘤相关成纤维细胞中自噬作用的研究进展 |
| 综述参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（8）白藜芦醇预处理人脐带间质干细胞的外泌体对非小细胞肺癌的作用及机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 英文缩略词中英文注释表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 脐带间质干细胞 |
| 1.1.1 脐带间质干细胞概述 |
| 1.1.2 脐带间质干细胞的生物功能 |
| 1.2 白藜芦醇与脐带间质干细胞 |
| 1.2.1 白藜芦醇简介 |
| 1.2.2 白藜芦醇的生物功能 |
| 1.2.3 白藜芦醇对脐带间质干细胞的影响 |
| 1.3 外泌体 |
| 1.3.1 外泌体的分离和鉴定 |
| 1.3.2 外泌体的生物学功能 |
| 1.3.3 增强外泌体生物学功能的方法 |
| 1.4 人脐带间质干细胞外泌体 |
| 1.4.1 人脐带间质干细胞外泌体在体内的分布 |
| 1.4.2 人脐带间质干细胞外泌体的生物功能 |
| 1.5 肺癌与Wnt/β-catenin信号通路 |
| 1.5.1 Wnt/β-catenin信号通路与肺癌 |
| 1.5.2 DKK3 与肺癌 |
| 1.6 科学问题的提出 |
| 第二章 研究目的、方法、方案设计和意义 |
| 2.1 研究目的 |
| 2.2 研究内容 |
| 2.3 研究方法 |
| 2.4 研究方案设计 |
| 2.4.1 白藜芦醇对人脐带间质干细胞生物特性的影响 |
| 2.4.2 Res-hucMSC-Ex的分离、鉴定及对肺癌的作用 |
| 2.4.3 Res-hucMSC-Ex对肺癌信号通路的影响 |
| 2.4.4 筛选Res-hucMSC-Ex抑制肺癌转移的关键分子 |
| 2.4.5 Res-hucMSC-Ex DKK3 表达缺陷对肺癌的影响 |
| 2.5 研究意义 |
| 第三章 白藜芦醇对人脐带间质干细胞生物特性的影响 |
| 3.1 所用试剂、耗材与仪器 |
| 3.1.1 主要试剂、耗材 |
| 3.1.2 主要仪器 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 磷酸盐缓冲液配制 |
| 3.2.2 HucMSCs的分离、培养 |
| 3.2.3 HucMSCs表面标记检测 |
| 3.2.4 Res的配制 |
| 3.2.5 HucMSCs成骨成脂诱导分化 |
| 3.2.6 CCK8 实验 |
| 3.2.7 克隆形成实验 |
| 3.2.8 Luminex实验 |
| 3.2.9 RNA提取 |
| 3.2.10 逆转录 |
| 3.2.11 qRT-PCR |
| 3.2.12 ELISA实验 |
| 3.2.13 细胞免疫荧光实验 |
| 3.2.14 细胞总蛋白提取 |
| 3.2.15 细胞核浆蛋白提取 |
| 3.2.16 Western blot |
| 3.2.17 统计学分析 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 HucMSCs的鉴定 |
| 3.3.2 Res促进hucMSC增殖、分化,抑制炎症因子表达 |
| 3.3.3 Res通过抑制Wnt/β-catenin信号通路促进hucMSCs增殖及成骨成脂分化 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 白藜芦醇预处理人脐带间质干细胞的外泌体对非小细胞肺癌的作用 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 主要细胞和试剂 |
| 4.1.2 主要仪器、耗材 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 Res预处理hucMSCs上清收集 |
| 4.2.2 Res预处理hucMSCs来源的外泌体的提取 |
| 4.2.3 外泌体检测 |
| 4.2.4 GFP-A549 细胞构建及外泌体摄取 |
| 4.2.5 Transwell迁移实验 |
| 4.2.6 实时无标记细胞分析(RTCA)系统 |
| 4.2.7 小鼠肺癌模型构建及治疗 |
| 4.2.8 小鼠肺癌组织HE染色 |
| 4.2.9 CCK8 实验检测肺癌细胞增殖 |
| 4.2.10 流式细胞仪检测细胞凋亡 |
| 4.2.11 统计学分析 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 外泌体的鉴定及膜电位检测 |
| 4.3.2 Res-hucMSC-Ex抑制肺癌转移 |
| 4.3.3 Res-hucMSC-Ex不影响肺癌细胞增殖、凋亡 |
| 4.4 讨论 |
| 第五章 Res-hucMSC-Ex转运DKK3 失活Wnt/β-catenin信号通路抑制肺癌转移 |
| 5.1 试剂、耗材与仪器 |
| 5.1.1 试剂或耗材 |
| 5.1.2 实验仪器 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.2.1 高效液相色谱法(HPLC) |
| 5.2.2 Western blot |
| 5.2.3 细胞免疫荧光 |
| 5.2.4 免疫组织化学染色 |
| 5.2.5 Transwell迁移实验 |
| 5.2.6 荧光定量PCR技术 |
| 5.2.7 ELISA实验 |
| 5.2.8 Nanosight可视型纳米颗粒分析仪检测外泌体数量 |
| 5.2.9 慢病毒干扰载体构建 |
| 5.2.10 DKK3 敲减细胞株构建 |
| 5.2.11 DKK3 敲减hucMSC外泌体提取 |
| 5.2.12 小鼠肺癌转移模型构建及治疗 |
| 5.2.13 组织HE染色 |
| 5.2.14 统计学分析 |
| 5.3 实验结果 |
| 5.3.1 Res-hucMSC-Ex对肺癌炎症相关的信号通路无明显影响 |
| 5.3.2 Res-hucMSC-Ex拮抗Wnt/β-catenin信号通路抑制肺癌转移 |
| 5.3.3 Res促进hucMSC-Ex富集DKK3 |
| 5.3.4 DKK3 缺陷促进肺癌细胞迁移 |
| 5.3.5 Res-hucMSC-Ex递送DKK3 抑制肺癌转移 |
| 5.3.6 Res-hucMSC-Ex转运DKK3 抑制肺癌Wnt/β-catenin信号通路 |
| 5.4 讨论 |
| 第六章 结论与展望 |
| 6.1 主要结论 |
| 6.2 研究创新点 |
| 6.3 展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 博士期间的科研成果 |
（9）miRNA/RNF8轴在癌症转移过程中的作用研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 癌症与上皮间质转化(EMT) |
| 1.1.1 癌症简介 |
| 1.1.2 EMT简介 |
| 1.1.3 EMT与癌症转移 |
| 1.1.4 EMT与肿瘤预后不良 |
| 1.2 RNF8 简介及其癌症相关研究进展 |
| 1.2.1 RNF8 简介 |
| 1.2.2 RNF8 与癌症相关研究 |
| 1.3 miRNA简介及其癌症相关研究进展 |
| 1.3.1 miRNA简介 |
| 1.3.2 miRNA与癌症相关研究 |
| 1.4 课题研究的目标意义 |
| 第二章 RNF8 在肺癌转移过程中作用的研究 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 实验仪器 |
| 2.3 实验材料和试剂 |
| 2.4 试剂配制 |
| 2.5 实验方法 |
| 2.5.1 细胞培养 |
| 2.5.2 细胞转染 |
| 2.5.3 病毒包装及感染 |
| 2.5.4 细胞稳系构建 |
| 2.5.5 Transwell实验 |
| 2.5.6 蛋白质提取与定量 |
| 2.5.7 Western Boltting |
| 2.5.8 免疫共沉淀co-IP |
| 2.5.9 组织包埋及H&E染色 |
| 2.5.10 免疫组化(组织芯片) |
| 2.5.11 数据库 |
| 2.5.12 数据分析 |
| 2.6 实验结果 |
| 2.6.1 RNF8 在肺癌组织中高表达,与患者预后不良呈正相关 |
| 2.6.2 RNF8 诱导肺癌细胞系细胞上皮间质转换(EMT) |
| 2.6.3 RNF8 促进肺癌细胞的迁移 |
| 2.6.4 RNF8 通过激活PI3K/Akt和 ERK信号通路来促进EMT |
| 2.6.5 RNF8 直接靶向Slug介导其泛素化 |
| 2.6.6 RNF8 促进体内肺癌的转移 |
| 2.7 讨论 |
| 第三章 miR-622/214 靶向RNF8 及其在EMT中的作用研究 |
| 3.1 前言 |
| 3.1.1 miR-214 简介 |
| 3.1.2 miR-622 简介 |
| 3.2 实验仪器 |
| 3.3 实验材料与试剂 |
| 3.4 试剂配制 |
| 3.5 实验方法 |
| 3.5.1 细胞培养 |
| 3.5.2 转染 |
| 3.5.3 RNA提取和定量PCR |
| 3.5.4 双荧光素酶报告基因检测 |
| 3.5.5 体外细胞增殖试验 |
| 3.5.6 划痕实验 |
| 3.6 实验结果及讨论 |
| 3.6.1 RNF8 3’UTR分析 |
| 3.6.2 miR-214 靶向RNF8 抑制乳腺癌转移 |
| 3.6.3 miR-622 靶向RNF8 抑制乳腺癌转移 |
| 3.6.4 讨论 |
| 第四章 结论及展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 作者在学期间取得的学术成果 |
| 附录1 缩略词 |
| 附录2 肿瘤治疗药物 |
| 附录3 miR-622 生存率分析 |
| 附录4 小鼠肺组织切片染色 |
（10）microRNA-424抑制胶质瘤细胞侵袭迁移和上皮间质转化的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 引言 |
| 第一部分 miR-424 抑制胶质瘤细胞上皮间质转化和侵袭迁移 |
| 前言 |
| 材料方法 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第二部分 KIF23为miR-424 的直接作用靶点,其表达水平与病人预后负相关 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间的研究成果 |
| 附录 |
| 致谢 |
四、间质纤维母细胞的增殖活性在肺癌转移中的意义（论文参考文献）
- [1]陕西汉族非编码RNA基因多态性与结直肠癌风险相关性及MIR17HG与其microRNAs在结直肠癌中的作用研究[D]. 陈鹏. 西北大学, 2021(12)
- [2]百里酚通过Wnt/β-catenin信号通路抗结直肠癌作用研究[D]. 曾琼瑶. 昆明理工大学, 2020(05)
- [3]基因修饰卵巢癌细胞株的构建及PTK2对卵巢癌细胞生物学行为影响的研究[D]. 闫欢. 郑州大学, 2020(02)
- [4]FOXD3与SCF-β-TRCP1对肺癌与结肠癌骨转移等恶性生物学行为影响和机制研究[D]. 李佳林. 中国人民解放军海军军医大学, 2020(02)
- [5]活性氧促进肺支气管细胞上皮间质转化和肺腺癌细胞迁移的机制研究[D]. 郭佳. 山西大学, 2020(01)
- [6]MiRNA-451调控c-Myc在三阴性乳腺癌侵袭转移作用的研究[D]. 杜江. 新疆医科大学, 2020(07)
- [7]肿瘤相关成纤维细胞的自噬水平在其促进肺癌细胞转移中的作用机制研究[D]. 任莹慧. 天津医科大学, 2020(06)
- [8]白藜芦醇预处理人脐带间质干细胞的外泌体对非小细胞肺癌的作用及机制研究[D]. 尹磊. 江苏大学, 2020
- [9]miRNA/RNF8轴在癌症转移过程中的作用研究[D]. 闵璐. 国防科技大学, 2019(01)
- [10]microRNA-424抑制胶质瘤细胞侵袭迁移和上皮间质转化的研究[D]. 赵超. 青岛大学, 2019(07)