一、从J亚群禽白血病肿瘤中检测出禽网状内皮组织增生症病毒（论文文献综述）
姜皓[1]（2021）在《REV-SNV对SPF雏鸡RLRs信号通路相关MiRNAs及其靶基因表达的影响》文中认为禽网状内皮组织增生症（RE）是由禽网状内皮组织增生症病毒（REV）引起的禽类传染性致瘤性疾病。REV主要感染鸡、鸭、鹅、火鸡等禽类,导致生长迟缓、免疫抑制和肿瘤等病症。先天性免疫通路作为抵御入侵病原微生物的第一道屏障,在宿主抗病毒反应中发挥着重要作用,而细胞质中最重要的识别病毒RNA的模式识别受体（PRRs）是RIG-I样受体家族（RLRs）。前期我们利用REV-SNV人工感染1日龄SPF鸡的动物疾病模型,收集7dpi、14dpi、21dpi的脾脏样品进行高通量测序,对m RNA和miRNA表达谱数据进行整合分析后发现,RLRs受体信号通路中涉及的CASP10基因和MAPK10基因不仅显着差异表达,且其表达分别与gga-miR-1618-5p和gga-miR-222b-5p存在明显的负调控关系。为了进一步掌握RLRs通路相关的上述两个miRNA和基因在REV-SNV感染中的表达规律,我们利用前期动物试验所收集的组织样品,选择同一感染日龄（7dpi,14dpi,21dpi）法氏囊和不同感染日龄（28dpi,35dpi,42dpi）脾脏为研究对象,与对照组相比,法氏囊结果显示:在7dpi时,gga-miR-222b-5p表达极显着下调,MAPK10表达无显着差异,gga-miR-1618-5p表达极显着下调,CASP10表达极显着上调;在14dpi时,gga-miR-222b-5p表达无显着差异,MAPK10表达极显着上调,gga-miR-1618-5p表达无显着差异,CASP10表达极显着上调;在21dpi时,gga-miR-222b-5p表达显着下调,MAPK10表达无显着差异,gga-miR-1618-5p表达无显着差异,CASP10表达极显着上调。而脾脏组织的结果表明:在28dpi时,gga-miR-222b-5p表达极显着上调,MAPK10表达无显着差异,gga-miR-1618-5p表达极显着下调,CASP10表达极显着上调;在35dpi时,gga-miR-222b-5p表达极显着上调,MAPK10表达极显着下调,gga-miR-1618-5p表达无显着差异,CASP10表达极显着上调;在42dpi时,gga-miR-222b-5p、MAPK10和CASP10表达无显着差异,gga-miR-1618-5p表达显着下调。前期高通量测序结果和qRT-PCR验证结果显示,MAPK10和CASP10可能分别是gga-miR-222b-5p和gga-miR-1618-5p的潜在靶基因。为了确定它们之间是否直接相关,研究彼此间的靶向关系,我们利用生物信息学软件Target Scan和miRBD预测了其结合位点,结果发现只有MAPK10的3’端非编码区（3’UTR）和gga-miR-222b-5p存在种子结合位点,共3处（UGACUCG,UGACUCGU,GACUCGU）。由于前两处结合位点距离较近（654-660,1190-1197）,第三处较远（3890-3896）,我们分别以前两处靶点为中心,第三处靶点为另一中心构建2种含有目的基因片段的双荧光素酶报告基因载体,进行双荧光素酶报告基因实验,结果表明MAPK10确实是gga-miR-222b-5p的靶基因。CASP10作为机体的细胞凋亡因子,MAPK10更是人和动物体重要的肿瘤调节因子,通过对REV-SNV感染SPF雏鸡后同一感染日龄不同免疫器官和不同感染日龄同一免疫器官RLRs信号通路相关miRNAs及上述潜在靶基因表达规律的研究,拓宽了我们对REV感染引起的免疫抑制和肿瘤发生机制的理解,同时有助于深入了解miRNA介导RLRs模式识别受体信号通路参与鸡体免疫抑制的分子调控机制。
闫彩虹[2]（2020）在《江苏地区家禽4种免疫抑制病病原检测及致瘤病毒三重荧光定量PCR检测方法的建立与应用》文中研究表明免疫抑制病病原既可引起家禽发生原发性感染甚至死亡,也可损伤其免疫系统,导致机体抵抗力下降,并发或继发感染其他病原,造成家禽生产能力下降和较高的病死率。鸡传染性贫血病毒（CIAV）、马立克病病毒（MDV）、网状内皮组织增生症病毒（REV）和禽白血病病毒（ALV）是4种常见的可导致家禽免疫抑制的病毒,在我国养鸡场中检出率较高,且常以亚临床感染的形式出现。目前关于这几种免疫抑制病的流行病学调查研究主要集中在广西、安徽、山东、河南等地区,而关于江苏地区家禽这方面的流行病学研究资料较少。由MDV、REV和J亚群禽白血病病毒（ALV-J）感染引起的肿瘤疾病在临床诊断过程中因症状相似而较难确诊,而且这3种病原的实验室检测还是以常规PCR为主,因此建立一种特异、灵敏、快速的检测方法,用于病原检测和临床诊断,同时为疾病的防控和净化提供帮助是非常有必要的。本研究应用PCR方法对来自江苏地区的病禽进行4种免疫抑制病病原的检测,建立了同时检测3种致瘤病毒MDV、REV和ALV-J的三重TaqMan荧光定量PCR方法,并应用于临床检测中,以期了解江苏地区家禽免疫抑制病病原的感染情况,并为临床上家禽肿瘤疾病的诊断提供一种快速、特异、敏感的新型技术手段。1 江苏地区家禽4种免疫抑制病病原检测为了解江苏地区家禽免疫抑制病病原的流行情况及其感染间相互作用的关系,应用PCR方法对2016-2019年来自江苏地区不同养殖群体的507只病鸡、80只病鸭、129只病鹅和42只病鸽进行CIAV、MDV、REV和ALV的核酸检测,结果显示病鸡样品总阳性检出率为66.07%,CIAV、MDV、REV和ALV的检出率分别为36.09%、25.84%、10.85%和32.94%,CIAV、MDV、REV和ALV的单一感染检出率分别为13.61%、8.88%、1.18%和12.03%,二重感染以CIAV+ALV最为常见,检出率为7.69%,三重感染以CIAV+MDV+ALV最为常见,检出率为3.94%,四重感染检出率为0.99%。不同日龄鸡检测结果显示,6月龄以上鸡CIAV的检出率显着降低,3～6月龄鸡MDV和ALV的检出率较高;不同品种鸡检测结果显示,蛋鸡MDV、REV检出率显着高于肉鸡、草鸡和三黄鸡;2016-2019年检测结果显示,江苏地区鸡群中免疫抑制病病毒仍呈现不同程度的流行,且部分病原的每年检出率存在差异性。4种免疫抑制病病原感染间相互作用的比较经统计学分析表明,CIAV和REV、CIAV和ALV感染间存在相互促进的趋势（P<0.01）。209份水禽样品均未检测出CIAV核酸,MDV、REV和ALV的检出率分别为0.96%、1.44%和3.35%,个别样品还存在REV和ALV的混合感染。病鸽样品中均未检测出这四种免疫抑制病病原。结果表明,鸡群中免疫抑制病病原的感染非常普遍,且存在多种病原的混合感染;水禽中免疫抑制病病原的检出率显着低于鸡群;鸽子感染这4种免疫抑制病病原的机率较低。2鸡致瘤病毒三重荧光定量PCR检测方法的建立为建立同时检测MDV、REV和ALV-J的方法,本研究根据MDV meq基因、REV gp90基因和ALV-J env基因,合成特异性引物和TaqMan探针,建立和优化反应体系和条件,建立了鸡3种致瘤病毒的单个和三重TaqMan荧光定量PCR方法。结果显示,本研究建立的3种病毒的单个荧光定量PCR方法具有相同的反应体系和条件,操作方便,检测快速;单个和多重荧光定量PCR方法均仅特异性扩增MDV、REV和ALV-J,与鸡其它主要病毒无交叉反应,特异性较强;3种病毒的单个荧光定量PCR方法对MDV、REV和ALV-J的质粒标准品最低检出限分别为3.23×101拷贝/μL、3.23×100拷贝/μL和3.23×101拷贝/μL,敏感性较高,三重荧光定量PCR方法对MDV、REV和ALV-J的质粒标准品最低检出限分别为3.23×100拷贝/μL、3.23×100拷贝/μL和3.23×101拷贝/μL,与单个敏感性相似;三重荧光定量PCR方法组内与组间重复性试验的Ct值变异系数均小于5%,重复性良好。应用三重荧光定量PCR方法和普通PCR方法分别对来自江苏各地具有免疫抑制病表现的120份临床病鸡样品同时进行MDV、REV和ALV-J核酸的检测,两者的符合率为94.17%。本研究建立的鸡致瘤病毒三重TaqMan荧光定量PCR方法为临床样品中MDV、REV和ALV-J核酸的检测及流行病学调查提供了一种快速、特异、敏感的新型技术手段。3两例疑似肿瘤病鸡三重荧光定量PCR检测及马立克病病毒鉴定分析研究为进一步检验三重荧光定量PCR方法的临床应用性,应用建立的三重荧光定量PCR方法对江苏两个鸡场送检的疑似感染肿瘤性病毒的病鸡组织样品进行了检测,并同时进行病毒分离,然后对分离出的MDV野毒株进行meq和pp38两个主要致病基因的序列分析。三重荧光定量PCR结果显示送检病鸡样品MDV核酸均呈阳性,REV和ALV-J核酸均呈阴性,病毒分离鉴定结果显示从两个鸡场的病鸡抗凝全血中各分离到了 1株MDV Ⅰ型毒株,未分离到REV和ALV毒株。核苷酸同源性和遗传进化分析结果显示,JS0316毒株与江苏分离株Js201801关系最近,而JS0424毒株则与近年国内流行毒株亲缘相近。meq基因编码的氨基酸序列结果显示,2个MDV分离株缺乏弱毒疫苗株的特征（A71S,P194-）,具有MDV强毒分离株的分子特征（D80Y,V115A,T139A,P176R）,JS0316分离株meq基因除了具有以上强毒分离株的分子特征外,还与Js201801存在相同的突变（Q93R）,该突变其余参考毒株均未发生,这可能是MDV江苏分离株新的分子生物学特征。除此之外,JS0316和JS0424分离株meq基因分别出现了其他参考毒株均未发生的氨基酸突变（V123A）和（A/P217T）,JS0316和JS0424分离株pp38基因推导的氨基酸序列也分别出现了特有的氨基酸突变（L981,F240S）和（W67G,V210A）。结果表明三重荧光定量PCR检测结果和病毒分离结果一致,发病鸡均感染了马立克病毒,且分离毒株均具有强毒的分子特征。因此,所建三重荧光定量PCR方法可用于临床检测。
张治国[3]（2020）在《一株新型E亚群禽白血病病毒的分离与鉴定》文中研究表明禽白血病（avian leukosis,AL）是指由反转录病毒科甲型反转录病毒属的禽白血病病毒（avian leucosis viruses,ALVs）引起的以禽类造血组织中某些细胞成分过度增生为主的一类可传染的肿瘤性疾病。ALVs为线性的单股正链RNA病毒,基因组长约7.0-7.8kb,基因组两端有长末端重复序列（LTR）,为非编码区,中间为含有5’-gag–pol-env-3’顺序的结构基因,可编码多种蛋白。2019年,在没有外源性禽白血病病毒和任何其他致肿瘤病毒感染的情况下,从江苏一家商品蛋鸡场中发现了一起疑似禽白血病的肿瘤病例。本研究对该病例进行了病毒检测,进而对检测到的病毒做分离鉴定、全基因组序列测定与比较分析,确定引起该病的病原为一株重组E亚群禽白血病病毒（ALV-E）。本研究共分三部分:一、病料收集与病毒检测2019年12月,江苏一家蛋鸡场发生一起肿瘤性传染病,发病率为40%,病死率为10%,剖检时发现肝脏上有肿瘤。本研究设计了马立克病毒、禽白血病病毒、禽戊型肝炎病毒、网状内皮组织增生症病毒等鸡致肿瘤病毒的特异性检测引物,对可能引起该病的病原进行了检测。PCR检测和扩增产物的测序结果表明该鸡场发病可能是由ALV-E感染所致。二、病毒的分离与鉴定将病死鸡有明显肿瘤病变的肝脏组织研磨后接种到鸡胚成纤维细胞（CEF）,连续传三代后收获细胞上清,使用商品化试剂盒进行ELISA检测p27抗原,并超速离心后进行病毒颗粒的电镜观察。同时原核表达该毒株的gp85蛋白免疫BALB/c小鼠制备单因子血清,以此血清进行CEF的间接免疫荧光检测（IFA）。检测结果表明引起该病的ALV可以在CEF上进行复制并形成完整的病毒粒子,将该病毒命名为JS1208。三、全基因组克隆测序及分析根据已发表的ALV-E的全基因组序列设计了七对特异性引物,进行JS1208毒株的全基因组克隆测序。另外设计两对引物,对其可能存在的特殊结构进行检测。测序结果表明,JS1208株ALV基因组全长为7524nt,全基因组核苷酸序列和囊膜蛋白基因（env）氨基酸序列系统进化分析表明,JS1208株ALV为一株ALV-E。长末端重复序列（LTR）的系统进化树分析结果表明,JS1208株（ALV-E）的LTR与K亚群ALV（ALV-K）GDFX0601株的LTR完全相同。利用RDPv.4软件分析显示:JS1208毒株是由E亚群的ev-1毒株和K亚群的TW-3593毒株重组而来。这是首次发现由ALV-E和ALV-K重组而来的ALV-E引起鸡场发生肿瘤性传染病并造成较为严重的临床危害,应当引起高度重视。
陈志祥[4]（2020）在《三例鸡病毒性传染性腺胃炎病例临床诊断与鉴别分析》文中进行了进一步梳理鸡病毒性传染性腺胃炎是以引起鸡发育缓慢,少食少水,饲料转化率低下,鸡群胴体均匀度不佳为主要特征的传染病,各品种的肉鸡和蛋鸡均能感染此病,给禽类生产造成了巨大的压力。有研究表明,J亚群禽白血病病毒（ALV-J）、圆圈病毒3型病毒（GyV3）以及网状内皮组织增生症病毒（REV）等病毒均可以引起传染性腺胃炎的发生,临床上很难区分不同致病病原引发的传染性腺胃炎,对这一问题,我们通过比较不同病毒引起的鸡病毒性传染性腺胃炎病例,鉴别分析病理特点,为今后临床上鸡病毒性传染性腺胃炎的快速诊断提供理论指导和技术支撑。2017年9月6日,山东青岛某鸡场送检8只病鸡。该批鸡15-16日龄开始出现腺胃炎症状,发病率达到50%。对此批病鸡进行剖检,观察到病鸡腺胃出肿大,内壁有出血点,肾脏肿大,胸腺萎缩,肝脏肿大易脆。制备血涂片,观察到淋巴细胞和异嗜性粒细胞增多。制备病理组织切片,观察到腺胃腺管上皮细胞坏死脱落,固有层和腺管间淋巴细胞浸润,肾脏被膜到中央静脉间出现大面积髓细胞增生灶,在肝脏血管周边和实质看到髓细胞的增生灶,灶内出现核分裂像。取病鸡肝脏,腺胃组织提取DNA和RNA,进行PCR检测,ALV-J呈阳性条带,其他与腺胃炎相关的病毒检测均为阴性。使用麦康凯琼脂plat和血琼脂plat分离细菌,37℃培养1848h后,未出现任何致病菌生长,表明未发生细菌感染。2018年10月8日,山东聊城某养殖合作社送检8只病鸡,临床症状表现为饲料便,鸡群均匀度差。对此批病鸡进行剖检,观察到病鸡腺胃肿大,腺胃乳头消失,法氏囊出血,胸腺萎缩。制备血涂片,观察到异型性红细胞增多,幼红细胞增多。制备病理组织切片,观察到腺胃粘膜层角质化,腺胃腺管间淋巴细胞广泛浸润,法氏囊皮质髓质界限不清,淋巴细胞流失,胸腺间质水肿,淋巴细胞流失。取病鸡肝脏,腺胃组织提取DNA和RNA,进行PCR检测,GyV3呈阳性条带,其他与腺胃炎相关的病毒检测均阴性。使用麦康凯琼脂plat和血琼脂plat分离细菌,37℃培养1848h后,未出现任何致病菌生长,表明未发生细菌感染。2019年8月8日,从潍坊青州某养鸡场送检9只病鸡,临床表现为羽毛蓬乱逆立,发育不良,对此批病鸡进行剖检,观察到腺胃肿大,腺胃乳头扁平甚至消失,肾脏和脾脏肿大,肝脏表面散在坏死点。制备血涂片,观察到淋巴细胞和单核细胞增多。制备病理组织切片,观察到腺胃腺管间淋巴细胞浸润,脾脏淋巴细胞流失,肝脏出现大量坏死灶,灶内出现核分裂像。取病鸡肝脏,腺胃组织提取DNA和RNA,进行PCR检测,REV呈阳性条带,其他与腺胃炎相关的病毒检测均为阴性。使用麦康凯琼脂plat和血琼脂plat分离细菌,37℃培养1848h后,未出现任何致病菌生长,表明未发生细菌感染。本研究通过分析比较ALV-J,REV和GyV3三种不同病毒感染引起的鸡病毒性传染性腺胃炎病例的临床症状,剖检病变,血像变化,组织病变,鉴别分析三种病毒的病理特点,为今后临床上鸡病毒性传染性腺胃炎的快速诊断提供理论指导和技术支撑。
高畅[5]（2020）在《REV感染对SPF鸡胚成纤维细胞转录后调控的影响》文中认为禽网状内皮组织增生病（reticuloendotheliosis,RE）是由禽网状内皮组织增生病病毒（reticuloendotheliosis virus,REV）感染禽类宿主引起的一种病理综合征,包括生长迟缓,免疫抑制以及肿瘤发生等。由于REV传播途径多样,宿主范围广泛,因此自从1958年始,REV得以被广泛分布在全世界。此外,疫苗等生物制品也可能被REV污染,从而造成疫苗接种失败,抑制宿主免疫系统使其免疫力降低,导致其他疾病的共发,给畜牧养殖业经济造成巨大损失。本实验通过高通量测序、实时荧光定量PCR等方法手段,检测鸡胚成纤维细胞（CEF）在REV感染过程中可变剪接以及miRNA-155表达的变化,发掘二者在CEF应答REV感染的转录后水平上所发挥的调控作用,为进一步研究REV的免疫致病机制及其对感染动物免疫抑制以及肿瘤形成机制的探讨,提供新的研究方向,同时为该病的防制（治）提供理论依据和新思路。主要研究内容和结果如下:（1）荧光定量检测REV方法的建立将复制得到的病毒液提取RNA经PCR验证后,在紫外灯下可观察到195 bp长度的条带,证明病毒液为REV阳性。将复制成功的病毒液与质粒连接,并进行连续十倍稀释,通过荧光定量PCR得到REV LTR片段的扩增曲线、熔解曲线及标准曲线。各稀释度的重组质粒在达到对数增长期时间距均匀,证明其表达差异呈线性变化,同时阴性对照无扩增,证明本实验无假阳性干扰;扩增产物熔解峰单一,证明无引物二聚体和非特异性扩增,且熔解温度为85.252±0.057℃;REV LTR片段的标准曲线呈线性回归方程,所选取的各稀释度点均在线上,其回归方程为y=2.899x+4.464,相关系数R2=0.9991,证明可信度高。（2）病毒滴度测定于REV感染后第7 d记录细胞完全发生病变的孔数,经计算得到病毒液的TCID50为10-4.625/0.1ml,即将该病毒稀释104.625倍后接种100μl可使50%的细胞发生病变。（3）高通量测序结果及分析将CEFs分为对照组（C组）和病毒感染组（VB组）,每组均有3个重复,6个样本经高通量测序后均得到大量数据,长度为10.2 G-12.92 G,错误率为0.02%,Q20大于96%,Q30大于90%,GC含量在50%左右,去除其中影响分析结果的低质量及含有接头等的数据后,数据仍能达到原始数据的94.6%以上,说明测序数据质量较好。将处理后数据与参考基因组比对发现,70%以上可比对到参考基因组序列上,其中能唯一比对到参考基因组序列上的数据大于90%,说明样品未被污染,且选择的参考基因组是合适的。同时还发现,可比对到参考基因组序列的蛋白编码区域,即外显子的百分比均大于70%,说明检测到的基因绝大多数都是编码蛋白质的基因,也证明了测序的序列都来自于m RNA。在两个比较组中,共发现15973个基因,其中6 939个基因发生了可变剪接,外显子跳跃（SE）事件发生数量为16 860,占总事件数量89.22%,是最普遍的一种剪接模式,也是产生差异最主要的可变剪接模式,上调事件为183,下调事件为524。在C组和VB组间共发现5 607个基因显着差异表达,2 825个基因在REV感染组的表达显着高于对照组,2 782个基因在REV感染组的表达显着低于对照组。差异表达可变剪接基因主要与GO富集分析中的细胞组成相关,如细胞器管腔、膜结合细胞器、细胞质与囊泡等。差异表达可变剪接基因富集较多的KEGG细胞信号转导通路为磷脂酰肌醇信号通路、MAPK信号通路、凋亡、焦点粘连等。（4）高通量测序结果验证随机选择FN1、TNC和SEC61B被剪接的外显子,分别命名为Fe、Te和Se,作为对照,这3个外显子临近未被剪接的外显子同样被检测,依次命名为Fn、Tn和Sn。Fe、Te和Se的泳道没有或仅有少量PCR产物,其余泳道均有明显且长度正确的条带,说明高通量测序预测的可变剪接事件是真实发生的。（5）miR-155表达与REV接毒时间和剂量的关系与C组相比较,VB组接毒后12、24、48、72、96和120 h的miR-155表达量显着上升（P<0.01）,并随病毒作用时间的延长而升高,且二者呈正相关,并于接毒后第72 h达到峰值（P<0.001）。另外,随着REV感染滴度的增加,miR-155表达量也随之升高（P<0.001）,二者呈正相关。（6）miR-155 NC、mimics和inhibitors转染效率检测在荧光倒置显微镜下观察发现,未转染的正常CEFs中未见荧光,而分别转染了miR-155NC,mimics和inhibitors的CEFs胞质中均出现了程度不同的荧光,且荧光效率可达60%以上。经荧光定量PCR检测,转染miR-155 mimics的CEFs中miR-155表达量显着升高（P<0.001）,并随转染时间的延长逐渐增强,转染后第72 h达到较高水平并基本维持不变;转染miR-155 inhibitors的CEFs中miR-155表达量显着降低（P<0.01）,在转染后第12 h即被完全被抑制,并且在转染后72 h内miR-155表达量均保持在较低水平;转染miR-155 NC的CEFs中,miR-155表达量与未经转染的CEFs之间无显着性差异（P>0.05）。（7）REV感染对CEFs活力的影响将CEFs分别分为:C（对照组）、V（只接毒不转染）、VN（接毒后转染miR-155 NC）、VM（接毒后转染miR-155 mimics）和VI（接毒后转染miR-155 inhibitors）组。与C组相比,V组CEFs活力极显着（P<0.001）降低。与V组相比,VM组细胞活力极显着（P<0.001）提高,而VI组细胞活力极显着（P<0.01）降低,VN组与V组间细胞活力无显着性（P>0.05）差异。（8）REV感染对CEFs凋亡及其相关酶活性的影响流式细胞仪检测结果显示,与C组相比,V组凋亡细胞数量极显着（P<0.01）增加。与V组相比,VM细胞凋亡率显着（P<0.05）降低,VI组显着（P<0.05）的增加了CEFs的凋亡率,VN组与V组间细胞凋亡率无显着性（P>0.05）差异。Caspase-3活性检测结果显示,与C组相比,V组中ρNA产量显着（P<0.05）提高。与V组相比,VM组降低ρNA产量,VI组极显着（P<0.01）提高ρNA产量,VN组与V组间ρNA产量未见显着性（P>0.05）差异。（9）REV感染对CEFs细胞周期的影响流式细胞仪检测结果显示,与C组相比,V组CEFs的G0/G1期细胞数量极显着（P<0.01）提高,而S期和G2期细胞极显着（P<0.01）或显着（P<0.05）减少。与V组相比,VM组CEFs的G0/G1期细胞数量极显着（P<0.01）减少,而S期细胞极显着（P<0.01）增加,G2期细胞数量有所增加;VI组CEFs的G0/G1期细胞数量极显着（P<0.01）增加,G2期细胞数量显着（P<0.05）减少,S期细胞相对减少。而VN组与V组间各细胞周期分布无显着性（P>0.05）差异。（10）miR-155靶基因验证经Targetscan、miRanda软件以及高通量测序结果分析发现,caspase-6和FOXO3a是数据库中共同命中的miR-155靶基因。Western Blot（WB）检测结果显示,与C组相比,V组caspase-6和FOXO3a蛋白表达量显着（P<0.05）升高。与V组相比,VM组caspase-6和FOXO3a蛋白表达量显着（P<0.05）降低;VI组FOXO3a蛋白表达量进一步显着（P<0.05）升高,caspase-6蛋白表达量也有所升高。VN组与V组的caspase-6和FOXO3a蛋白表达量未见统计学差异（P>0.05）。上述研究结果为进一步阐明REV感染对CEFs转录后调控的影响,及可变剪接和miR-155在其中所扮演的重要角色提供了重要的科学实验依据,也为进一步在分子水平探讨REV的免疫致病机制提供了新思路。
李根[6]（2019）在《鸡传染性腺胃炎相关病毒-圆圈病毒3型的分离鉴定及致病机制研究》文中研究说明鸡病毒性传染性腺胃炎（Transmissible viral proventriculitis,TVP）主要引起鸡的消瘦、粪便过料、腺胃肿大等症状。该病最早在1978年由荷兰科学家Kouwenhoven发现,并蔓延至全世界各个国家。中国在1994年的江苏省最先出现,随后在全国各省市呈爆发式流行。该病能够显着增加料肉比,降低鸡肉的产量,给肉鸡养殖业带来巨大的经济损失,已成为困扰肉鸡养殖业的重要问题。尽管国内外众学者分离到多种相关病毒,如网状内皮增生症病毒、传染性支气管炎病毒、传染性法氏囊病病毒、呼肠孤病毒、J亚群禽白血病病毒、马立克氏病病毒、鸡传染性贫血病毒、腺胃坏死病毒等,但均无法使用纯病毒复制出该病,因此,鸡TVP的病因一直未明。根据大量流行病学调查结果及前人的研究,我们推测该病是由一种未知的新病毒引起。为了鉴定此未知病毒,本研究通过深入流行病学调查,排除现有已知的TVP相关病毒,筛选典型单感染TVP病例,建立TVP疾病模型,利用PacBio三代测序平台进行病毒宏基因组高通量测序,分离鉴定病毒,进而研究病毒的致病机制。为临床生产提供理论指导和技术支撑。为了获得无现有已知TVP相关病毒感染的单纯TVP病例,本研究通过流行病学调查,采集了80多个TVP发病鸡场的336份样品,通过大体剖检及病理组织学检测,对发病类型进行归纳总结,利用病理学方法进行分类。从中筛选出病理组织学病变为黏膜层和腺管间淋巴细胞浸润的TVP病例。通过PCR检测排除上述已知8种腺胃炎相关病毒的感染,并且接种营养肉汤培养基排除细菌感染。为排除无关病毒的干扰,确保后续病毒鉴定的准确性。本研究以筛选出的病例的病料为原始材料回归SPF鸡,成功复制出TVP疾病模型,感染鸡表现表现出典型TVP症状。再次对回归动物进行已知腺胃炎相关病毒的PCR检测,检测结果显示8种已知TVP相关病毒均为阴性,排除已知相关病毒污染。为了鉴定病毒,首先通过电镜观察到病毒粒子的大小和形态,发现病毒粒子呈圆形或二十面体对称,无囊膜,直径为26-28 nm。使用PacBio三代测序平台进行病毒宏基因组高通量测序,并与2017年NCBI最新病毒库进行BLAST比对。比对上的序列均显示同一种病毒-圆圈病毒3型（Gyrovirus 3,GyV3）。使用反向PCR扩增病毒全长序列,最终得到病毒的全长序列为2356 bp,将其命名为SDAU-1株。GyV3-SDAU-1株基因组中含有3个重叠的开放阅读框,编码三种蛋白,分别为衣壳蛋白VP1,骨架蛋白VP2,凋亡蛋白VP3。NCBI查找圆环病毒科和细环病毒科共30株病毒全基因组序列构建系统发育进化树,结果显示GyV3-SDAU-1与GyV3-FecGy同源关系最近,属于细环病毒科圆圈病毒属。GyV3为单链环状DNA病毒,2012年首次在智利和香港发生急性胃肠炎的儿童粪便中分离鉴定,说明该病毒与胃肠炎关系密切,本研究首次从发生TVP的商品肉鸡中检测到GyV3,证实GyV3来源于鸡。根据柯赫氏法则,需证明GyV3是否是引起TVP的主要原因。首先对采集的336份TVP病例和102份正常鸡样品,进行了回顾性流行病学调查。结果显示,336份腺胃炎病例中GyV3阳性率为12.5%（42/336）,在正常鸡中未检测到GyV3（0/102）。表明GyV3在TVP病例中普遍存在,而在健康鸡体内不存在。为了纯化GyV3,体外培养鸡胚腺胃原代细胞,并将GyV3感染鸡腺胃组织处理后接种于鸡胚腺胃原代细胞。收集接种GyV3的细胞,通过电子显微镜可以观察到GyV3粒子,PCR检测显示GyV3为阳性,8种已知腺胃炎相关病毒均为阴性,说明病毒可以在腺胃原代细胞中复制,并且未污染其他病毒。然后将纯培养的GyV3接种1日龄SPF鸡,接毒鸡表现消瘦、腺胃肿大、腺胃乳头肿胀、腺胃黏膜层和固有层大量淋巴细胞浸润,呈现典型的TVP症状,并且从发病鸡中能够再次分离到GyV3,证明GyV3确实能够引起鸡的TVP。为明确GyV3的致病性及发病规律,将腺胃原代细胞培养的GyV3接种SPF鸡,通过大体剖检观察和病理组织学观察病变情况,表明鸡腺胃组织从7日龄开始出现明显炎症,14-21日龄之后达到高峰,35日龄症状减轻,这与临床生产中鸡TVP的发病日龄吻合。接毒鸡除表现典型的TVP症外,还引起鸡的贫血和免疫抑制症状。为明确GyV3的可能感染途径,通过腹腔、静脉、皮下、口服注射4种不同方式接种SPF鸡,发现不同接种方式均表现出相同的病理变化和病程变化。说明GyV3可以经多种途径感染。为明确GyV3对不同日龄SPF鸡的感染力,将GyV3接种不同日龄（7日龄、14日龄、21日龄、28日龄）SPF鸡,结果显示,不同日龄的鸡均表现出相同的病理变化和病程变化,说明鸡只对GyV3无日龄抗性,即GyV3可感染不同日龄的鸡只。为了探究GyV3的发病机制,本研究研究通过绝对荧光定量PCR检测8个时间段,29种鸡组织器官内的病毒含量。结果显示,病毒含量最高的组织为肾上腺、骨髓,其次是神经、卵巢和羽髓,而腺胃的病毒载量则相对较低。肾上腺和神经高病毒含量表明其引起腺胃炎的原因可能是间接的,病毒入侵肾上腺和神经后,导致体液调节和神经调节的腺胃出现炎症。而骨髓作为最大的造血器官,病毒入侵后,导致造血干细胞及早期免疫细胞发育不良,造成贫血和免疫抑制。为探索GyV3发病的分子机制,以GyV3的主要结构蛋白VP1构建真核表达载体并转染细胞,通过免疫共沉淀联合质谱分析技术分析与其互作的宿主蛋白,结果显示,信号转导和转录激活子3、T细胞受体、胱天蛋白酶募集域蛋白9和酪蛋白激酶1四种蛋白可能分别参与了病毒入侵机体及逃避宿主免疫、机体对病毒的识别和信号传递、激活先天性免疫和特异性免疫等过程,说明GyV3感染改变了细胞的生物进程,激活或抑制了一系列信号通路。综上所述,本研究在大量临床调查的基础上,利用病毒宏基因组高通量测序的方法从无现有TVP相关病毒感染的、单纯TVP病例中分离鉴定出一种新病毒,GyV3。并使用纯培养的GyV3复制出TVP,证明GyV3是引起鸡TVP的直接病因,同时GyV3也能够引起贫血和免疫抑制。而GyV3诱导腺胃炎的原因可能是GyV3感染肾上腺和骨髓间接引起。此外,GyV3的结构蛋白VP1主要通过信号转导和转录激活子3、胱天蛋白酶募集域蛋白9、酪蛋白激酶1和T细胞受体四种蛋白与宿主细胞发生互作以改变宿主细胞的生物进程。我们的研究为后续GyV3的致病机制研究和TVP的防控提供了科学基础。
庄萍萍[7]（2016）在《J亚群禽白血病病毒与禽网状内皮组织增生症病毒Exosome途径协同感染机制》文中研究指明近年来,J亚群禽白血病病毒（ALV-J）和禽网状内皮组织增生症病毒（REV）共同感染和协同致病的现象广泛发生,给我国养禽业带来了严重的损失,然而,关于ALV-J和REV协同感染的机制尚不明了。Exosome是由细胞分泌的一种功能性小囊泡,它通过调节特异性蛋白质、脂质、核酸等的分泌,参与体内多种的生理和病理过程。Exosome为我们研究ALV-J与REV协同感染机制提供了新思路。本研究在证明ALV-J和REV具有协同感染能力的基础上,拟通过分析共感染ALV-J+REV细胞分泌的exosome的蛋白质组学和转录组学（mi RNA）,揭示ALV-J和REV共同利用的细胞通路,从而初步阐明ALV-J与REV协同感染机制,为联合防控及其它病毒间协同感染机制研究奠定科学基础。将ALV-J-NX0101病毒和REV-SNV株病毒接种无特定病原体（SPF）鸡胚分离的鸡胚成纤维细胞,设置4个实验组:ALV-J+REV组,ALV-J组,REV组,和无病毒空白对照组。经PCR、间接免疫荧光（IFA）和禽白血病抗原（p27）检测接毒成功后,以荧光定量PCR方法从病毒转录层面证明ALV-J和REV协同感染,结果显示在感染72h内,共同感染组中ALV-J和REV的RNA转录水平均高于单独感染组;通过激光扫描共聚焦显微镜（CLSM）观察发现,ALV-J和REV共同感染组REV蛋白表达较单独感染组提前24h,ALV-J的蛋白表达较单独感染组增强,从蛋白层面证明了ALV-J和REV具有协同感染作用。为研究ALV-J和REV共感染细胞分泌的exosome在免疫抑制上是否也具有协同作用,我们无菌分离42日龄SPF鸡脾白细胞,加入定量的Exosomes共同培养一定时间,通过流式细胞术检测CD4+、CD8+T细胞数量,ELISA实验检测IL-2、IL-10、IL-12的分泌情况。结果显示,12h之前,Exo-RJ组CD4+和CD8+T细胞的数量均低于对照组;IL-2的分泌量在4h,Exo-RJ组高于对照组,且与Exo-R组差异显着;IL-10的分泌量在8h,Exo-RJ均显着低于对照组;IL-12的分泌量在0.5h,Exo-RJ均低于对照组,且差异显着。这说明共感染ALV-J和REV细胞分泌的exosomes对免疫细胞抑制作用增强。为揭示ALV-J和REV是否共同利用细胞信号通路达到协同作用,我们对提取到的exosome进行i TRAQ蛋白质组学分析,同时用相同的exosome样品提取RNA进行Hiseq mi RNA分析。结果显示,在CEF细胞培养上清液提取的exosome中共鉴定了1154种蛋白质,932种已知mi RNA和785种未知mi RNA。四组exosomes中均存在exosome的标志性蛋白质,如Hsp70、Hsp90、四跨膜蛋白、14-3-3等,而且我们exosome中检测到了ALV-J的gag、env蛋白质以及REV的gag、pol和env蛋白质,这说明病毒感染细胞分泌的exosome中携带了病毒结构蛋白。通过对表达差异蛋白的靶标蛋白、差异mi RNA靶标蛋白的聚类及信号通路分析,发现差异蛋白NCKAP1与差异mi RNA靶蛋白ITGA1位于共同的肌动蛋白细胞骨架（Regulation of actin cytoskeleton）信号通路上,使ARP2/3蛋白下调,抑制肌动蛋白聚合及板状伪足形成,说明ALV-J和REV从蛋白质水平和mi RNA水平共同启动了肌动蛋白细胞骨架通路,从而形成协同作用。肌动蛋白细胞骨架,是纤维状肌动蛋白在细胞中的分布网络,它具有维持细胞形状、调控细胞粘连及细胞运动等功能。实验证明该通路的异常改变会引起包括肿瘤在内的多种疾病的发生,并且有许多癌症的预防、治疗药物是通过改变肌动蛋白细胞骨架结构来实现的。我们对ALV-J和REV协同启动肌动蛋白细胞骨架通路的发现,不仅对研究ALV-J与REV协同机制意义重大,更将为禽肿瘤病或其它禽病研究提供科学的理论依据,为预防和治疗禽肿瘤病提供新的思路,但对这一通路还有待于进一步验证。
朱瑞豪[8]（2015）在《鸡三种免疫抑制病基因芯片检测方法的建立》文中提出近年来，禽类免疫抑制病在我国养禽业中迅速蔓延，严重地威胁着养禽业的健康发展，禽类免疫抑制病在临床上主要依靠疫苗和药物来防控和治疗；但其中一些疫病迄今为止仍无有效的疫苗和药物，此类疫病在临床上主要通过对病原进行检测，从而达到净化和防控的目的。本研究基于多重PCR技术，建立了鸡传染性贫血病、禽网状内皮组织增殖病和区分禽白血病A、C、D亚群的基因芯片检测方法。根据NCBI收录的鸡传染性贫血病毒、禽网状内皮增生症病毒与禽白血病病毒A、C、D亚群参考毒株的序列，设计合成3对特异性扩增引物，将下游引物进行Cy3荧光标记，建立多重PCR体系；并参考目的序列内保守区域，设计合成10条寡核苷酸探针，按照矩阵设计，点制在醛基化玻璃基片上，制作寡核苷酸探针基因检测芯片；提取病毒核酸，进行多重PCR扩增后与探针进行杂交，然后用荧光检测仪扫描并分析结果。经杂交反应后，芯片能够同时检测鸡传染性贫血病病毒和禽网状内皮增殖病病毒，并能区分禽白血病病毒A、C、D亚群，其灵敏度能够到达107copies/mL，并且具有较高的特异性。基因芯片对450份临床样品检测的结果与ELISA抗体检测结果相比符合率高。本研究结果证明，基因芯片技术是一种有效地检测鸡传染性贫血病毒和禽网状内皮增殖病病毒，并能区分禽白血病病毒A、C、D亚群的方法，为今后在临床应用中快速鉴别诊断鸡传染性贫血病病毒、禽网状内皮增生症病病毒与禽白血病病毒A、C、D亚群提供可行性。通过本研究方法建立了禽白血病基因芯片，对同一只鸡的全血、血清、蛋清和泄殖腔棉拭子等进行跟踪检测。检测结果显示，基因芯片方法检测全血的阳性率为69.23%；ELISA试剂盒检测蛋清样品中p27抗原的阳性率为23.08%。芯片检测率显着高于ELISA试剂盒检测率，且全血是用于禽白血病基因芯片检测的最优材料。
姜莉莉[9]（2014）在《东北地区野生鸟类主要禽免疫抑制病病原感染情况调查及与REV PR相互作用宿主蛋白的筛选》文中研究说明近年来,禽网状内皮组织增生症病毒（Reticuloendotheliosis virus, REV）与J-亚群禽白血病病毒（Avian Leukosis virus subgroup J, ALV-J）、鸡传染性贫血病毒（Chicken infectious anemia virus, CAV）和马立克氏病病毒（Marek’s disease virus, MDV）等几种免疫抑制性病毒的混合感染在养鸡场中普遍存在,使得鸡群免疫力低下,导致针对禽流感、新城疫等重要疫病的疫苗免疫失败,并容易造成继发感染,使疫病的诊断和防控难度加大。其中,有3大病毒性肿瘤病之称的禽白血病（AL）、禽网状内皮组织增生症（RE）和马立克氏病（MD）对禽类健康的危害甚为严重。针对上述病原的分子流行病学研究主要集中于家禽和水禽,很少有关野生鸟类的调查报道,且目前对野生鸟类携带病原的研究主要集中在禽流感病毒和新城疫病毒,国内外尚未见有关野生鸟类禽免疫抑制病病原的流行病学调查报道。野生鸟类作为许多病原携带者和自然宿主,可潜在传播人和动物的重要传染病。随着候鸟的迁徙,携带某些病毒的候鸟可能会将病毒传播到不同的地方而导致疾病的爆发和流行。因此,对野生鸟类进行常见病原的流行病学监测,具有重要的指示意义。为研究野生鸟类感染或携带禽免疫抑制病病原情况,本研究对2010年5月至2012年11月期间收集自东北三省部分地区的野生鸟类样品进行了几种常见禽免疫抑制病病原的分离鉴定及流行情况分析。样品来自于我国东北地区鸟类环志站和野生动物疫源疫病监测站,共收集到野生鸟类样品916份,其中野鸭样品581份；鸟类样品以雀形目的小型鸟为主,共335份。一方面进行了病毒的分离鉴定,调查了几种病原的感染流行情况；另一方面选取有代表性的毒株进行了基因克隆和分子遗传特征分析。1.东北地区野生鸟类几种常见的禽免疫抑制病病原PCR检测常规方法提取野鸟样品的DNA和RNA,用针对以下几种禽免疫抑制病病原的特异性PCR检测方法进行野鸟带毒情况初检：REV, ALV-A （Avian Leukosis virus subgroup A）, ALV-B （Avian Leukosis virus subgroup B）, ALV-J, CAV, MDV,禽传染性法氏囊病病毒（IBDV）以及禽呼肠孤病毒（Avian reovirus, ARV）。实验结果表明野鸟存在REV, ALV-A, ALV-B, ALV-J以及CAV的感染。部分样品检测,没有发现MDV、IBDV和ARV的感染。所有野生鸟类样品的REV PCR阳性检出率为10.7%,其中野鸭阳性率为13.1%,小型鸟阳性率为6.6%；CAV PCR阳性检出率为4.1%；ALV-A PCR阳性检出率为4.35%；ALV-B PCR阳性检出率为6.4%；ALV-JPCR阳性检出率为6.8%；野生鸟类REV、ALV-A、ALV-B和ALV-J携带情况不具明显的季节性,不同种类野鸟的REV和ALV-J阳性检出率有一定差别。其中野鸭REV以针尾鸭阳性检出率最高,小型鸟中以长尾雀阳性检出率最高；ALV-J以凤头潜鸭阳性检出率最高,小型鸟以红肋蓝尾鸲阳性检出率最高。2.东北地区野鸟源REV的分离鉴定及gp90基因遗传演化分析将用REV PCR检测引物初筛为阳性的病料经适当处理后接种敏感细胞DF1培养增殖,进行病毒的分离。经特异性PCR和间接免疫荧光方法（IFA）鉴定,以及电镜检测,确定共分离到10株野鸟源REV,其中2株来源于小型鸟,其余8株分离自野鸭。对鉴定为阳性的REV分离株,对其保护性抗原基因gp90基因进行克隆和序列测定,与GenBank上已发表的REV参考株进行序列比对和分析。测序结果显示10株分离株的gp90大小为1191bp,编码了397个氨基酸；序列分析结果显示：10个REV分离株gp90基因氨基酸序列相似性为92.4%-100%；核苷酸遗传进化分析表明,所比对的序列明显地分三个分枝,每个分枝代表REV的3个不同亚型；10个野鸟源REV分离株与现有的东北分离株亲缘关系较近,位于同一分枝,趋于形成1个北方分离群；与美国和中国台湾地区的某些分离株同源性较高。与170A株和我国早期南方分离株HA9901亲缘关系较远；与SNV株亲缘关系最远。结果说明我国存在Ⅰ、Ⅲ2种亚型的REV，Ⅲ型是目前东北地区的家禽流行毒株,野鸟存在REV感染,且以Ⅲ型REV为主导。该研究首次自野鸟体内分离到REV,证明REV可感染野生鸟类。该研究结果既丰富了REV流行病学资料,同时也提醒我们重视野生鸟类迁徙在疾病传播中所扮演的角色,为深入研究REV致病机制、免疫抑制机制等奠定基础。以提取的DBYR1102前病毒cDNA为模板,分段克隆DBYR1102基因组,并进行测序分析。结果显示,DBYR1102po1基因最保守,gag、pol和env基因氨基酸序列与中国北方禽源分离株相似性较高,属于Ⅲ型REV。3.东北地区野鸟源ALV-J分离鉴定及gp85基因遗传演化分析通过特异性PCR、间接ELISA抗原检测和IFA等方法,确定共分离到6株野鸟源ALV-J,其中4株来自野鸭,2株来源于野生小鸟。克隆6个野鸟源ALV-J分离株的主要保护性抗原基因gp85,并进行序列比对和遗传进化分析,结果发现野鸟源ALV-J分离株gp85基因ORF为921-924bp,分别编码307和308个氨基酸。各毒株gp85基因编码氨基酸序列同源性为81.2%-99.7%。毒株DBYJ1102, DBYJ1103, DBYJ1004和DBYJ106之间表现出高度的序列相似性,与近几年ALV-J蛋鸡分离株的推导氨基酸序列同源性较高,进化树显示处于同一分支,被称为Ⅰ群；而毒株DBYJ1101和DBYJ1105之间相似性较高,与原型株HPRS-103、美国代表毒株UD5以及大多数的肉鸡分离株的推导氨基酸序列表现出较高的同源性,共处于同一分支,被称为Ⅱ群。以上结果表明,6株ALV-J野鸟分离株gp85基因变异较大,其中两株与ALV-J英国肉鸡原型毒株HPRS-103株亲缘关系较近,另外4株与中国近几年蛋鸡分离株亲缘关系较近。提示野鸟毒株的遗传演化变异。4.REV p30蛋白的表达、纯化及间接ELISA检测方法的初步建立扩增REV p30基因,将其克隆至原核表达载体pET-30a（+）中,构建原核表达质粒pET30-p30,转化BL21（DE3）感受态细胞,经IPTG诱导,通过Western blot检测,p30蛋白在表达上清中呈可溶性表达。利用Ni-NTA His Bind Resin纯化重组蛋白,并用蔗糖浓缩重组蛋白,免疫新西兰白兔,制备兔抗p30多抗。SDS-PAGE及western blot结果表明,p30蛋白获得正确表达,表达产物具有良好免疫原性。制备的多克隆抗体的效价约为1：25600,以纯化的重组蛋白作为包被抗原,在包被量为3.2μ g/孔、血清1：250倍稀释条件下,P/N值最大,初步建立了REV抗体间接ELISA检测方法。该研究为REV的检测及p30基因的深入研究奠定了基础。5.酵母双杂交筛选与REV聚合酶PR相互作用的宿主蛋白研究与REV相互作用的宿主细胞蛋白对研究PR蛋白的功能、REV致病性以及感染机制等方面具有重要意义。本研究以REV PR为诱饵蛋白,利用酵母双杂交系统从本实验室构建的鸡胚成纤维细胞（chicken embryo fibroblast, CEF） cDNA酵母表达文库中筛选得到与REV聚合酶PR相互作用的宿主细胞蛋白,并通过酵母回返验证实验,证明了PR与Snapin在酵母细胞中存在相互作用。本实验构建了pGBKT7-PR酵母双杂交诱饵质粒,转化酵母菌,结果表明诱饵质粒没有自激活活性和毒性。用诱饵质粒筛选CEF cDNA文库,通过对阳性文库质粒插入片段测序分析,得到与PR相互作用的宿主蛋白ATPlB1和Snapin。已有研究表明Snapin蛋白参与细胞多种生化过程,并能发挥抗病毒作用。利用酵母菌Y2H进行回返验证,结果表明在酵母系统中,Snapin和PR存在相互作用。从CEF细胞成功扩增Snapin的基因,构建了带有Flag标签的pCAGGS-Snapin真核表达载体和带有HA标签的pCAGGS-PR真核表达载体。以上结果不仅为进一步通过免疫共沉淀（coimmunoprecipitation, Co-IP）验证PR和Snapin的相互作用提供了依据。同时为深入研究REV与宿主相互作用奠定了基础。
王玥,姜艳萍,于琳琳,王峰,陈洪博,王晓伟,成子强[10]（2011）在《蛋种鸡ALV-J与REV共感染病变新特点》文中研究说明2009年8月,山西榆次某鸡场蛋种鸡群产蛋量急剧下降,部分鸡产蛋停止。病理组织学观察发现,病鸡肝脏、肾脏、肺脏、心肌等组织中出现小灶状淋巴细胞瘤,肿瘤细胞为成熟的淋巴细胞;聚合酶链式反应（PCR）、酶联免疫吸附试验（ELISA）和间接免疫荧光（IFA）检测显示,被检鸡ALV-J感染率为8/8,而且7/8为病毒血症,与REV共感染率为2/8,未出现REV单感染;从发病情况看,淋巴细胞瘤均出现于共感染病例,特别是ALV-J病毒血症的共感染鸡病变最为严重,但未见ALV-J的特征性髓细胞瘤。囊膜蛋白氨基酸同源性分析显示,ALV-J毒株与英国HPRS-103原型株同源性最高（96.9%以上）,共感染的REV毒株与suv-env株同源性最高（93.8%）。本病例揭示,先天传播的ALV-J引起的病毒血症状态可能为REV的致瘤创造了环境,使临床罕见的REV淋巴瘤早于髓细胞瘤出现,因此,严格种鸡群的ALV-J净化是防控此病的重中之重。对于ALV-J与REV协同的机制还需进一步研究。
二、从J亚群禽白血病肿瘤中检测出禽网状内皮组织增生症病毒（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、从J亚群禽白血病肿瘤中检测出禽网状内皮组织增生症病毒（论文提纲范文）
（1）REV-SNV对SPF雏鸡RLRs信号通路相关MiRNAs及其靶基因表达的影响（论文提纲范文）
| 符号说明 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 1 前言 |
| 1.1 禽网状内皮组织增生症的研究概述 |
| 1.1.1 病原学 |
| 1.1.2 流行病学 |
| 1.1.3 临床症状及病理变化 |
| 1.1.4 REV与其他禽类病毒的混合感染 |
| 1.2 RIG-I样受体家族信号通路的研究概述 |
| 1.3 MicroRNAs的研究概述 |
| 1.4 实时荧光定量PCR技术的研究概述 |
| 1.5 双荧光素酶报告基因验证法的研究概述 |
| 1.6 本研究的目的和意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 主要试剂 |
| 2.1.2 相关溶液配制 |
| 2.1.3 主要仪器与设备 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 7、14、21dpi法氏囊中RLRs通路相关miRNAs及其相关基因表达规律的研究 |
| 2.2.1.1 引物设计与合成 |
| 2.2.1.2 组织RNA的提取 |
| 2.2.1.3 RT反应 |
| 2.2.1.4 标准曲线的建立 |
| 2.2.1.5 qPCR验证 |
| 2.2.1.6 结果计算与统计学分析 |
| 2.2.2 28、35、42dpi脾脏RLRs通路相关miRNAs及其相关基因表达规律的研究 |
| 2.2.2.1 引物设计与合成 |
| 2.2.2.2 组织RNA的提取 |
| 2.2.2.3 RT反应 |
| 2.2.2.4 qPCR验证 |
| 2.2.2.5 结果计算与统计学分析 |
| 2.2.3 gga-miR-222b-5p与 MAPK10 的靶向验证 |
| 2.2.3.1 生物信息学预测 |
| 2.2.3.2 引物及目的片段的合成 |
| 2.2.3.3 pmirGLO质粒的线性化 |
| 2.2.3.4 线性化载体和目的片段酶切产物回收 |
| 2.2.3.5 线性化pmirGLO质粒与MAPK10 3’UTR连接 |
| 2.2.3.6 线性化pmirGLO质粒与MAPK10 3'UTR突变型连接 |
| 2.2.3.7 大肠杆菌感受态(DH5α)的制备 |
| 2.2.3.8 重组载体质粒转化感受态细胞 |
| 2.2.3.9 阳性克隆鉴定 |
| 2.2.3.10 重组载体质粒的抽提 |
| 2.2.3.11 重组载体质粒双酶切鉴定 |
| 2.2.3.12 重组质粒的测序鉴定 |
| 2.2.3.13 鸡胚成纤维细胞的制备 |
| 2.2.3.14 细胞传代 |
| 2.2.3.15 细胞转染 |
| 2.2.3.16 重组质粒与miR-222b-5p或 miR-222b-5pNC分别转染鸡胚成纤维细胞 |
| 2.2.3.17 双荧光素酶报告基因实验试剂的制备 |
| 2.2.3.18 双荧光素酶报告基因活性检测 |
| 3 结果 |
| 3.1 标准曲线的建立 |
| 3.2 7、14、21dpi法氏囊中RLRs信号通路相关miRNAs及其相关基因的表达规律 |
| 3.3 28、35、42dpi脾脏中RLRs信号通路相关miRNAs及其相关基因的表达规律 |
| 3.4 gga-miR-222b-5p与 MAPK10 的靶向验证 |
| 3.4.1 生物信息学预测结果 |
| 3.4.2 重组载体质粒的双酶切验证结果 |
| 3.4.3 重组载体质粒的测序结果 |
| 3.4.4 双荧光素酶活性检测结果 |
| 4 讨论 |
| 4.1 REV-SNV感染SPF鸡法氏囊和脾脏中RLRs通路相关基因表达规律分析 |
| 4.2 REV-SNV感染SPF鸡法氏囊和脾脏中RLRs通路相关miRNAs表达规律分析 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表论文情况 |
（2）江苏地区家禽4种免疫抑制病病原检测及致瘤病毒三重荧光定量PCR检测方法的建立与应用（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 第一篇 文献综述 |
| 1 家禽免疫抑制病概述 |
| 1.1 鸡传染性贫血 |
| 1.2 马立克病 |
| 1.3 网状内皮组织增生症 |
| 1.4 禽白血病 |
| 1.5 我国家禽免疫抑制病病原感染现状 |
| 2 免疫抑制病病原检测方法的研究概况 |
| 2.1 病毒分离 |
| 2.2 血清学检测技术 |
| 2.3 分子生物学检测技术 |
| 3 本研究的目的和意义 |
| 第二篇 试验研究 |
| 第一章 江苏地区家禽4种免疫抑制病病原检测 |
| 1 材料 |
| 1.1 病料来源 |
| 1.2 毒株来源 |
| 1.3 主要试剂与仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 引物设计与合成 |
| 2.2 样品处理 |
| 2.3 样品DNA的提取 |
| 2.4 样品RNA的提取和反转录 |
| 2.5 样品PCR检测 |
| 2.6 数据整理与分析 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 病原的PCR检测结果 |
| 3.2 感染类型分析 |
| 3.3 不同日龄鸡免疫抑制病病原检测结果分析 |
| 3.4 不同品种鸡免疫抑制病病原检测结果分析 |
| 3.5 江苏地区鸡2016-2019年免疫抑制病病原检测结果分析 |
| 3.6 4种免疫抑制病病原感染间相互作用的比较 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第二章 鸡致瘤病毒三重荧光定量PCR检测方法的建立 |
| 1 材料 |
| 1.1 毒株来源 |
| 1.2 临床样品来源 |
| 1.3 主要试剂与仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 引物和探针的设计 |
| 2.2 病毒核酸提取 |
| 2.3 荧光定量PCR质粒标准品的制备与鉴定 |
| 2.4 单个荧光定量PCR方法的建立 |
| 2.5 三重荧光定量PCR检测方法的建立 |
| 2.6 临床样品的检测和验证 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 重组质粒PCR鉴定结果 |
| 3.2 重组质粒测序鉴定结果 |
| 3.3 质粒标准品的制备 |
| 3.4 单个荧光定量PCR方法的建立 |
| 3.5 三重荧光定量PCR检测方法的建立 |
| 3.6 临床样品的检测结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第三章 两例疑似肿瘤病鸡三重荧光定量PCR检测及马立克病病毒鉴定分析研究 |
| 1 材料 |
| 1.1 发病鸡背景资料及流行病学调查 |
| 1.2 主要试剂与仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 鸡致瘤病毒三重荧光定量PCR检测 |
| 2.2 MDV分离培养 |
| 2.3 REV和ALV分离培养 |
| 2.4 间接免疫荧光试验(IFA) |
| 2.5 致病相关基因的PCR扩增、测序及序列分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 发病鸡的组织病变 |
| 3.2 鸡致瘤病毒三重荧光定量PCR检测结果 |
| 3.3 REV和ALV分离结果 |
| 3.4 MDV分离结果 |
| 3.5 间接免疫荧光试验 |
| 3.6 致病相关基因的PCR扩增及序列分析 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 附录 本文第二章120份临床病鸡样品的流行病学背景资料 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
（3）一株新型E亚群禽白血病病毒的分离与鉴定（论文提纲范文）
| 符号说明 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 1.1 概述 |
| 1.2 病原学特征 |
| 1.2.1 禽白血病病毒的分类 |
| 1.2.2 禽白血病病毒的形态特征及理化特性 |
| 1.2.3 禽白血病病毒的分子生物学特征 |
| 1.3 内源性禽白血病 |
| 1.4 流行病学研究 |
| 1.4.1 传播途径 |
| 1.4.2 发病率 |
| 1.5 致瘤机制 |
| 1.6 禽白血病的临床症状及病理变化 |
| 1.7 禽白血病的诊断方法 |
| 1.7.1 病毒的分离 |
| 1.7.2 组织病理学诊断 |
| 1.7.3 分子生物学诊断方法 |
| 1.8 禽白血病的预防和控制 |
| 1.8.1 种群净化 |
| 1.8.2 严防生物源性污染 |
| 1.8.3 减轻机体免疫抑制 |
| 1.8.4 完善生物安全措施 |
| 1.9 本研究的目的意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 菌(毒)株 |
| 2.1.2 鸡胚成纤维细胞的制备 |
| 2.1.3 酶和相关试剂 |
| 2.1.4 主要仪器 |
| 2.1.5 溶液配置 |
| 2.1.6 引物的设计与合成 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 病料的检测 |
| 2.2.2 病毒的增殖与纯化 |
| 2.2.3 禽白血病病毒全基因组的扩增 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 病料的检测结果 |
| 3.1.1 临床剖检症状 |
| 3.1.2 病料的PCR检测结果 |
| 3.2 病毒分离鉴定 |
| 3.2.1 ELISA试剂盒检测ALV抗原结果 |
| 3.2.2 病毒的电镜鉴定 |
| 3.2.3 JS1208毒株gp85原核表达及单因子血清的制备 |
| 3.3 全基因组克隆测序及分析结果 |
| 3.3.1 全基因组扩增结果 |
| 3.3.2 ALV全基因组及env蛋白和5’LTR的基因分析与进化树构建 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（4）三例鸡病毒性传染性腺胃炎病例临床诊断与鉴别分析（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 1 前言 |
| 1.1 腺胃炎概述 |
| 1.2 鸡病毒性传染性腺胃炎概述 |
| 1.3 鸡病毒性传染性腺胃炎流行病学 |
| 1.4 鸡病毒性传染性腺胃炎病理变化 |
| 1.4.1 临床症状 |
| 1.4.2 剖检病变 |
| 1.4.3 组织学病变 |
| 1.5 鸡病毒性传染性腺胃炎致病病原 |
| 1.5.1 J亚群禽白血病病毒 |
| 1.5.2 网状内皮组织增生性病毒 |
| 1.5.3 圆圈病毒3型 |
| 1.5.4 其他病原 |
| 1.6 诊断与防治 |
| 1.7 研究目的与意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 试验动物 |
| 2.1.2 引物合成 |
| 2.1.3 试验试剂 |
| 2.1.4 试验仪器 |
| 2.1.5 试验地点 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 病料采集和背景信息 |
| 2.2.2 剖检观察 |
| 2.2.3 血涂片制备 |
| 2.2.4 病理组织切片制备 |
| 2.2.5 组织DNA提取 |
| 2.2.6 组织RNA提取 |
| 2.2.7 琼脂糖凝胶电泳 |
| 2.2.8 细菌分离与鉴定 |
| 3 结果 |
| 3.1 临床症状 |
| 3.2 剖检观察 |
| 3.2.1 山东青岛病例剖检观察 |
| 3.2.2 山东聊城病例剖检观察 |
| 3.2.3 山东潍坊病例剖检观察 |
| 3.3 血涂片观察 |
| 3.3.1 山东青岛病例血涂片观察 |
| 3.3.2 山东聊城病例血涂片观察 |
| 3.3.3 山东潍坊病例血涂片观察 |
| 3.4 病理组织学观察 |
| 3.4.1 山东青岛病例病理组织学观察 |
| 3.4.2 山东聊城病例病理组织学观察 |
| 3.4.3 山东潍坊病例病理组织学观察 |
| 3.5 病原检测 |
| 3.5.1 山东青岛病例病原检测 |
| 3.5.2 山东聊城病例病原检测 |
| 3.5.3 山东潍坊病例病原检测 |
| 3.6 细菌检测 |
| 3.7 鉴别分析 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（5）REV感染对SPF鸡胚成纤维细胞转录后调控的影响（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 引言 |
| 1.1 禽网状内皮组织增生病及其研究进展 |
| 1.1.1 禽网状内皮组织增生病病毒及其研究进展 |
| 1.1.2 REV的致病机制 |
| 1.1.3 REV感染动物的临诊主要症状及其病理变化 |
| 1.1.4 RE诊断及其防制(治) |
| 1.2 可变剪接及其研究进展 |
| 1.2.1 可变剪接概述 |
| 1.2.2 可变剪接的研究历史 |
| 1.2.3 可变剪接的主要形式 |
| 1.2.4 可变剪接的功能 |
| 1.2.5 可变剪接的产生机制 |
| 1.2.6 可变剪接的调控 |
| 1.2.7 可变剪接的应用与展望 |
| 1.3 microRNA及其研究进展 |
| 1.3.1 microRNA概述 |
| 1.3.2 microRNA-155及其研究进展 |
| 1.3.3 microRNA应用及其展望 |
| 1.4 本项目研究的目的与意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 细胞 |
| 2.1.2 病毒 |
| 2.1.3 主要仪器和设备 |
| 2.1.4 主要化学试剂和生物制剂 |
| 2.1.5 主要溶液及其配制 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 制备鸡胚成纤维细胞 |
| 2.2.2 病毒复制 |
| 2.2.3 REV荧光定量检测方法的建立 |
| 2.2.4 REV滴度测定 |
| 2.2.5 REV感染CEFs后可变剪接分析 |
| 2.2.6 REV感染对CEFs中miR-155的影响 |
| 2.3 数据处理 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 REV荧光定量检测方法的建立及病毒滴度测定 |
| 3.1.1 REV复制及其检测 |
| 3.1.2 REV荧光定量检测方法的建立 |
| 3.1.3 病毒滴度测定 |
| 3.2 高通量测序结果及其分析 |
| 3.2.1 样本转录组 |
| 3.2.2 可变剪接基因的识别 |
| 3.2.3 可变剪接基因差异表达分析 |
| 3.2.4 差异表达可变剪接基因功能分析 |
| 3.2.5 测序结果的验证 |
| 3.3 miR-155检测及其分析 |
| 3.3.1 REV接毒时间对CEFs中miR-155表达的影响 |
| 3.3.2 REV感染剂量对CEFs中miR-155表达的影响 |
| 3.3.3 转染效率的检测 |
| 3.3.4 细胞活力的检测 |
| 3.3.5 REV感染对CEFs细胞凋亡及其相关酶活性的影响 |
| 3.3.6 REV感染对CEFs细胞周期的影响 |
| 3.3.7 miR-155靶基因验证 |
| 4 讨论 |
| 4.1 REV复制及其验证 |
| 4.2 REV荧光定量PCR检测方法的建立及其应用 |
| 4.3 REV感染对CEFS可变剪接的影响 |
| 4.3.1 禽类病毒对可变剪接的影响 |
| 4.3.2 REV感染CEFs中差异表达可变剪接基因的功能分析 |
| 4.3.3 REV感染所致的可变剪接对CEFs细胞凋亡的影响 |
| 4.3.4 REV感染所致的可变剪接对CEFs细胞周期的影响 |
| 4.3.5 高通量测序结果的进一步验证 |
| 4.4 miR-155对REV感染CEFS的影响 |
| 4.4.1 miRNA在病毒感染中的作用 |
| 4.4.2 miR-155在REV感染CEFs中的变化 |
| 4.4.3 miR-155对CEFs应答REV感染的调控作用 |
| 4.4.4 miR-155对CEFs应答REV感染的调控机制 |
| 5 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间发表的学术论文 |
（6）鸡传染性腺胃炎相关病毒-圆圈病毒3型的分离鉴定及致病机制研究（论文提纲范文）
| 符号说明 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 1 前言 |
| 1.1 概述 |
| 1.2 腺胃炎流行病学 |
| 1.2.1 发生和分布 |
| 1.2.2 流行特点 |
| 1.3 腺胃炎病理变化 |
| 1.3.1 临床症状 |
| 1.3.2 剖检病变 |
| 1.3.3 组织学病变 |
| 1.4 腺胃炎致病因素研究进展 |
| 1.4.1 非传染性因素 |
| 1.4.2 传染性因素 |
| 1.4.3 多因素协同 |
| 1.5 高通量测序在未知病毒鉴定上的应用 |
| 1.5.1 高通量测序技术的发展 |
| 1.5.2 二代测序平台 |
| 1.5.3 三代测序平台 |
| 1.5.4 高通量测序鉴定未知病毒 |
| 1.6 GyV3病原学特征 |
| 1.6.1 圆圈病毒属概述 |
| 1.6.2 Gyrovirus3(GyV3)研究概述 |
| 1.7 免疫共沉淀联合质谱分析技术鉴定互作蛋白 |
| 1.7.1 信号转导和转录激活子(Signal transducers and activators of transcription,STAT) |
| 1.7.2 酪蛋白激酶(casein kinase，CK) |
| 1.7.3 胱天蛋白酶募集域蛋白9(casein kinase，CARD9) |
| 1.7.4 T细胞受体(T Cell Receptor，TCR) |
| 1.8 研究目的及意义 |
| 2 实验材料及方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验动物,鸡胚 |
| 2.1.2 引物合成 |
| 2.1.3 主要试剂和试剂盒 |
| 2.1.4 主要缓冲液及试剂配制 |
| 2.1.5 主要仪器设备 |
| 2.1.6 分子生物学分析软件 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 流行病学调查 |
| 2.2.1.1 病料采集 |
| 2.2.1.2 大体剖检诊断 |
| 2.2.1.3 病理组织学诊断 |
| 2.2.1.4 PCR诊断 |
| 2.2.2 未知病毒单感染病例筛选 |
| 2.2.3 未知病毒单感染病例复制动物疾病模型 |
| 2.2.3.1 病料处理 |
| 2.2.3.2 回归动物 |
| 2.2.3.3 大体剖检病变观察 |
| 2.2.3.4 病理组织学病变观察 |
| 2.2.3.5 PCR诊断 |
| 2.2.4 未知病毒鉴定 |
| 2.2.4.1 电子显微镜观察 |
| 2.2.4.2 高通量测序上机样品处理 |
| 2.2.4.3 PacBio三代测序平台高通量病毒宏基因组测序 |
| 2.2.4.4 病毒宏基因组测序数据分析 |
| 2.2.4.5 Inverse PCR扩增病毒全长序列 |
| 2.2.4.6 GyV3基因结构预测及序列同源性比对分析 |
| 2.2.4.7 GyV3全基因组进化树分析 |
| 2.2.5 GyV3回顾性流行病学调查 |
| 2.2.6 GyV3培养 |
| 2.2.6.1 原代鸡胚腺胃细胞制作 |
| 2.2.6.2 接种GyV3 |
| 2.2.6.3 电子显微镜观察病毒粒子 |
| 2.2.6.4 PCR检测已知TVP相关病毒 |
| 2.2.7 GyV3致病特征 |
| 2.2.7.1 纯培养GyV3对SPF鸡致病性实验 |
| 2.2.7.2 GyV3不同接种方式对SPF鸡致病性实验 |
| 2.2.7.3 GyV3对不同日龄SPF鸡致病性实验 |
| 2.2.8 GyV3在鸡体内各器官的分布 |
| 2.2.8.1 构建绝对荧光定量标准曲线 |
| 2.2.8.2 组织DNA的提取 |
| 2.2.8.3 荧光定量PCR检测各器官病毒载量 |
| 2.2.9 初步筛选GyV3衣壳蛋白VP1 相互作用蛋白 |
| 2.2.9.1 构建真核表达载体 |
| 2.2.9.2 CEF细胞真核表达 |
| 2.2.9.3 免疫共沉淀 |
| 2.2.9.4 质谱分析 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 流行病学调查结果 |
| 3.1.1 大体剖检病变类型 |
| 3.1.2 病理组织学病变类型 |
| 3.1.3 病原检测结果 |
| 3.2 筛选未知病毒单感染病例 |
| 3.2.1 已知腺胃炎相关病毒PCR检测 |
| 3.2.2 临床、大体及剖检病变 |
| 3.3 未知病毒单感染TVP动物疾病模型 |
| 3.3.1 回归动物临床、大体及剖检病变 |
| 3.3.2 回归动物病理组织学变化进程 |
| 3.3.3 PCR检测排除已知TVP相关病毒感染 |
| 3.4 未知病毒鉴定结果 |
| 3.4.1 电子显微镜观察病毒形态 |
| 3.4.2 病毒宏基因组测序数据分析结果 |
| 3.4.3 GyV3全长序列扩增结果 |
| 3.4.4 GyV3基因结构预测结果 |
| 3.4.5 GyV3同源性比对结果 |
| 3.4.6 GyV3基因结构比对结果 |
| 3.4.7 GyV3全基因组进化树分析结果 |
| 3.5 GyV3回顾性流行病学调查结果 |
| 3.6 GyV3在原代鸡胚腺胃细胞上纯培养 |
| 3.7 GyV3致病特征 |
| 3.7.1 纯培养GyV3回归动物致病特征 |
| 3.7.2 GyV3不同接种方式对SPF鸡致病性结果 |
| 3.7.3 GyV3对不同日龄SPF鸡致病性结果 |
| 3.8 GyV3在鸡体内各器官的分布 |
| 3.8.1 绝对荧光标准曲线构建结果 |
| 3.8.2 荧光定量PCR检测各器官病毒载量结果 |
| 3.9 Co-IP筛选GyV3衣壳蛋白VP1 相互作用蛋白 |
| 3.9.1 flag-VP1 基因扩增结果 |
| 3.9.2 T-flag-VP1 载体和pcDNA3.1(+)载体双酶切结果 |
| 3.9.3 pcDNA3.1(+)-flag-VP1 重组载体测序结果 |
| 3.9.4 pcDNA3.1(+)-flag-VP1 重组载体测序结果 |
| 3.9.5 免疫共沉淀后上清SDS-PAGE结果 |
| 3.9.6 质谱分析结果 |
| 4 讨论 |
| 4.1 流行病学调查和单感染 TVP 疾病模型建立 |
| 4.2 PacBio 三代宏病毒测序鉴定未知病毒 |
| 4.3 GyV3发病规律及致病机理 |
| 4.4 GyV3衣壳蛋白VP1 互作蛋白筛选 |
| 5 结论 |
| 6 参考文献 |
| 7 致谢 |
| 8 附录 |
| 1.GyV3-SDAU-1 株全基因组序列 |
| 2.pcDNA3.1(+)-flag-VP1 重组载体序列 |
| 9 个人简历 |
（7）J亚群禽白血病病毒与禽网状内皮组织增生症病毒Exosome途径协同感染机制（论文提纲范文）
| 符号说明 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 1 前言 |
| 1.1 ALV-J概述 |
| 1.1.1 ALV-J的发现 |
| 1.1.2 ALV-J的病毒结构特征 |
| 1.1.3 ALV-J的致病性及其对生产的影响 |
| 1.2 REV概述 |
| 1.2.1 REV的发现 |
| 1.2.2 REV的病毒结构特征 |
| 1.2.3 REV的致病性及其对生产的影响 |
| 1.3 ALV-J与REV田间共感染及协同致病现象 |
| 1.4 ALV-J与REV协同感染机制研究现状 |
| 1.5 Exosome概述 |
| 1.5.1 Exosome的起源 |
| 1.5.2 Exosome的成分及其生物学功能 |
| 1.5.3 Exosome与病毒 |
| 1.6 T淋巴细胞的分类及功能 |
| 1.6.1 T淋巴细胞亚群的分类及功能 |
| 1.6.2 CD4~+、CD8~+T细胞 |
| 1.7 IL的分类及功能 |
| 1.7.1 IL-2 的功能 |
| 1.7.2 IL-10 的功能 |
| 1.7.3 IL-12 的功能 |
| 1.8 本课题的研究目的和意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验动物、细胞及病毒 |
| 2.1.2 抗体 |
| 2.1.3 主要试剂 |
| 2.1.4 试验仪器 |
| 2.1.5 实验地点 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 CEF细胞培养 |
| 2.2.1.1 原代CEF细胞制备 |
| 2.2.1.2 病毒感做及细胞培养 |
| 2.2.2 病毒感染情况检测 |
| 2.2.2.1 CEF细胞总DNA提取 |
| 2.2.2.2 ALV-J gp85和REV LTR序列目的片段扩增 |
| 2.2.2.3 间接免疫荧光反应 |
| 2.2.2.4 细胞上清p27检测 |
| 2.2.3 Real-time PCR检测ALV-J和REV的相对表达量 |
| 2.2.3.1 细胞总RNA提取 |
| 2.2.3.2 RNA逆转录为c DNA |
| 2.2.3.3 Real-time PCR |
| 2.2.4 激光扫描共聚焦检测ALV-J和REV蛋白表达 |
| 2.2.5 脾脏白细胞的分离培养 |
| 2.2.6 流式细胞术分析脾脏CD4~+、CD8~+T细胞表达 |
| 2.2.7 ELISA检测IL-2、IL-10、IL-12 的分泌情况 |
| 2.2.8 Exosomes的提取 |
| 2.2.9 负染电镜观察exosome形态 |
| 2.2.10 Western-blot验证exosomes |
| 2.2.10.1 Exosomes蛋白浓度检测 |
| 2.2.10.2 Western Blot实验 |
| 2.2.11 i TRAQ质谱定量实验 |
| 2.2.11.1 i TRAQ肽段标记 |
| 2.2.11.2 肽段分级 |
| 2.2.11.3 液相色谱（LC）-电喷雾电离（ESI）串联存储（MS/MS）质谱分析(LC-MS/MS) |
| 2.2.11.4 序列数据库查询及数据分析 |
| 2.2.12 Exosome RNA的提取 |
| 2.2.13 Exosomes micro RNA表达谱分析 |
| 2.2.13.1 Exosomes RNA样本检测 |
| 2.2.13.2 文库构建和上机测序 |
| 2.2.13.3 micro RNA信息分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 病毒感作实验结果 |
| 3.1.1 PCR检测ALV-J、REV感染情况 |
| 3.1.2 IFA检测ALV-J、REV感染情况 |
| 3.1.3 p27检测ALV-J感染情况 |
| 3.2 Real-time PCR检测ALV-J和REV的细胞内转录水平 |
| 3.2.1 ALV-J细胞内转录水平 |
| 3.2.2 REV细胞内转录水平 |
| 3.3 激光共聚焦实验检测ALV-J和REV的蛋白表达水平 |
| 3.4 脾脏CD4~+、CD8~+T细胞表达结果 |
| 3.5 IL-2、IL-10、IL-12 分泌情况 |
| 3.6 负染电镜观察exosome |
| 3.7 Western Blot检测exosome标志性蛋白 |
| 3.7.1 BCA法测定exosome蛋白浓度 |
| 3.7.2 Western Blot检测exosome标志性蛋白Hsp70 |
| 3.8 i TRAQ蛋白质组学分析 |
| 3.8.1 蛋白质鉴定和定量结果 |
| 3.8.2 差异蛋白质分析及筛选 |
| 3.9 micro RNA表达谱分析 |
| 3.9.1 Exosome RNA样品检测 |
| 3.9.2 差异mi RNA分析及筛选 |
| 3.10 ALV-J与REV协同通路分析 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 6 参考文献 |
| 7 附录 |
| 8 致谢 |
| 9 攻读学位期间发表论文情况 |
（8）鸡三种免疫抑制病基因芯片检测方法的建立（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 中英文缩略词表 |
| 第一章 综述 |
| 1 鸡传染性贫血病 |
| 1.1 病原学 |
| 1.2 流行病学 |
| 1.3 诊断方法和防制措施 |
| 2 禽网状内皮组织增殖病 |
| 2.1 病原学 |
| 2.2 流行病学 |
| 2.3 诊断方法与防制措施 |
| 3 禽白血病 |
| 3.1 病原学 |
| 3.2 流行病学 |
| 3.3 诊断方法与防制措施 |
| 4 基因芯片技术 |
| 4.1 基因芯片 |
| 4.2 基因芯片的原理 |
| 4.3 基因芯片的制备 |
| 4.4. 基因芯片在生物领域中的应用 |
| 5 本研究的目的与意义 |
| 6 技术路线 |
| 第二章 禽三种免疫抑制病基因诊断芯片的探针设计 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 三种免疫抑制病病毒保守序列的选取 |
| 1.3 禽白血病病毒 A、C、D 亚群多变区的选取 |
| 1.4 寡核苷酸探针的设计原则 |
| 1.5 三种免疫抑制病病毒寡核苷酸探针的设计 |
| 2 三种免疫抑制病探针设计结果 |
| 3 讨论 |
| 第三章 多重 PCR 反应体系和程序的建立 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 待测样品及寄主细胞 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要仪器 |
| 1.4 鸡传染性贫血病病毒 CUX、BJ0924 毒株 DNA 模板的制备 |
| 1.5 A 亚群 RAV-1 毒株 DNA 模板的制备 |
| 1.6 参考毒株的选取 |
| 1.7 其余参考毒株的 cDNA 模板的制备 |
| 1.8 多重 PCR 引物的设计 |
| 1.9 多重 PCR 体系和程序的建立及优化 |
| 2 结果 |
| 2.1 多重 PCR 引物设计结果 |
| 2.2 多重 PCR 扩增体系和程序优化结果 |
| 3 讨论 |
| 第四章 三种免疫抑制病基因诊断芯片的研制 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 主要试剂 |
| 1.2 主要仪器 |
| 1.3 实验材料 |
| 1.4 基因芯片的制备 |
| 1.5 基因芯片杂交与检测 |
| 1.6 特异性实验 |
| 1.7 灵敏性实验 |
| 1.8 临床样品检测 |
| 2 结果 |
| 2.1 芯片检测多重 PCR 产物实验结果 |
| 2.2 芯片特异性实验结果 |
| 2.4 灵敏性实验结果 |
| 2.5 芯片临床样品检测结果 |
| 3 讨论 |
| 第五章 禽白血病基因芯片检测临床样品的比较研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 主要试剂 |
| 1.2 主要仪器 |
| 1.3 实验材料 |
| 1.4 样品采集与制备 |
| 1.5 多重 PCR |
| 1.6 禽白血病基因芯片的制备 |
| 1.7 禽白血病基因分型芯片杂交与检测 |
| 1.8 禽白血病抗体试剂盒检测 |
| 1.9 数据分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 禽白血病基因芯片检测结果 |
| 2.2 蛋清和泄殖腔棉拭子 ELISA 检测结果 |
| 2.3 血清 ELISA 检测结果 |
| 2.4 禽白血病基因芯片检测全血和 ELISA 方法检测血清的结果比较 |
| 2.5 禽白血病基因芯片检测全血和 ELISA 方法检测蛋清的结果比较 |
| 3 讨论 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 硕士期间取得的成果 |
| 致谢 |
| 本研究资助项目 |
（9）东北地区野生鸟类主要禽免疫抑制病病原感染情况调查及与REV PR相互作用宿主蛋白的筛选（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 绪论 |
| 1.1 课题背景 |
| 1.2 REV病原学、分子病毒学及流行情况 |
| 1.2.1 病原学 |
| 1.2.2 基因结构及编码蛋白 |
| 1.2.3 流行病学 |
| 1.2.4 REV的危害 |
| 1.3 ALV-J病原学、分子病毒学及流行情况 |
| 1.3.1 ALV病毒亚型分类 |
| 1.3.2 ALV-J基因结构及编码蛋白 |
| 1.3.3 ALV-J流行病学研究 |
| 1.4 野鸟在动物病毒传播中的作用及意义 |
| 1.5 蛋白相互作用研究方法 |
| 1.5.1 酵母双杂交技术 |
| 1.5.2 噬菌体展示技术 |
| 1.5.3 免疫共沉淀技术 |
| 1.5.4 Pulldown 技术 |
| 1.5.5 荧光共振能量转移 |
| 1.6 Snapin蛋白研究概况 |
| 1.7 本研究的目的和意义 |
| 2 东北地区野生鸟类禽免疫抑制病病原感染情况调查 |
| 2.1 实验材料和实验仪器 |
| 2.1.1 病料、病毒和细胞 |
| 2.1.2 菌株、载体 |
| 2.1.3 主要试剂及试剂盒 |
| 2.1.4 实验仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 样品采集及处理 |
| 2.2.2 病毒基因组DNA和RNA提取 |
| 2.2.3 禽免疫抑制病病原的特异性PCR检测 |
| 2.2.4 野鸟源REV分离及gp90基因遗传演化分析 |
| 2.2.5 野鸟源ALV-J分离及gp85基因遗传演化分析 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 禽免疫抑制病病原PCR检测结果 |
| 2.3.2 野鸟源REV分离鉴定 |
| 2.3.3 野鸟源REV gp90基因序列分析及遗传演化分析 |
| 2.3.4 DBYR1102全基因组克隆及序列分析 |
| 2.3.5 野鸟源ALV-J分离鉴定 |
| 2.4 讨论 |
| 3 REV p30蛋白的表达纯化及ELISA检测方法的初步建立 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 病毒株、质粒、菌株和实验动物 |
| 3.1.2 主要试剂及仪器 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 引物设计 |
| 3.2.2 DNA的提取及p30基因的扩增 |
| 3.2.3 重组表达质粒的构建与鉴定 |
| 3.2.4 重组蛋白的诱导表达与鉴定 |
| 3.2.5 重组蛋白的纯化与浓缩 |
| 3.2.6 融合蛋白的Western blot鉴定 |
| 3.2.7 抗REV-p30基因多克隆抗体的制备及生物学活性检测 |
| 3.2.8 间接ELISA检测方法的初步建立 |
| 3.2.9 间接ELISA检测方法的初步应用 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 REVp30蛋白的原核表达及蛋白纯化 |
| 3.3.2 重组p30蛋白的表达与鉴定 |
| 3.3.3 重组蛋白纯化与浓缩 |
| 3.3.4 融合蛋白Western blot鉴定 |
| 3.3.5 多克隆抗体的制备及检测 |
| 3.3.6 融合蛋白的间接ELISA检测结果 |
| 3.4 讨论 |
| 4 酵母双杂交筛选与REV聚合酶PR相互作用的宿主蛋白 |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 毒株、细胞、文库、抗体及质粒 |
| 4.1.2 主要仪器 |
| 4.1.3 主要试剂、耗材 |
| 4.1.4 毒株、细胞、文库、抗体及质粒主要培养基及培养液配制 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 PR 诱饵载体的构建 |
| 4.2.2 pGBK-PR诱饵载体自激活性与毒性检测 |
| 4.2.3 酵母双杂交筛选 |
| 4.2.4 酵母共转化试验 |
| 4.2.5 酵母菌转化 |
| 4.2.6 Snapin真核表达载体构建 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 PR-pGBKT7诱饵质粒的构建 |
| 4.3.2 pGBPR诱饵质粒自激活性与毒性检测 |
| 4.3.3 文库滴度检测 |
| 4.3.4 杂交效率检测 |
| 4.3.5 回转验证实验结果 |
| 4.3.6 Snapin基因的扩增与酶切鉴定 |
| 4.3.7 PR真核表达质粒酶切鉴定 |
| 4.4 讨论 |
| 4.4.1 文库构建与质量鉴定 |
| 4.4.2 诱饵质粒构建与检测 |
| 4.4.3 文库筛选 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
| 致谢 |
（10）蛋种鸡ALV-J与REV共感染病变新特点（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 病例 |
| 1.2 血清学检测 |
| 1.3 病理学检测 |
| 1.3.1 大体病变观察 |
| 1.3.2 病理组织学观察 |
| 1.4 PCR检测 |
| 1.5 PCR扩增产物测序及进化树的分析 |
| 1.6 免疫组织化学检测 |
| 1.7 细胞间接免疫荧光 |
| 2 结 果 |
| 2.1 血清学检测 |
| 2.2 病理学检测 |
| 2.2.1 大体病变观察 |
| 2.2.2 病理组织学观察 |
| 2.3 免疫组织化学检测 |
| 2.4 PCR检测及测序结果 |
| 2.5 细胞间接免疫荧光 |
| 3 讨 论 |
四、从J亚群禽白血病肿瘤中检测出禽网状内皮组织增生症病毒（论文参考文献）
- [1]REV-SNV对SPF雏鸡RLRs信号通路相关MiRNAs及其靶基因表达的影响[D]. 姜皓. 山东农业大学, 2021(01)
- [2]江苏地区家禽4种免疫抑制病病原检测及致瘤病毒三重荧光定量PCR检测方法的建立与应用[D]. 闫彩虹. 扬州大学, 2020(04)
- [3]一株新型E亚群禽白血病病毒的分离与鉴定[D]. 张治国. 山东农业大学, 2020(02)
- [4]三例鸡病毒性传染性腺胃炎病例临床诊断与鉴别分析[D]. 陈志祥. 山东农业大学, 2020(10)
- [5]REV感染对SPF鸡胚成纤维细胞转录后调控的影响[D]. 高畅. 东北农业大学, 2020(04)
- [6]鸡传染性腺胃炎相关病毒-圆圈病毒3型的分离鉴定及致病机制研究[D]. 李根. 山东农业大学, 2019(01)
- [7]J亚群禽白血病病毒与禽网状内皮组织增生症病毒Exosome途径协同感染机制[D]. 庄萍萍. 山东农业大学, 2016(03)
- [8]鸡三种免疫抑制病基因芯片检测方法的建立[D]. 朱瑞豪. 河南科技学院, 2015(07)
- [9]东北地区野生鸟类主要禽免疫抑制病病原感染情况调查及与REV PR相互作用宿主蛋白的筛选[D]. 姜莉莉. 东北林业大学, 2014(02)
- [10]蛋种鸡ALV-J与REV共感染病变新特点[J]. 王玥,姜艳萍,于琳琳,王峰,陈洪博,王晓伟,成子强. 畜牧兽医学报, 2011(11)