一、原核细胞阳性克隆的筛选（论文文献综述）
李志伟,李本杰,刘志兵,林菲,徐汉虹,舒薇[1]（2022）在《基于FRET原理构建AtLHT1转运底物筛选探针》文中研究表明【目的】为提高导向药物筛选通量,加快导向农药分子设计、合成、筛选等研发速度,构建基于拟南芥氨基酸转运蛋白AtLHT1的荧光共振能量转移（Fluorescence resonance energy transfer,FRET）探针作为导向农药筛选平台。【方法】构建CFP-LHT1-YFP的三明治探针,分别在大肠埃希菌Escherichia coli BL21（DE3）原核细胞和BY4741酵母细胞中进行表达、鉴定和纯化。采用荧光酶标仪和激光共聚焦检测FRET效率的变化。【结果】CFPAtLHT1-YFP融合蛋白探针纯化后,分别与供试氨基酸和草甘膦混合,供试氨基酸和草甘膦的加入导致探针蛋白的FRET比率发生明显变化,草甘膦处理使D535nm/D480nm升高7%～12%,其变化趋势与阳性配体甘氨酸和谷氨酸接近,而加入阴性配体精氨酸则没有明显变化。同时,FRET比率呈现底物浓度依赖。样品中分别加入1、5和30 mmol/L的草甘膦溶液,20 min后检测到D535nm/D480nm分别升高3%、1%和13%,阳性配体也存在FRET比率随着底物浓度上升而升高的趋势,而阴性配体变化不规则。利用光漂白法检测到氨基酸或草甘膦处理后单个酵母细胞的FRET效率发生明显变化。加入阳性对照的甘氨酸和谷氨酸后,FRET效率变化明显,其中,甘氨酸和谷氨酸的FRET效率分别达到30%和26%;加入草甘膦处理的FRET效率与谷氨酸接近,达26%;含PBS的空白对照组没有明显的FRET效率变化。【结论】AtLHT1-FRET探针可以与中性氨基酸甘氨酸和酸性氨基酸谷氨酸结合,但不结合碱性氨基酸精氨酸;FRET效率因不同底物有所差异,且具有一定的底物浓度依赖性;同时,证明了草甘膦能够被氨基酸转运蛋白AtLHT1转运。
成赢[2]（2020）在《三特异性抗体构建及其对NK细胞抗肿瘤作用研究》文中进行了进一步梳理随着蛋白质化学技术的突破性进展,双/多特异性抗体的构建方法和表达技术不断创新。目前绝大多数双/多特异性抗体是靶向T细胞并强化T细胞功能为原理设计的,已经进入临床试验和临床实用的产品展示出诱人前景。NK细胞是机体T细胞之外抗肿瘤的二大利器之一,本身具有广谱的肿瘤杀伤能力,尤其在对抗冷肿瘤时展现出独到的优势,近期被广泛关注。同时,NK细胞具有强大的增强T细胞抗肿瘤免疫应答的能力,是T细胞发挥抗肿瘤的功能基础。由于NK细胞在体内存活时间较短,极大地限制了它在免疫治疗中的作用。我们构建了三特异性抗体用于再导向NK细胞,以此来研究它对NK细胞抗肿瘤作用的增强效应。1、双/三特异性抗体构建、表达与鉴定我们设计并构建了三特异性抗体161519,它是由一段抗人CD16单链抗体、修饰人IL-15细胞因子和抗人CD19单链抗体组成。通过原核表达载体进行诱导表达,之后通过包涵体变、复性获得了可溶形式的蛋白,利用SDS-PAGE和质谱鉴定了纯度和精确分子量。我们也将161519分子构建到真核表达载体,通过CHO细胞表达并利用亲和层析纯化获得了纯度较高的蛋白。作为对照,我们也设计了双特异性抗体1619（在161519分子基础上去掉了 IL-15片段）,利用原核表达系统和真核表达系统来表达并纯化获得了纯度较高的可溶蛋白。2、三特异性抗体促进NK细胞与CD19+肿瘤细胞交联为了研究161519抗体与对应靶细胞的特异结合活性,我们通过流式细胞术观察到它可以分别与NK细胞或CD19+肿瘤细胞特异结合。进一步利用细胞交联实验（conjugation）,我们采用流式细胞术和免疫荧光成像技术,发现161519抗体可以促进NK细胞与CD19+肿瘤细胞的特异交联。3、三特异性抗体促进NK细胞活化和增殖通过NK细胞与CD19+肿瘤细胞共孵育,我们发现161519抗体可以促进NK细胞表达活化相关的分子CD69和与杀伤相关的功能分子TRAIL和granzyme B,同时NK细胞分泌IFN-γ的水平也显着提高,而这一过程并不会激活T细胞应答。更重要的是,相比双特异性抗体1619,三特异性抗体161519促进NK细胞增殖的能力显着更高。4、三特异性抗体提高NK细胞杀伤活性NK细胞对靶细胞的直接杀伤活性是检验NK细胞功能的一个重要指标。结果显示,161519抗体可以显着提高NK细胞对CD19+肿瘤细胞的杀伤能力,而对CD19-肿瘤细胞则无明显影响。我们进一步将161519抗体与NK细胞预孵育（Arming）,发现这种负载161519抗体的NK细胞具备更强的针对CD19+肿瘤细胞的杀伤能力,证实其可以特异提高NK细胞杀伤活性。5、真核细胞表达的三特异性抗体具有更强的生物学功能我们对比了真核细胞表达系统或原核细胞表达系统生产的三特异性抗体的差异。我们观察到真核细胞表达系统生产的161519抗体比原核细胞系统表达的抗体具有显着的高杀伤活性,展现出远低于原核161519抗体的响应剂量。同时,真核161519具有更强的促进NK细胞活化和增殖的能力。6、三特异性抗体在体内可以减缓肿瘤生长并延长生存期为了评估161519抗体的体内抗肿瘤效应,我们构建了人源化小鼠模型。结果发现161519抗体可以显着减缓人CD19+肿瘤细胞在免疫缺陷小鼠体内的生长,并显着延长小鼠生存期。我们观察到,1619抗体单用没有明显治疗作用,与IL-2联合治疗后可取得疗效,可以延长小鼠生存期。而161519抗体单用则可以显着抑制小鼠体内肿瘤生长,不需要联合使用IL-2。以上结果提示IL-2在161519抗体治疗中并非必需,而1619抗体的体内疗效则依赖IL-2存在。
于淑惠[3]（2020）在《顺式肽键发生机制及其模式蛋白功能效应研究》文中提出蛋白质主骨架链中,由于肽键-CO-NH-被认为具有部分刚性的性质,不能自由旋转,迫使以肽键为旋转轴的二面角（ω）只能在0°或者180°的附近转动。ω为0°时被称为顺式肽键,而当ω为180°时称为反式肽键。反式肽键的构象相对稳定,而顺式肽键的构象相对不稳定,因而一般情况下蛋白质主骨架上肽键都呈反式构象,而顺式肽键发生频率较低。任意两个氨基酸形成的肽键的反式肽键与顺式肽键之间的转换（肽键顺反异构）有着确定的顺式肽键发生频率（ICPB）,蛋白质构象和功能与ICPB值相关。氨基酸替换突变会导致蛋白质分子局部位点的ICPB值改变,从而导致生物体内相应的蛋白质构象与功能改变。因此,探讨蛋白质主链骨架上不同肽键ICPB发生与分布的规律,对揭示蛋白质结构与功能之间的关系具有重要的意义。通常情况下ICPB值不大,而肽键异构化又是一个动态变化过程,用X-射线衍射晶体技术、核磁共振、扫描三维电镜等传统方法很难捕捉到顺式肽键的构象。因此,本论文首先从理论上推导出了蛋白质主骨架上肽键扭转角（ω）与相邻α碳原子之间距离（d）的函数关系。利用PDB数据库建立非冗余数据集,从中提取其顺式肽键数据,统计出不同肽键的ICPB值并总结出不同氨基酸残基ICPB的规律。然后,利用分子模拟的方法创建了20种二肽的分子结构模型,动力学模拟了肽键的顺反异构过程中的自由能的变化,分析了其与各自的ICPB之间的变化规律。最后,以β-catenin作为模式蛋白,通过点突变方法构建不同ICPB值的β-catenin（Xaa246-P247）表达载体,并将这些载体导入到Pin1表达阳性的肝癌细胞株（hep G2）中,观测不同β-catenin（Xaa246-P247）分子与APC、E-cadherin之间的相互作用,以及不同β-catenin（Xaa246-P247）分子在hep G2中的亚定位水平,探讨β-catenin（Xaa246-P247）位点ICPB值与β-catenin亚细胞定位之间的效应关系。获得的主要研究结果如下:（1）在我们的数据集中,顺式肽键占肽键总数的0.33%,顺式肽键多出现在与脯氨酸（proline,P）相关联的肽键上,其中Xaa-P顺式肽键占总顺式肽键数的73%;不同Xaa种类对Xaa-P顺式肽键发生率的影响不同,当Xaa为酪氨酸（Y）、色氨酸（W）等芳香族氨基酸时,Xaa-P具有相对较高的ICPB值。当Xaa为亮氨酸（L）、甲硫氨酸（M）等残基时,ICPB值相对较低;除了很少一部分的顺式肽键分布在脯氨酸-色氨酸、色氨酸-丙氨酸、半胱氨酸-半胱氨酸、甘氨酸-甘氨酸的残基片段上之外,顺式肽键在一般情况下很少出现在与脯氨酸无关的肽键（Xaa-Xn P）上;从顺式肽键发生的部位来看,一般发生在蛋白质二级结构的柔性区域中,即α-螺旋C端,β-折叠的N端和无规则卷曲。（2）20种肽键基本都在反式情况下取得最小自由能,处于稳定状态,二面角在区间[-180°,-170°]或者[170°,180°]。自由能的最小值大多数分布在区间[0,17]kcal/mol。顺式肽键的自由能最小值的二面角大多分布在区间[10°,25°],对应的自由能值[1,49]kcal/mol。总体顺式肽键的自由能值大于反式肽键的自由能值。20种肽键的能量峰值多出现在二面角为[-110°,-60°]区间和[80°,110°]区间,对应的自由能值多分布在区间[25,55]kcal/mol和[20,40]kcal/mol。特别的是,E-P,P-P,N-P,Q-P的自由能差距比较大。从分子模拟的结果来看,肽键的ICPB值与其顺反异构构型能差和能垒都有关,是氨基酸残基结构,带电性,极性等共同作用的结果。ICPB值就反映了这些因素共同作用的结果。（3）我们实验结果表明β-catenin分子上Xaa246-P247的ICPB值改变是改变β-catenin/APC、β-catenin/E-cadherin之间相互作用的原因,并最终影响β-catenin分子在hep G2中的亚细胞定位。在hep G2细胞（真核细胞）中,β-catenin分子上Xaa246-P247位点的ICPB值与β-catenin的亚细胞定位之间,存在着一定的效应关系。本研究结果对揭示蛋白质肽键顺反异构规律及其对生命活动的调节具有重要的意义。此外,由于蛋白质的折叠与去折叠过程也与肽键顺反异构有关,因而利用ICPB规律还可以预测蛋白质结构,指导新功能蛋白质合成及多肽类新药的设计。
何春兰[4]（2019）在《水稻RF6的表达纯化及其互作蛋白OsHXK6的结构研究》文中指出细胞质雄性不育（cytoplasmic male sterility,CMS）是指雄蕊发育异常,不能产生正常的雄性配子,而雌蕊发育正常能够接受正常花粉而受精结实的一种自然现象,植物界中普遍存在。CMS的育性可以被核基因组中的恢复基因（restorer of fertility,Rf）恢复。红莲型细胞质雄性不育（HL-CMS）属于配子体不育,其不育性可被两个恢复基因Rf5和Rf6分别独立恢复,它们均属于PPR基因家族。Rf6编码一个含894个氨基酸的P家族PPR（pentatricopeptide repeat protein）蛋白,一共含有20个PPR基序,并且PPR基序3,4,5以一个单元的形式在原位重复了一次。而其等位基因rf6的PPR基序3,4,5却未发生重复,丧失了恢复不育性的分子生物学功能。研究表明,这三个重复的PPR基序对于HL-CMS的育性恢复至关重要。由此推测,RF6和rf6两者在结构上势必有很大的差异。同时,研究表明,水稻己糖激酶6（OsHXK6）为HL-CMS的育性恢复复合体成员之一,能够在体内外与RF6互作。除此之外,己糖激酶（HXK）本身是一类多功能蛋白,是植物中唯一能将葡萄糖磷酸化的酶,影响植物从种子萌发到衰老的整个生命过程。本论文从结构生物学入手,试图为HL-CMS的育性恢复机理研究和植物己糖激酶的催化机制提供分子基础。主要研究结果如下:1.利用一步PCR定点突变技术将RF6中的33个半胱氨酸逐个地全部突变为丝氨酸,然后在此基础上对RF6的两端进行了8种方式的序列改造,以期改善其表达和纯化效果。结果表明,RF6的两端序列对其表达和纯化具有很大的影响,一些改造后的RF6在表达和纯化上得到了明显的改善,特别是第二种改造方式,我们将其重新命名为RF6-2。最终,我们将RF6-2在大肠杆菌和真核细胞SF9中进行大量表达,然后纯化出了纯度较高的GST-RF6-2蛋白,并将其进行了初步的晶体筛选。同时,将纯化的蛋白应用到HL-CMS育性恢复机理的功能研究中。我们探索出的改造和纯化RF6的方法可以为其他PPR蛋白的表达纯化提供新思路。2.在大肠杆菌中成功表达OsHXK6（27-506）蛋白,并且纯化出了大量高纯度且构象均一的OsHXK6蛋白。经过晶体筛选和优化,得到了形状好且体积大的晶体,但是在X-射线晶体衍射收集的数据中,晶体分辨率都在3.5?以上。我们根据预测的二级结构设计了OsHXK6截断体（35-506aa）,将N端的无规卷曲去掉,最终得到了3.0?以下的晶体衍射数据。说明蛋白质两端的序列可能对蛋白晶体的生长和质量有很大的影响。同时,我们将OsHXK6截断体与底物葡萄糖和ATP进行共结晶,最终成功解析了OsHXK6截断体及其与不同底物结合的晶体复合物。它们分别是OsHXK6-apo,OsHXK6-Glc,OsHXK6-ADP-PO4-Mg2+和OsHXK6-Glc-ADP-PO4-Mg2+。3.对解析的四个晶体结构分析发现,除了不加任何底物的OsHXK6-apo构象为“开放”状态,其余三个复合物均为“闭合”状态,且结构几乎完全相同。OsHXK6-Glc的结构证明OsHXK6与其它己糖激酶一样,与葡萄糖的结合采取经典的“底物-契合”模型。OsHXK6-ADP-PO4-Mg2+复合物是我们首次捕捉到的己糖激酶催化葡萄糖磷酸化过程的一种中间状态。这个复合物证明,与水解状态ATP结合的己糖激酶呈“闭合”状态,说明ADP-PO4的结合能使己糖激酶的构象发生变化。将它与OsHXK6-Glc的结构进行重叠后发现,两者的结构几乎完全一样。这个结果说明ADP-PO4引起己糖激酶构象发生变化的机制与葡萄糖相同。4.两个与ADP-PO4结合的结构首次揭示了植物己糖激酶与ADP-PO4的结合模式。ADP的腺嘌呤与Ser369形成氢键;核糖与Leu452和Thr261通过氢键结合;α-PO4与Gly451和Asn114形成氢键;β-PO4和Gly112,Thr113,Thr261通过氢键结合;γ-PO4与Asp109,Asp449,Asp486和Ser488形成氢键。定点突变和体外酶活实验证明,Gly112,Thr261,Gly262和Gly450这四个位点对于维持OsHXK6与ADP-PO4的结合至关重要。5.通过分析水稻,玉米和拟南芥中所有己糖激酶的序列比对结果发现,它们与底物结合的位点具有高保守性。而且在分析其中8个天然无催化活性的己糖激酶时发现,这8个己糖激酶的某些底物结合位点发生了突变。特别是在Thr261位点,有6个己糖激酶在此位点发生了突变,暗示着这个位点对于维持ATP与己糖激酶的结合很重要。我们猜测这些底物结合位点的突变是引起己糖激酶失活的原因之一。将解析的OsHXK6-Glc-ADP-PO4-Mg2+复合物与人和细菌的己糖激酶-ADP/AMP-PNP进行比较发现,己糖激酶与ATP的结合在细菌,植物和人中具有高度保守性。
刘鸿博[5]（2019）在《利用温和噬菌体载体递呈CRISPR-Cas9系统靶向清除细菌耐药性的研究》文中研究表明研究背景:近些年来,泛耐药菌和多重耐药菌的检出率不断上升,针对一线抗生素的耐药率逐渐升高。特别是随着超级耐药菌的出现,抗感染治疗面临无药可用的局面。细菌耐药性的快速流行已成为一个亟待解决的全球性卫生问题。耐药基因往往定位于细菌质粒,具备极强的跨菌种水平转移能力。目前针对泛耐药菌和超级耐药菌的治疗方式及其有限,尚无有效的技术手段阻断耐药性的扩散转移。耐药菌感染治疗、防控等领域亟需新技术和新策略。CRISPR-Cas9基因编辑技术来源于细菌的特异性免疫机制CRISPR系统,能够对目的DNA实现序列特异性的剪切。近年来已有研究报道将CRISPR系统包装至温和噬菌体中,通过噬菌体递呈CRISPR系统,致死性地剪切细菌靶基因。这些研究提供了利用CRISPR工具对抗耐药菌的思路,但还遗留很多缺陷。首先,之前的研究主要通过温和噬菌体递呈CRISPR靶向细菌染色体的策略进行杀菌,缺少靶向质粒策略抗耐药菌效果的深入分析,尤其缺少体内实验数据。其次,当前研究显示的噬菌体递呈CRISPR技术杀菌效力有限,远远低于传统的烈性噬菌体杀菌技术,达不到实用水平。另外,噬菌体包装技术需要改进以避免抗性筛选标记被引入包装后的噬菌体基因组,并提高包装噬菌体的效率和对新噬菌体的适用性。最后,以往研究只评价了12天内包装CRISPR-Cas噬菌体的抗菌能力,还需要在更长的观测时间里进行持续观测和分析。研究目的:细菌耐药性主要由耐药质粒进行介导和传播。利用原核CRISPR-Cas9基因编辑技术清除细菌耐药质粒,能够恢复抗生素的杀菌效力,并阻断细菌耐药性的传播。利用更加高效的原核载体技术,携带靶向细菌耐药质粒的CRISPR-Cas9系统更加高效的向耐药菌递呈,将大大增加该系统在抗耐药菌领域的实际应用潜力。本研究将建立CRISPR-Cas9高效清除细菌耐药性技术。设计并构建特异性CRISPR-Cas9系统来分析靶向清除NDM-1耐药质粒的效果。在此基础上,我们利用温和噬菌体作为CRISPR-Cas9系统的高效递呈载体。通过研发新型温和噬菌体包装CRISPR-Cas9技术,实现CRISPR系统的“一步法”包装,探索从温和噬菌体分离到完成包装的技术流程。利用噬菌体递呈CRISPR-Cas9系统,在一系列的体内外实验中检验细菌耐药性的清除效率,并分析联合抗生素抗耐药菌策略。通过持续监测对耐药菌生长的抑制效果,分析噬菌体递呈CRISPR-Cas9抗菌策略是否能避免新的细菌耐受突变的产生,是否具有比烈性噬菌体直接杀菌策略更加持久的抑菌效力。研究方法:建立针对超级耐药基因blaNDM-1的CRISPR-Cas9靶点spacer文库,构建靶向NDM-1质粒的CRISPR-Cas9系统质粒。构建携带NDM-1质粒的耐药大肠杆菌模型,采用定量PCR及荧光信号检测等方法分析CRISPR-Cas9系统清除NDM-1质粒的效率,药敏实验检验耐药质粒清除后细菌耐药表型的变化。通过上述实验验证CRISPR-Cas9系统高效清除细菌耐药质粒的能力。设计引入抗性筛选的新型重组噬菌体筛选系统,建立“一步法”温和噬菌体整合CRISPR-Cas9技术。采用该包装技术改造一株新分离的大肠杆菌温和噬菌体,使其递呈CRISPR-Cas9系统,并靶向剪切携带blaNDM-1靶点的质粒。利用包装CRISPR-Cas9噬菌体侵染携带靶质粒的大肠杆菌,分析噬菌体递呈的CRISPR-Cas9系统清除细菌耐药性的能力,包括PCR检测靶质粒的清除效果,定量PCR分析靶质粒清除效率,菌落计数法统计耐药细菌的敏感化率。利用包装CRISPR-Cas9噬菌体介入细菌耐药质粒的转化、接合等水平转移途径,评价噬菌体递呈CRISPR-Cas9系统清除细菌耐药质粒在阻断细菌耐药性传播扩散方面的效果。建立温和噬菌体递呈CRISPR-Cas9联合抗生素的抗耐药菌策略,在包括生物膜、小鼠皮肤感染模型、小鼠肠道感染模型等体内外条件下检验该策略的耐药性清除及耐药菌杀灭效力。对联合抗耐药菌策略的杀菌效力进行至少1周时间内的连续监测,观察是否会出现细菌对该策略的耐受突变,并和烈性噬菌体直接杀菌策略的耐受突变相比较。采用全基因组测序分析细菌产生噬菌体耐受突变的机制。研究结果:（1）建立了针对blaNDM-1基因的CRISPR-Cas9系统靶点文库,包含20条特异性spacer序列。构建了靶向剪切blaNDM-1基因的特异性原核CRISPR-Cas9系统质粒。（2）利用CRISPR-Cas9系统清除大肠杆菌的NDM-1质粒,使产NDM-1耐药模式菌变为blaNDM-1阴性,恢复细菌对亚胺培南及其它β-内酰胺类抗生素的敏感性。（3）证明原核CRISPR-Cas9质粒转化耐药菌可以高效清除大肠杆菌中携带的NDM-1质粒。证明无论是天然的NDM-1大质粒还是重组NDM-1高拷贝质粒均可以在12 h内实现大于99%的细胞内清除率。（4）建立了新的噬菌体包装CRISPR-Cas9技术,首次探索完成了大肠杆菌温和噬菌体从分离测序到“一步法”包装CRISPR-Cas9系统的整套技术流程。（5）检验了噬菌体递呈CRISPR-Cas9系统在体外条件下清除靶质粒的效率,发现在8小时内能实现大于99%的耐药质粒清除率。提出利用噬菌体递呈CRISPR-Cas9清除细菌耐药性联合抗生素杀死耐药菌的策略,在体外实验中降低了约106倍的耐药大肠杆菌数量,优于已报道研究中所采用的细菌染色体靶向策略。（6）噬菌体递呈CRISPR-Cas9抗菌技术能够减少细菌耐药质粒在环境中的释放和积累,相比烈性噬菌体在8小时内减少了约98.7%的耐药质粒释放。噬菌体递呈CRISPR-Cas9抗菌技术可阻断耐药质粒在细菌间的接合转移,减少了98%的pNDM-1接合子菌落数量,抑制细菌耐药性的传播扩散。（7）首次在形成生物膜的耐药菌中评价噬菌体递呈CRISPR系统技术,并证明该技术能够在成熟生物膜中清除约50%的耐药质粒,将抗生素的最低生物膜清除浓度降低50%。（8）首次在体内实验中评价CRISPR靶向细菌耐药质粒的策略,噬菌体递呈CRISPR系统能够在小鼠皮肤感染模型和小鼠肠道感染模型中发挥清除细菌耐药质粒的作用并联合抗生素实现105106倍的耐药大肠杆菌数的降低,效果优于已报道的CRISPR靶向细菌染色体策略。（9）在体外条件下进行长时间杀菌效果监测,烈性噬菌体杀菌策略在24小时内快速引发细菌的噬菌体耐受现象。而192小时内未观察到细菌对包装CRISPR-Cas9噬菌体联合抗生素杀菌策略的新耐受现象。体内条件下,在小鼠皮肤和肠道耐药菌感染模型中持续监测该策略,烈性噬菌体策略在2-3天内出现细菌的耐受,而7天内未观察到细菌对包装CRISPR-Cas9噬菌体联合抗生素杀菌策略的耐受。（10）通过对耐受突变株的全基因组测序,揭示大肠杆菌MG1655形成烈性噬菌体vB253耐受的机制是在fepA基因位点出现碱基突变;大肠杆菌MG1655形成卡那霉素耐受的机制是在fusA基因位点出现碱基突变。而噬菌体递呈CRISPR-Cas9系统清除细菌耐药质粒联合抗生素杀菌的策略不会导致细菌出现上述基因突变。研究结论:本研究提出了利用噬菌体递呈CRISPR-Cas9系统清除细菌耐药性的策略。在方法学上新建了温和噬菌体“一步法”包装CRISPR-Cas9系统技术。利用噬菌体递呈CRISPR-Cas9系统高效靶向清除细菌耐药质粒的策略,破坏了介导细菌耐药性的质粒,阻断细菌耐药性的传播,降低菌群环境中的耐药基因水平,具备开发成为细菌耐药性防控新技术的潜力。在耐药菌治疗方面,噬菌体递呈CRISPR-Cas9清除细菌耐药性并联合应用抗生素在体内外一系列实验中实现了强大的杀灭耐药菌能力。该策略不仅解决了由耐药基因介导的细菌耐药性问题,使失效的抗生素疗法重新焕发生机,还避免了杀菌过程中可能出现的耐受突变,有望成为一种有效杀灭耐药菌的新方法,在抗耐药菌领域有巨大的应用潜力。
刘健博[6]（2019）在《人源P53与COP1/DET1复合物表达纯化以及相互作用研究》文中指出肿瘤时刻威胁着人类的生命,寻找治愈肿瘤的方法一直是人类健康科学最重要的研究内容。肿瘤抑癌基因p53在肿瘤的发生、发展和调控中起着异常重要的作用,在许多重要的细胞信号通路中,p53可以激活抑癌基因的表达从而抑制肿瘤的发生,而p53基因的突变、缺失或减少常常导致细胞内信号通路发生紊乱,从而引发细胞生长失控并发生癌变。由于p53基因在肿瘤中具有相当高的突变频率,因此针对p53的靶向研究是治疗肿瘤的重要研究方向。COP1和DET1蛋白于三十多年前首次被人类发现,作为最早的光形态发生抑制因子之一,DET1和COP1复合物是最初在植物中被深入研究的光信号通路关键分子。而在哺乳动物细胞中,人们意外发现COP1可以作为p53泛素化的一种E3泛素连接酶,从而抑制p53的转录激活活性及依赖p53的细胞凋亡,这种COP1介导的p53降解途径主要是维持DNA损伤被修复后p53的稳定和再次激活。同时COP1能够通过与DET1相互作用形成复合物进而催化原癌基因转录因子c-Jun的泛素化降解,此时由于COP1和DET1复合物的形成,COP1并不会表现出E3泛素连接酶的功能,通过复合物的作用一定程度上拮抗c-Jun的致癌活性发挥作用。在本次研究中,我们主要在体外对p53、COP1和DET1蛋白之间可能存在的相互作用进行探究。在本研究中,我们采用了基因工程与蛋白质工程等技术手段,通过细胞培养大量表达人源p53、COP1和DET1蛋白,并使用精细色谱分离纯化得到三种目标蛋白,然后对三者之间的相互作用进行了进一步的研究。首先我们利用原核细胞表达载体pGEX-6P-1,成功构建了人源p53全长蛋白载体质粒,由于p53在细胞核中通常以四聚体形式存在,经分子筛纯化时非常容易出现高聚,所以我们尝试了多种分片段表达方法,针对p53全长、1-104、349-398、98-398等片段,在大肠杆菌BL21中表达,经GST柱及分子筛层析分离纯化相关蛋白片段。在人源COP1、DET1蛋白全长的表达与纯化实验中,我们对COP1和DET1蛋白的表达载体采用真核细胞表达载体,成功构建了COP1和DET1的pcDNA3.1（+）重组表达质粒,利用大肠杆菌感受态细胞DH5α克隆重组质粒,克隆质粒在含有Amp的LB琼脂培养基上进行抗性初步筛选,再转染到HEK293F细胞株中进行表达。通过对转染细胞的培养、传代、收取及后续的精细纯化,我们初步得到了COP1和DET1蛋白,但表达量非常低。在此基础上,我们还通过体外pull-down实验对COP1、DET1和p53蛋白的相互作用进行了进一步的研究。通过本论文的研究,我们成功表达与纯化了人源p53片段蛋白,成功构建了能稳定表达人源COP1、DET1蛋白的HEK293F细胞株,为进一步研究人源COP1、DET1与p53复合物及相互作用打下了良好的基础。
杨赛赛[7]（2019）在《ANKRD22在结直肠癌细胞中表达意义的研究》文中进行了进一步梳理目的:ANKRD22属于锚蛋白（ANK）重复序列家族,具有4个重复的锚蛋白基序,在肺癌、乳腺癌、胰腺癌等多种肿瘤中表达增高,但其功能、分子机制以及与肿瘤发生发展的关系有待进一步深入研究。我们前期研究发现ANKRD22在结直肠癌和结直肠癌干细胞中表达增加,提示ANKRD22可能参与了结直肠癌进展和结直肠癌干细胞特性的调控。本研究通过基因富集分析、制备特异性抗ANKRD22单克隆抗体和免疫组化染色等方法,以进一步了解ANKRD22在结直肠癌中的表达意义,初步探讨其潜在应用价值。方法:首先用基因富集分析（GSEA）方法对GEO数据库的566例结直肠癌组织检测数据进行了ANKRD22 mRNA表达水平与结直肠癌相关临床参数相关性分析;然后以ANKRD22/pCMV6-XL5为模板扩增人ANKRD22基因全长ORF序列,亚克隆至原核细胞表达载体pET-42a（+）中,经测序鉴定后,将重组表达质粒转化Rosetta DE3大肠杆菌,用异丙基硫代-β-D-半乳糖（IPTG）进行诱导表达,细菌裂解上清液过Ni2+柱获得纯化的GST-ANKRD22融合蛋白;用ANKRD22重组蛋白免疫Balb/c小鼠,以制备鼠源性单克隆抗体;最后用免疫组化染色方法检测了包含完整随访资料的112例结直肠癌组织芯片的ANKRD22表达状况,并进行了 ANKRD22表达水平与结直肠癌患者临床病理特征相关性分析。结果:1、GSEA分析发现ANKRD22在结直肠癌中较正常结直肠组织表达水平明显增加;具有较高ANKRD22表达的患者总体生存率和预后均较好;2、通过原核细胞重组表达ANKRD22重组蛋白,经动物免疫、细胞融合和杂交瘤细胞筛选等过程获得了 4株抗人ANKRD22特异性的鼠源性单克隆抗体,通过Westerm blot和抗体特异性阻断实验验证了制备的抗ANKRD22抗体具有较高的特异性;3、通过对组织芯片中的112例结直肠癌组织用抗ANKRD22抗体进行免疫组化染色,结果示52例结直肠癌组织阳性表达ANKRD22,阳性率46.4%（52/112）,ANKRD22表达水平与p53表达和β-catenin表达呈正相关（p均<0.05）。结论:我们利用原核细胞重组表达系统成功表达了 ANKRD22重组蛋白,通过小鼠免疫和杂交瘤筛选获得了 4株特异性的鼠源性抗ANKRD22单克隆抗体;结直肠癌免疫组化染色结果提示ANKRD22功能可能与p53和Wnt/β-catenin通路有关。ANKRD22可能是一个潜在的结直肠癌预后标志。
刘志兵[8]（2018）在《基于FRET技术研究LHT1参与草甘膦的转运》文中提出导向农药是将农药有效成分与导向基团偶联后使其在植物体内具有良好的输导性,且可以在特定部位累积的新型农药。本实验室前期做了大量工作,包括系列糖基、氨基酸为载体的导向农药的合成,杀虫活性评价,输导内吸性评价以及相关转运机理研究。草甘膦（Glyphosate）是一种使用较早的内吸灭生型除草剂,其在植株体内有良好的输导性。草甘膦分子结构中含有一个磷酸基团且已经证明磷酸盐转运蛋白参与了草甘膦的转运;草甘膦分子结构与甘氨酸高度相似,在抗草甘膦杂草中,草甘膦被ABC家族的氨基酸转运蛋白转运至液泡中;草甘膦还可以被哺乳动物上皮组织细胞中氨基酸转运蛋白LAT1转运至动物体内。现已证明拟南芥氨基酸转运蛋白LHT1是根部吸收中性氨基酸和酸性氨基酸的关键转运蛋白,其缺失影响植物对氨基酸的吸收和分布。LHT1还可以转运带有氨基酸结构的甘氨酸甲酯-氯虫苯甲酰胺（CAP-Gly-2）。本论文以拟南芥氨基酸转运蛋白LHT1为主要研究对象,结合荧光共振能量转移（FRET）技术,进一步研究LHT1是否参与草甘膦的转运。首先构建CFP-LHT1-YFP的“三明治”探针,将该探针分别连接到pRSET-A和pDR196载体上,分别在BL21原核细胞和BY4741酵母细胞中表达该探针。将纯化后的原核表达探针蛋白分别与供试氨基酸和草甘膦混合后,经荧光酶标仪检测,其结果表明:用甘氨酸和谷氨酸处理的阳性对照组,有明显的FRET变化;草甘膦处理后的变化趋势与甘氨酸、谷氨酸类似;精氨酸和PBS处理的阴性对照组无明显FRET变化。并且FRET变化受底物浓度和pH的影响。正确表达FRET探针的酵母细胞被用于光漂白试验,检测单个细胞的FRET变化情况。利用光漂白法研究氨基酸或草甘膦处理后,单个酵母细胞的FRET变化,结果与荧光酶标仪检测的结果一致。本论文成功构建基于拟南芥氨基酸转运蛋白LHT1的FRET探针,通过原核表达系统和酵母真核表达系统分别证明LHT1具有结合草甘膦的能力,推测其在植株水平可以转运草甘膦,同时该探针还可以进一步用于其他导向农药的筛选。
刘佳星[9]（2017）在《MtDMI2和MtPUB2协同调控截形苜蓿结瘤平衡的分子机制》文中研究说明一直以来,豆科植物如何在结瘤过程中维持平衡状态都是一个很重要的研究课题。目前研究报道,豆科植物结瘤的自调节机制（AON）能够通过地上部分和地下部分之间的信号传递以维持结瘤数目的平衡。除了这种长距离的自调节之外,人们推测在植株地下部分也存在一个未知机制来调节并维持结瘤的平衡,然而目前还没有报道。MtDM2（与百脉根LjSymRK是同源蛋白）是亮氨酸重复（LRR）的类受体激酶（LRR-RLK）,处于MtDMI2-MtDMII-MtDMI3结瘤信号途径的上游,作为一个重要的信号传递者,一旦将结瘤信号传递下去就无法逆转,所以植物体是以何种工作机制在翻译后水平上调控MtDMI2的,这是一个重要的科学问题。目前已经有一些关于MtDMI2/Lj SymRK互作蛋白的报道:例如MtHMGR1,编码3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶;以及一个Plant U-box（PUB）类的E3泛素连接酶——MtPUB1,能够与MtDMI2互作。虽然以上报道揭示了一些与MtDMI2/Lj SymRK互作的蛋白以及其相应的功能,但迄今还没有具体阐释结瘤类受体激酶在结瘤信号传递途径中是如何被严谨调控的。本研究结果表明,在截形苜蓿结瘤过程中,存在一个MtDMI2-MtPUB2的负反馈环,这个负反馈环能够在维持结瘤平衡中起到重要作用。本研究首次发现了一个新的PUB类E3泛素连接酶,命名为MtPUB2。结果表明,MtPUB2能够在体外和体内以多聚泛素化的方式介导MtDMI2通过26S蛋白酶体途径发生降解。并且MtDMI2能够通过MtPUB2的第421位丝氨酸磷酸化修饰MtPUB2。更加重要的是MtPUB2泛素化MtDMI2是依赖于后者对其的磷酸化修饰。由于没有在截形苜蓿Tilling突变体库和Tnt1突变体库中筛选到MtPUB2基因的突变体,为了研究MtPUB2的生物学功能,分别应用发根农杆菌介导的毛根转化法和根癌农杆菌介导的叶盘转化法得到了MtPUB2-RNAi植物材料。接种根瘤菌的结瘤表型实验结果表明,MtPUB2-RNAi的植株与野生型植株相比,表现出侵染线数目减少,根瘤数目减少,根长变短以及根瘤密度下降的表型。同时还发现MtPUB2是一个多功能蛋白,参与了植物生长、开花时间调控以及抗病信号途径。而且一旦MtPUB2基因的干扰效率达到0.95,植株则会出现延滞生长、不育直至死亡的现象。进一步对MtPUB2和MtDMI2的互作与结瘤的关系进行验证,采用定量Western blotting实验方法对野生型截形苜蓿A17生态型和突变体截形苜蓿dmi2-1（TR25）进行研究,分别在同时期接种根瘤菌S.meliloti 1021和水对照,在接种后的不同时间点取根部样本（0h,5h,12h,24h,3 DAI,5 DAI,7 DAI,14 DAI,21 DAI 和 28 DAI;hours,h;days after inoculation,DAI）并提取总蛋白进行定量Western blotting分析。实验结果表明,随着MtDMI2蛋白量的增加,MtPUB2也随之增加;反之,MtDMI2下降,MtPUB2也随之下降,两者的变化关系随着时间的延长呈现出波峰波谷起伏的曲线形态。采用数学建模的方法,即运用Lotka-Volterra方程（LV equations）在matlab程序中对MtDMI2和MtPUB2的变化关系进行深入探讨。结果表明,MtDMI2和MtPUB2在接种根瘤菌后24 h至21 DAI之间,呈现出一种Prey（MtDMI2）-Predator（MtPUB2）的关系,符合负反馈环的工作模型。综上所述,在本研究中提出MtDMI2和MtPUB2的一个工作模型:当截形苜蓿的根部接收到来自根瘤菌分泌的结瘤因子（NF）信号之后,会通过MtNFP和MtLYK3一级结瘤（类）受体激酶传递到MtDMI2,MtDMI2继续向下游传递信号,此时MtDMI2通过Ser421位点磷酸化MtPUB2进而激活MtPUB2,MtPUB2被激活后,能够发挥其E3泛素连接酶功能,从而对MtDMI2进行多聚泛素化修饰,最终介导MtDMI2通过26S蛋白酶体途径发生降解,因此维持了结瘤过程的动态平衡。但是这种平衡一旦被破坏,就会出现侵染线数目减少,根瘤数目减少以及根瘤发育不正常的表型。与癌症研究中的p53-MDM2工作模型类似,p53是一个肿瘤抑制因子,MDM2是一个E3泛素连接酶,能够多聚泛素化降解p53。在正常的健康细胞中,p53-MDM2的负反馈环需要维持一种平衡状态。而如何在豆科模式植物截形苜蓿MtDMI2-MtDMII-MtDMI3的结瘤信号途径中维持一种平衡状态,一直以来都未见报道。所以,本研究揭示了截形苜蓿中一个结瘤类受体激酶和E3泛素连接酶之间的新工作机制,并且这个工作机制在控制豆科植物结瘤平衡中扮演重要的角色,是解释豆科植物如何保持结瘤平衡状态这个科学问题的又一突破。
吴晓丽[10]（2016）在《结核分枝杆菌Csm3蛋白功能的初步研究》文中认为结核病（tuberculosis/TB）是由结核分枝杆菌引起的慢性传染病,根据世界卫生组织（WHO）2015年全球结核病报告显示,全球约有1/3的人携带结核分枝杆菌,其可以长期潜伏在宿主体内,需要持续的药物治疗,进而导致结核分枝杆菌多耐药菌株、泛耐药菌株日趋增多,这为结核病的防治带来了巨大的威胁和挑战。因此,加强对结核分枝杆菌的基础研究,特别是其致病性的研究,对于抗结核药物的研发及结核病的诊断和治疗显得尤为重要。CRISPR-Cas系统是原核生物的一种依赖于核酸的获得性免疫系统,其不但能帮助宿主抵御外源基因入侵,还能影响病原菌毒力。结核分枝杆菌中的CRISPR-Cas系统属于Ⅲ-A亚型,该系统主要用于结核分枝杆菌分型,然而其在结核分枝杆菌内的生物学功能至今未有报道。在本实验中,我们主要研究了结核分枝杆菌CRISPR-Cas系统中的Csm3蛋白,制备了抗Csm3的多克隆抗体,研究结果表明Csm3为分泌蛋白,能够帮助细菌抵抗巨噬细胞吞噬,从而提高细菌毒力。另外,我们还发现Csm3蛋白不能引起巨噬细胞凋亡,但是能够引起较弱的T细胞反应。以上结果说明结核分枝杆菌的CRISPR-Cas系统不但能帮助细菌抵御外源基因入侵,还与细菌毒力及宿主免疫相关。同时,我们在体外纯化了 Cas蛋白及HtpG蛋白,通过Co-IP和GST Pull-down实验鉴定了复合物中与Csm3相互作用的蛋白,初步解析蛋白组分间的关系,并进一步研究了 Csm3与crRNA的关系,使我们更加深入了解了CRISPR-Cas系统。另外,我们在体外纯化了 crRNA-Csm复合物,遗憾的是由于其纯度不够高,无法进行后续实验,故接下来还需要进一步的纯化验证。
二、原核细胞阳性克隆的筛选（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、原核细胞阳性克隆的筛选（论文提纲范文）
（2）三特异性抗体构建及其对NK细胞抗肿瘤作用研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 双特异性抗体构造形式 |
| 1.1.1 基于片段的构型 |
| 1.1.1.1 串联排列形式 |
| 1.1.1.2 Diabody形式 |
| 1.1.1.3 DART形式 |
| 1.1.1.4 Fab融合蛋白 |
| 1.1.2 IgG样对称构型 |
| 1.1.3 IgG样非对称构型 |
| 1.1.3.1 抗体异源重链二聚化策略 |
| 1.1.3.2 抗体轻链和重链配对策略 |
| 1.2 双特异性抗体在肿瘤免疫治疗中的机制 |
| 1.2.1 效应细胞再导向 |
| 1.2.1.1 基于T细胞再导向 |
| 1.2.1.2 基于NK细胞再导向 |
| 1.2.2 免疫调节 |
| 1.2.3 靶向肿瘤细胞受体的双重结合 |
| 1.3 双特异性抗体在肿瘤治疗中的应用 |
| 1.3.1 双特异性抗体在血液瘤中的应用 |
| 1.3.2 双特异性抗体在实体瘤中的应用 |
| 1.3.3 双特异性抗体在临床应用中的挑战 |
| 第2章 引言 |
| 第3章 材料与方法 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 实验动物 |
| 3.1.2 实验细胞系 |
| 3.1.3 人血液标本 |
| 3.1.4 实验试剂 |
| 3.1.4.1 细胞培养相关试剂 |
| 3.1.4.2 分子克隆相关试剂 |
| 3.1.4.3 抗体表达相关试剂 |
| 3.1.4.4 抗体纯化相关试剂 |
| 3.1.4.5 SDS-PAGE相关试剂 |
| 3.1.4.6 人免疫细胞分离相关试剂 |
| 3.1.4.7 流式细胞术相关试剂 |
| 3.1.4.8 酶联免疫吸附试验相关试剂 |
| 3.1.4.9 免疫荧光相关试剂 |
| 3.1.4.10 小鼠体内实验相关的试剂 |
| 3.2 实验器材 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 细胞培养 |
| 3.3.1.1 细胞复苏 |
| 3.3.1.2 悬浮细胞培养 |
| 3.3.1.3 293T细胞培养 |
| 3.3.1.4 NK-92细胞培养 |
| 3.3.1.5 expiCHO-S细胞培养 |
| 3.3.1.6 细胞冻存 |
| 3.3.2 过表达载体构建 |
| 3.3.2.1 PCR扩增 |
| 3.3.2.2 双酶切 |
| 3.3.2.3 DNA片段胶回收 |
| 3.3.2.4 连接反应 |
| 3.3.2.5 转化 |
| 3.3.2.6 筛选阳性菌落 |
| 3.3.2.7 常规质粒小提 |
| 3.3.2.8 无内毒素质粒小提 |
| 3.3.3 原核诱导表达 |
| 3.3.4 蛋白变、复性 |
| 3.3.5 SDS-PAGE电泳及鉴定 |
| 3.3.6 构建过表达luciferase的肿瘤细胞系 |
| 3.3.6.1 慢病毒包装 |
| 3.3.6.2 慢病毒浓缩 |
| 3.3.6.3 慢病毒感染 |
| 3.3.7 构建过表达人CD16的NK-92细胞系 |
| 3.3.8 真核瞬时表达 |
| 3.3.9 protein L亲和层析 |
| 3.3.10 人PBMC的分离 |
| 3.3.11 磁珠分选 |
| 3.3.12 流式细胞术 |
| 3.3.12.1 检测抗体结合 |
| 3.3.12.2 检测表面分子 |
| 3.3.12.3 检测胞内分子 |
| 3.3.12.4 分选细胞 |
| 3.3.13 抗体标记荧光素 |
| 3.3.14 细胞增殖检测 |
| 3.3.15 细胞杀伤实验 |
| 3.3.15.1 7AAD杀伤检测 |
| 3.3.15.2 荧光素酶反应法 |
| 3.3.16 构建免疫/肿瘤双人源化小鼠模型(PDC-PBMC模型) |
| 3.3.17 生物发光成像 |
| 3.3.18 ELISA检测 |
| 3.3.19 细胞交联试验 |
| 3.3.20 细胞免疫荧光染色 |
| 3.3.21 统计分析 |
| 第4章 实验结果 |
| 4.1 三特异性抗体的基因表达载体构建与蛋白质表达 |
| 4.1.1 161519抗体原核表达载体构建与蛋白表达和纯化 |
| 4.1.2 161519抗体真核表达载体构建与蛋白表达和纯化 |
| 4.1.3 对照双特异性抗体构建、表达与纯化 |
| 4.2 三特异性抗体的体外功能鉴定 |
| 4.2.1 三特异性抗体结合活性 |
| 4.2.2 三特异性抗体促进NK细胞与靶细胞交联 |
| 4.2.3 三特异性抗体增强NK细胞活化 |
| 4.2.4 三特异性抗体不影响T细胞对Namalwa细胞应答 |
| 4.2.5 三特异性抗体增强NK细胞杀伤活性 |
| 4.2.6 真核表达的161519抗体具有更强的生物学活性 |
| 4.3 三特异性抗体体内抗肿瘤作用 |
| 4.3.1 荧光素酶过表达细胞株的建立 |
| 4.3.2 三特异性抗体体内抗肿瘤作用 |
| 4.3.3 三特异性抗体联合IL-2的体内抗肿瘤作用 |
| 第5章 总结和讨论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 在读期间发表的学术论文与取得的其他研究成果 |
（3）顺式肽键发生机制及其模式蛋白功能效应研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 中英文术语对照及缩略词表 |
| 1 绪论 |
| 1.1 文献综述 |
| 1.1.1 肽键构象的相关概念 |
| 1.1.2 Pin1 介导的肽键异构化 |
| 1.1.3 肽键异构化参与多种重要的生物过程调节 |
| 1.1.4 肽键异构化参与肿瘤发生过程的调节 |
| 1.1.5 肽键异构化与Wnt/β-catenin信号通路调节 |
| 1.1.6 肽键异构化的研究方法 |
| 1.1.7 肽键异构化研究的方法存在的问题 |
| 1.2 本论文研究的内容 |
| 1.2.1 PDB中蛋白质顺式肽键发生率分布规律探讨 |
| 1.2.2 突变型β-catenin(Xaa246)在hep G2 中的亚定位分析 |
| 1.3 本论研究所采用技术路线 |
| 1.3.1 顺式肽键信息提取及ICPB分布的分析 |
| 1.3.2 真核细胞中ICPB值与其功能效应关系的探讨 |
| 1.3.3 干扰Pin1 表达后β-catenin(Xaa246)与APC、E-cadherin之间的相互作用及细胞定位分析 |
| 2 PDB中 ICPB分布的统计分析 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 顺式肽键提取及其分布规律研究 |
| 2.2.1 顺反式肽键的定义 |
| 2.2.2 二面角Omega与相邻Cα距离的关系推导 |
| 2.2.3 顺式肽键提取的C程序设计 |
| 2.2.4 非冗余PDB数据集的建立 |
| 2.2.5 顺式肽键提取的计算机程序操作 |
| 2.3 顺式肽键发生率的统计 |
| 2.3.1 不同Xaa-P顺式肽键发生率的统计 |
| 2.3.2 不同种类X影响Xaa-P顺式肽键发生的统计 |
| 2.3.3 顺式肽键发生的蛋白质结构部位的观测 |
| 2.3.4 顺式非脯氨酸肽键(X-Xn P)的统计及分析 |
| 2.4 Xaa-P肽键的分子模拟及能量分析 |
| 2.5 结果 |
| 2.5.1 数据集中顺反式肽键的统计 |
| 2.5.2 Xaa-P顺式肽键分布及其ICPB统计 |
| 2.5.3 Xaa-P前后序列特征影响顺式肽键分布的Z值分析 |
| 2.5.4 非脯氨酸顺式肽键(Xaa-Xn P)的统计及分析 |
| 2.5.5 Xaa-P二肽的肽键二面角变化与能量关系 |
| 2.6 讨论 |
| 2.6.1 顺式肽键的定义对顺式肽键统计结果的影响 |
| 2.6.2 Xaa-P的结构与ICPB的关系 |
| 2.6.3 ICPB与 Xaa-P前后序列特征的关系 |
| 2.6.4 不同Xaa对 Xaa-P肽键ICPB影响 |
| 2.6.5 关于不同Xaa-P构型能量分布与ICPB的关系 |
| 2.6.6 二面角ω键旋转方向与ICPB的关系 |
| 2.6.7 其它因素与ICPB的关系 |
| 2.7 本章小结 |
| 3 真核细胞中ICPB值与其功能效应关系的探讨 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 材料 |
| 3.2.2 方法 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 过表达载体质粒测序结果 |
| 3.3.2 重组质粒的ORF及 blast分析 |
| 3.3.3 稳定表达β-catenin(X246-P)的hep G2 细胞构建 |
| 3.3.4 β-catenin(Xaa246)与APC、E-cadherin相互作用检测 |
| 3.3.5 干扰Pin1后β-catenin(Xaa246)与APC、E-cadherin相互作用 |
| 3.3.6 不同β-catenin(Xaa246)突变体在hep G2 中的亚定位观察 |
| 3.3.7 干扰Pin1后β-catenin(Xaa246)亚细胞定位 |
| 3.4 讨论 |
| 3.4.1 ICPB值在真核细胞中进行功能效应验证的必要性 |
| 3.4.2 选择β-catenin(Xaa246-P247)作为模式蛋白的原因 |
| 3.4.3 其它Pin1 靶位点异构化与β-catenin亚细胞定位影响 |
| 3.4.4 β-catenin中S246 残基参与APC、E-cadherin的相互作用吗? |
| 3.4.5 干扰Pin1 表达对β-catenin(Xaa-P)与APC、E-cadherin相互作用及细胞亚定位的影响 |
| 3.5 本章小结 |
| 4 结论 |
| 5 后续研究及应用展望 |
| 5.1 揭示肿瘤信号通路中各信号蛋白之间相互作用的亚分子机制 |
| 5.2 揭示脯氨酸突变改变蛋白质热稳定性的机理 |
| 5.3 ICPB理论与功能的探讨 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| A.作者在攻读博士学位期间发表的论文 |
| B.附录 文件 |
| C.学位论文数据集 |
| 致谢 |
（4）水稻RF6的表达纯化及其互作蛋白OsHXK6的结构研究（论文提纲范文）
| 论文创新点 |
| 部分中英文缩略词 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一部分 红莲型CMS水稻RF6的表达、纯化以及初步晶体筛选 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 植物细胞质雄性不育及育性恢复机理研究 |
| 1.1.1 植物细胞质雄性不育不育机理研究 |
| 1.1.2 植物细胞质雄性不育育性恢复机理研究 |
| 1.1.3 三种CMS/Rf研究进展 |
| 1.2 PPR蛋白研究进展 |
| 1.2.1 PPR蛋白的分类 |
| 1.2.2 PPR蛋白的结构 |
| 1.2.3 PPR蛋白的功能 |
| 1.2.4 PPR蛋白纯化方法汇总 |
| 1.3 本研究的目的与意义 |
| 第二章 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 RF6表达纯化的技术流程图 |
| 2.2.2 大肠杆菌感受态细胞的制备和转化 |
| 2.2.3 载体构建 |
| 2.2.4 原核细胞小量表达目的蛋白与western-blot检测 |
| 2.2.5 一步PCR法定点突变 |
| 2.2.6 Sf9表达RF6和GST-RF6-2 |
| 2.2.7 亲和层析 |
| 2.2.8 分子筛纯化目的蛋白 |
| 2.2.9 超滤管浓缩换液 |
| 2.2.10 Pull-down分析 |
| 2.2.11 晶体筛选 |
| 第三章 实验结果与分析 |
| 3.1 RF6的生物信息学分析以及同源模建 |
| 3.1.1 RF6的一级结构和二级结构分析 |
| 3.1.2 RF6的同源模建 |
| 3.2 RF6半胱氨酸(Cys)的定点突变 |
| 3.3 Cys突变没有改善RF6的表达以及纯化 |
| 3.4 RF6(Cys27)的序列改造及其表达纯化 |
| 3.4.1 RF6(Cys27)的序列改造 |
| 3.4.2 原核表达检测和GST柱纯化改造后的RF6(Cys27) |
| 3.4.3 RF6-2 的大量表达与纯化 |
| 3.4.4 Pull-down分析RF6-2 的蛋白活性 |
| 3.5 SF9 表达RF6及其纯化 |
| 3.5.1 昆虫表达载体的构建和重组Bacmid的筛选 |
| 3.5.2 RF6在SF9 中的表达及其纯化 |
| 3.6 讨论 |
| 第二部分 OsHXK6 的结构研究 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 植物己糖激酶概述 |
| 1.2 植物己糖激酶的分类及其各自功能 |
| 1.2.1 A类己糖激酶 |
| 1.2.2 B类己糖激酶 |
| 1.2.3 C类己糖激酶 |
| 1.2.4 D类己糖激酶 |
| 1.3 己糖激酶催化机制的研究进展 |
| 1.4 本研究的目的与意义 |
| 第二章 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 实验流程图 |
| 2.2.2 载体构建和表达纯化 |
| 2.2.3 离子交换柱纯化目的蛋白 |
| 2.2.4 Native-PAGE检测 |
| 2.2.5 BCA蛋白定量 |
| 2.2.6 两步PCR法定点突变 |
| 2.2.7 己糖激酶活性测定 |
| 2.2.8 晶体数据的收集,处理与结构修正 |
| 第三章 实验结果与分析 |
| 3.1 生物信息学分析 |
| 3.1.1 OsHXK6的一级结构分析 |
| 3.1.2 OsHXK6的二级结构预测 |
| 3.2 OsHXK6的原核表达以及纯化 |
| 3.3 OsHXK6晶体筛选,优化以及X-射线晶体衍射 |
| 3.3.1 晶体筛选和晶体优化 |
| 3.3.2 X-射线晶体衍射 |
| 3.4 OsHXK6截断体的原核表达与纯化 |
| 3.5 OsHXK6截断体的晶体筛选与优化 |
| 3.6 X-射线晶体衍射数据的收集,处理与结构修正 |
| 3.7 OsHXK6结构的分析 |
| 3.7.1 OsHXK6-apo和OsHXK6-Glc的结构分析 |
| 3.7.2 OsHXK6-ADP-PO_4-Mg~(2+)晶体复合物的分析 |
| 3.7.3 OsHXK6-Glc-ADP-PO_4-Mg~(2+)晶体复合物分析 |
| 3.8 OsHXK6与底物结合的关键氨基酸 |
| 3.9 植物天然无催化能力己糖激酶的序列分析 |
| 3.10 己糖激酶的底物结合模式保守性分析 |
| 3.11 讨论 |
| 参考文献 |
| 攻博期间发表的科研论文 |
| 致谢 |
（5）利用温和噬菌体载体递呈CRISPR-Cas9系统靶向清除细菌耐药性的研究（论文提纲范文）
| 缩略语表 摘要 Abstract 前言 第一章 利用CRISPR-Cas9 系统清除NDM-1 耐药质粒 |
| 引言 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.1.1 菌株及质粒 |
| 1.1.2 主要试剂及培养基 |
| 1.1.3 主要仪器设备 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.2.1 天然NDM-1 质粒模式菌的构建 |
| 1.2.2 高拷贝NDM-1 质粒模式菌的构建 |
| 1.2.3 CRISPR系统靶点spacer文库的构建 |
| 1.2.4 原核CRISPR-Cas9 系统的构建 |
| 1.2.5 利用CRISPR系统清除NDM-1 耐药质粒 |
| 1.3 结果 |
| 1.3.1 bla_(NDM-1)靶点spacer文库的建立 |
| 1.3.2 筛选g RNA并验证CRISPR-Cas9 剪切pNDM-1 质粒的效果 |
| 1.3.3 细菌耐药表型的改变 |
| 1.3.4 CRISPR系统剪切清除pNDM-1 效率的分析 |
| 1.3.5 gRNA对 CRISPR系统清除效率的影响 |
| 1.3.6 流式细胞术检测CRISPR系统清除高拷贝耐药质粒效果 |
| 1.3.7 荧光共聚焦显微镜观测CRISPR系统清除高拷贝耐药质粒效果 |
| 1.4 讨论 |
| 1.5 小结 第二章 “一步法”温和噬菌体包装CRISPR-Cas9 系统技术的建立 |
| 引言 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 菌株和噬菌体株 |
| 2.1.2 主要试剂及培养基 |
| 2.1.3 主要仪器设备 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 野生型噬菌体的纯化培养 |
| 2.2.2 噬菌体的浓缩与纯化 |
| 2.2.3 pST_K自杀质粒的构建 |
| 2.2.4 温和噬菌体的溶源化 |
| 2.2.5 噬菌体基因组的提取 |
| 2.2.6 噬菌体基因组的测序、组装和注释 |
| 2.2.7 CRISPR-Cas9 序列线性重组模板的制备 |
| 2.2.8 噬菌体基因组重组CRISPR-Cas9 系统 |
| 2.2.9 检验噬菌体递呈CRISPR清除耐药质粒效果 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 温和噬菌体vB_365 的分离、基因组测序和重组位点的选取 |
| 2.3.2 温和噬菌体“一步法”包装CRISPR-Cas |
| 2.3.3 阳性重组菌落的SacB阴性筛选 |
| 2.3.4 噬菌体包装CRISPR-Cas9 系统后的基因检测 |
| 2.3.5 噬菌体递呈CRISPR-Cas9 清除靶质粒 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 第三章 利用噬菌体递呈CRISPR-Cas9 系统抗耐药菌作用的体内外实验研究 |
| 引言 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 菌株和噬菌体 |
| 3.1.2 主要试剂及培养基 |
| 3.1.3 动物实验 |
| 3.1.4 主要仪器设备 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 检测细菌携带耐药质粒的变化 |
| 3.2.2 检测细菌生长培养基中耐药质粒浓度 |
| 3.2.3 噬菌体递呈CRISPR-Cas9 系统阻断细菌耐药性扩散 |
| 3.2.4 耐药菌生物膜相关实验 |
| 3.2.5 耐药菌感染小鼠模型评价噬菌体清除细菌耐药性效果 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 噬菌体递呈CRISPR-Cas9 系统清除大肠杆菌携带耐药质粒的效率 |
| 3.3.2 噬菌体递呈CRISPR-Cas9 技术联合抗生素的杀菌效果 |
| 3.3.3 噬菌体递呈CRISPR-Cas9 技术减少耐药质粒向细胞外环境的释放 |
| 3.3.4 噬菌体递呈CRISPR系统阻断耐药质粒的接合转移 |
| 3.3.5 噬菌体递呈CRISPR系统清除生物膜中的耐药质粒 |
| 3.3.6 噬菌体递呈CRISPR-Cas9 清除小鼠皮肤感染细菌的耐药性 |
| 3.3.7 噬菌体递呈CRISPR清除小鼠肠道感染大肠杆菌携带的耐药质粒 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 第四章 噬菌体递呈CRISPR-Cas9 联合抗生素长效抑菌与噬菌体抗菌耐受机制分析 |
| 引言 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 菌株和噬菌体 |
| 4.1.2 主要试剂及培养基 |
| 4.1.3 动物实验 |
| 4.1.4 主要仪器设备 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 体外实验监测噬菌体递呈CRISPR-Cas9 技术的长效抗耐药菌性能 |
| 4.2.2 体内实验监测噬菌体递呈CRISPR-Cas9 技术的长效抗耐药菌性能 |
| 4.2.3 噬菌体耐受突变株的分离 |
| 4.2.4 抗生素耐受突变株的分离 |
| 4.2.5 耐受突变株的测序分析 |
| 4.2.6 细菌基因mRNA水平检测 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 体外实验监测噬菌体递呈CRISPR-Cas9 联合抗生素对抗耐药菌的效果 |
| 4.3.2 利用小鼠皮肤感染模型分析噬菌体递呈CRISPR-Cas9 技术联合抗生素对抗耐药菌的效果 |
| 4.3.3 利用小鼠肠道感染模型监测噬菌体递呈CRISPR-Cas9 技术联合抗生素策略的抗耐药菌效果 |
| 4.3.4 耐受突变株的基因组测序分析 |
| 4.3.5 DNA修复相关基因在耐药质粒剪切后的表达水平分析 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 第五章 结论与展望 参考文献 作者在学期间取得的学术成果 附发表文章首页 个人简历 致谢 |
（6）人源P53与COP1/DET1复合物表达纯化以及相互作用研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 课题背景及研究的目的和意义 |
| 1.1.1 课题背景 |
| 1.1.2 课题研究的目的与意义 |
| 1.2 p53 的相关研究 |
| 1.2.1 p53 基因的发现 |
| 1.2.2 p53 基因的结构 |
| 1.2.3 p53 基因的功能 |
| 1.2.4 p53 基因与肿瘤的治疗 |
| 1.3 COP1、DET1 的相关研究 |
| 1.3.1 cop1 基因的发现 |
| 1.3.2 COP1 蛋白结构 |
| 1.3.3 det1 基因的相关研究 |
| 1.3.4 COP1、DET1 的功能 |
| 1.4 本文的主要研究内容及主要技术路线 |
| 1.4.1 主要研究内容 |
| 1.4.2 主要技术路线 |
| 第2章 实验内容与研究方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验细胞系、载体和菌株 |
| 2.1.2 实验所用试剂 |
| 2.1.3 主要实验仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 分子实验部分 |
| 2.2.2 真核细胞的培养、传代和冻存 |
| 2.2.3 真核细胞表达蛋白的鉴定 |
| 2.2.4 表达蛋白的相关实验方法 |
| 第3章 P53、COP1和DET1 蛋白的表达与纯化 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 P53 蛋白纯化结果与分析 |
| 3.2.1 P53 蛋白原核表达载体的构建 |
| 3.2.2 P53 蛋白全长的表达与纯化结果与分析 |
| 3.2.3 P53 蛋白片段的表达与纯化结果与分析 |
| 3.3 COP1、DET1 蛋白纯化结果与分析 |
| 3.3.1 COP1、DET1 蛋白真核表达载体的构建 |
| 3.3.2 COP1、DET1 蛋白的纯化 |
| 3.5 本章小结 |
| 第4章 COP1、DET1和P53 蛋白的体外相互作用 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 COP1、DET1与P53 蛋白的体外Pull-down实验 |
| 4.3 本章小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（7）ANKRD22在结直肠癌细胞中表达意义的研究（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 缩略词表 |
| 引言 |
| 第1章 结直肠癌ANKRD22表达的相关数据分析 |
| 前言 |
| 1.1 数据库分析方法 |
| 1.2 结果 |
| 1.3 数据库分析结论 |
| 第2章 ANKRD22重组表达和抗ANKRD22单克隆抗体的制备 |
| 前言 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.3 实验结果 |
| 第3章 ANKRD22在结直肠癌细胞中表达及意义 |
| 前言 |
| 3.1 试剂 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.3 实验结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 作者简历及在学期间所取得的科研成果 |
（8）基于FRET技术研究LHT1参与草甘膦的转运（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 1 前言 |
| 1.1 导向农药 |
| 1.1.1 导向农药的提出 |
| 1.1.2 导向农药的发展 |
| 1.2 植物转运蛋白 |
| 1.2.1 植物糖转运蛋白 |
| 1.2.2 氨基酸转运蛋白 |
| 1.3 绿色荧光蛋白概述 |
| 1.4 荧光共振能量转移FRET |
| 1.4.1 荧光共振能量转移原理 |
| 1.4.2 荧光共振能量转移技术应用 |
| 1.5 研究的目的以及意义 |
| 1.6 研究内容 |
| 1.7 本研究的实验设计与技术路线 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.1.1 供试药物 |
| 2.1.2 质粒与菌株 |
| 2.1.3 主要试剂 |
| 2.1.4 主要培养基 |
| 2.1.5 主要试剂配制 |
| 2.1.6 主要仪器 |
| 2.1.7 数据采集与分析软件 |
| 2.1.8 生物信息学分析软件及相关网站 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 质粒构建 |
| 2.2.1.1 pDR196-CFP-YFP载体构建 |
| 2.2.1.2 pDR196-CFP-linker-YFP载体构建 |
| 2.2.1.3 pDR196-CFP-linker-LHT1-YFP载体构建 |
| 2.2.1.4 pRSET-A-CFP-linker-LHT1-YFP载体构建 |
| 2.2.2 原核表达及酶标仪荧光检测 |
| 2.2.2.1 BL21(DE3)pLysS转化 |
| 2.2.2.2 BL21(DE3)pLysS诱导表达 |
| 2.2.2.3 BL21(DE3)pLysS表达分析 |
| 2.2.2.4 蛋白表达WesternBlot验证 |
| 2.2.2.5 原核表达的蛋白纯化 |
| 2.2.2.6 酶标仪荧光检测 |
| 2.2.3 酵母真核表达及共聚焦检测 |
| 2.2.3.1 BY4741酵母感受态制备 |
| 2.2.3.2 BY4741酵母转化 |
| 2.2.3.3 BY4741酵母阳性克隆筛选 |
| 2.2.3.4 光漂白分析 |
| 3 结果分析 |
| 3.1 质粒构建 |
| 3.1.1 成功构建pDR196-CFP-YFP载体 |
| 3.1.2 成功构建两系统表达载体 |
| 3.2 原核表达及酶标仪荧光检测 |
| 3.2.1 原核表达分析 |
| 3.2.2 不同底物浓度对LHT1的FRET探针光强比率变化的影响 |
| 3.2.3 在不同pH条件下不同底物对LHT1的FRET探针光强变化 |
| 3.2.4 不同底物对LHT1的FRET探针光强变化 |
| 3.3 酵母真核表达的共聚焦检测 |
| 4 结论与讨论 |
| 4.1 结论 |
| 4.2 讨论 |
| 4.2.1 构建LHT1的FRET探针 |
| 4.2.2 LHT1对不同底物的转运 |
| 4.2.3 两种检测方法的优缺点比较 |
| 4.3 有待进一步解决的问题 |
| 4.4 本论文的创新之处 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
（9）MtDMI2和MtPUB2协同调控截形苜蓿结瘤平衡的分子机制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 豆科作物结瘤信号途径的概述 |
| 1.1.1 截形苜蓿和百脉根共生信号途径(Common symbiosis signallingpathway，CSP)的研究进展 |
| 1.1.2 植物激素参与结瘤共生过程的研究进展 |
| 1.1.3 豆科植物结瘤自调节途径(Autoregulation of nodulation，AON)的研究进展 |
| 1.2 植物类受体激酶、受体激酶和结瘤类受体激酶的研究进展 |
| 1.3 E3泛素连接酶的研究概述 |
| 1.3.1 泛素化过程以及E3泛素连接酶的分类 |
| 1.3.2 植物U-box类E3泛素连接酶的研究进展 |
| 1.3.3 E3泛素连接酶参与豆科作物结瘤的研究进展 |
| 1.4 负反馈控制原理及其应用 |
| 1.5 本研究的目的和意义 |
| 第二章 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 植物材料 |
| 2.1.2 载体和菌株 |
| 2.1.3 化学试剂、试剂盒和酶 |
| 2.2 溶液及试剂 |
| 2.2.1 常用溶液 |
| 2.2.2 培养基配制 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 植物总DNA的提取(CTAB法) |
| 2.3.2 植物总RNA的提取(TRIzol法)及反转录 |
| 2.3.3 重组克隆的构建 |
| 2.3.4 酵母双杂交文库的构建以及酵母双杂交 |
| 2.3.5 大肠杆菌质粒大量提取以及纯化(威格拉斯质粒大量提取纯化试剂盒) |
| 2.3.6 基因枪转化洋葱表皮实验 |
| 2.3.7 融合MBP标签蛋白的原核表达和纯化 |
| 2.3.8 融合GST标签蛋白的原核表达和纯化 |
| 2.3.9 融合His标签蛋白的原核表达和纯化 |
| 2.3.10 GST Pull-down实验 |
| 2.3.11 蛋白质免疫共沉淀(Co-IP)实验 |
| 2.3.12 蛋白Western blotting杂交 |
| 2.3.13 E3泛素连接酶体外实验 |
| 2.3.14 植物体内降解实验 |
| 2.3.15 体外磷酸化反应 |
| 2.3.16 截形苜蓿体内CIAP和Phos-tag实验 |
| 2.3.17 截形苜蓿体内GUS染色实验 |
| 2.3.18 qRT-PCR实验 |
| 2.3.19 截形苜蓿的遗传转化(根癌农杆菌叶盘转化法) |
| 2.3.20 发根农杆菌介导的截形苜蓿根部转化(发根农杆菌毛根转化法) |
| 2.3.21 SDS-PAGE |
| 2.3.22 植物体内半体内降解实验 |
| 2.3.23 注射烟草实验 |
| 2.3.24 拟南芥遗传转化(花序浸泡法) |
| 2.3.25 截形苜蓿根或根瘤震荡切片 |
| 2.3.26 拟南芥叶片台盼蓝染色 |
| 2.3.27 细胞组分分离实验 |
| 2.4 实验主要仪器 |
| 第三章 实验结果与分析 |
| 3.1 构建截形苜蓿酵母双杂交文库以及筛选与MtDMI2互作的蛋白 |
| 3.1.1 截形苜蓿酵母双杂交文库筛选结果 |
| 3.1.2 MtDMI2与MtPUB2互作的证据 |
| 3.2 截形苜蓿MtPUB2基因的克隆与序列分析 |
| 3.3 MtPUB2的亚细胞定位与E3泛素连接酶功能验证 |
| 3.4 MtPUB2的组织表达特征 |
| 3.5 MtPUB2的多功能性分析 |
| 3.6 MtPUB2影响结瘤表型的证据(发根农杆菌毛根转化法) |
| 3.7 MtPUB2影响结瘤表型的证据(根癌农杆菌叶盘转化法) |
| 3.8 MtPUB2能够介导MtDMI2的泛素化降解 |
| 3.9 MtDMI2磷酸化MtPUB2的证据和MtPUB2磷酸化位点的确定 |
| 3.9.1 MtDMI2磷酸化MtPUB2的证据 |
| 3.9.2 MtPUB2磷酸化位点的确定 |
| 3.10 MtPUB2和MtDMI2互作调节结瘤平衡的机制 |
| 第四章 讨论与展望 |
| 4.1 关于MtDMI2和MtPUB2磷酸化和泛素化的讨论 |
| 4.2 关于MtPUB2多功能性的讨论 |
| 4.3 关于Prey (MtDMI2) - Predator (MtPUB2)负反馈模型的讨论 |
| 4.4 展望 |
| 第五章 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（10）结核分枝杆菌Csm3蛋白功能的初步研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 引言 |
| 1.1 结核病及其现状 |
| 1.2 结核分枝杆菌简介 |
| 1.2.1 结核分枝杆菌 |
| 1.2.2 耻垢分枝杆菌简介 |
| 1.2.3 耻垢分枝杆菌作为结核分枝杆菌模式生物的优缺点 |
| 1.3 CRISPR-Cas系统简介 |
| 1.3.1 CRISPR-Cas系统的结构 |
| 1.3.2 CRISPR-Cas系统的作用机制 |
| 1.3.3 CRISPR-Cas系统与病原菌毒力的关系 |
| 1.3.4 结核分枝杆菌CRISPR-Cas系统研究现状 |
| 1.4 CRISPR-Cas/Csm3蛋白简介 |
| 1.5 本研究的目的和意义 |
| 第二章 抗Csm3蛋白多克隆抗体的制备 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 菌株和质粒 |
| 2.1.2 试剂和药品 |
| 2.1.3 主要仪器 |
| 2.1.4 相关溶液及其配制 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 生物信息学分析 |
| 2.2.2 CTAB法提取结核分枝杆菌基因组 |
| 2.2.3 pET-28a-Csm3表达载体的构建 |
| 2.2.4 融合蛋白的表达纯化 |
| 2.2.5 蛋白标准曲线的绘制 |
| 2.2.6 抗Csm3蛋白多克隆抗体的制备 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 生物信息学分析 |
| 2.3.2 结核分枝杆菌基因组的提取 |
| 2.3.3 pET-28a-Csm3表达载体的构建 |
| 2.3.4 Csm3蛋白的表达纯化 |
| 2.3.5 Csm3蛋白浓度的测定 |
| 2.3.6 抗Csm3蛋白多克隆抗体的制备 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 Csm3蛋白对细菌毒力的影响 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 菌株和质粒 |
| 3.1.2 主要仪器 |
| 3.1.3 相关溶液及其配制 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 耻垢分枝杆菌中过表达Csm3蛋白 |
| 3.2.2 Csm3蛋白重组菌株生长曲线的绘制 |
| 3.2.3 THP-1细胞培养及分化 |
| 3.2.4 Csm3蛋白重组菌株共侵染THP-1巨噬细胞 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 Csm3蛋白不影响耻垢分枝杆菌的生长 |
| 3.3.2 Csm3蛋白能延长耻垢分枝杆菌在巨噬细胞中的存活时间 |
| 3.4 小结 |
| 第四章 Csm3蛋白对巨噬细胞凋亡及T细胞反应的影响 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 主要仪器 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 Western Blotting鉴定Csm3蛋白 |
| 4.2.2 流式细胞仪分析Csm3蛋白对巨噬细胞凋亡的影响 |
| 4.2.3 IFN-γ ELISPOT实验检测Csm3蛋白刺激活化的效应T细胞 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 Csm3蛋白为分泌蛋白 |
| 4.3.2 Csm3蛋白不能诱导巨噬细胞凋亡 |
| 4.3.3 Csm3蛋白可以引起较弱的T细胞反应 |
| 4.4 小结 |
| 第五章 Csm3与Cas蛋白的相互作用 |
| 5.1 实验材料 |
| 5.1.1 菌株和质粒 |
| 5.1.2 实验仪器 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.2.1 免疫共沉淀实验(Co-IP) |
| 5.2.2 GST Pull-down垂钓相互作用蛋白 |
| 5.2.3 表面等离子共振(SPR)检测蛋白与核酸的相互作用 |
| 5.2.4 RNA 3'末端生物素标记 |
| 5.3 结果与分析 |
| 5.3.1 Cas蛋白复合物的组分 |
| 5.3.2 Cas蛋白及HtpG的体外纯化 |
| 5.3.3 Co-IP验证Csm3与其它Csm蛋白的相互作用 |
| 5.3.4 GST pull-down验证Csm3与其它Csm蛋白间的相互作用 |
| 5.3.5 SPR验证Csm3与crRNA的结合 |
| 5.4 小结 |
| 第六章 crRNA-Csm蛋白复合物的构建及表达纯化 |
| 6.1 实验材料 |
| 6.1.1 菌株和质粒 |
| 6.1.2 相关溶液及其配制 |
| 6.2 实验方法 |
| 6.2.1 构建多启动子共表达载体 |
| 6.2.2 快速化学感受态细胞制备及转化 |
| 6.3 结果与分析 |
| 6.3.1 复合物重组载体的构建 |
| 6.3.2 复合物蛋白的亲和层析纯化 |
| 6.3.3 复合物蛋白的凝胶过滤层析纯化 |
| 6.4 小结 |
| 第七章 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
四、原核细胞阳性克隆的筛选（论文参考文献）
- [1]基于FRET原理构建AtLHT1转运底物筛选探针[J]. 李志伟,李本杰,刘志兵,林菲,徐汉虹,舒薇. 华南农业大学学报, 2022
- [2]三特异性抗体构建及其对NK细胞抗肿瘤作用研究[D]. 成赢. 中国科学技术大学, 2020(01)
- [3]顺式肽键发生机制及其模式蛋白功能效应研究[D]. 于淑惠. 重庆大学, 2020(02)
- [4]水稻RF6的表达纯化及其互作蛋白OsHXK6的结构研究[D]. 何春兰. 武汉大学, 2019(01)
- [5]利用温和噬菌体载体递呈CRISPR-Cas9系统靶向清除细菌耐药性的研究[D]. 刘鸿博. 军事科学院, 2019(09)
- [6]人源P53与COP1/DET1复合物表达纯化以及相互作用研究[D]. 刘健博. 哈尔滨工业大学, 2019(02)
- [7]ANKRD22在结直肠癌细胞中表达意义的研究[D]. 杨赛赛. 浙江大学, 2019(03)
- [8]基于FRET技术研究LHT1参与草甘膦的转运[D]. 刘志兵. 华南农业大学, 2018(08)
- [9]MtDMI2和MtPUB2协同调控截形苜蓿结瘤平衡的分子机制[D]. 刘佳星. 中国农业大学, 2017(05)
- [10]结核分枝杆菌Csm3蛋白功能的初步研究[D]. 吴晓丽. 福建农林大学, 2016(05)
标签：噬菌体论文; crispr-cas9论文; 原核细胞论文; 蛋白质纯化论文; p53基因论文;