一、应用PCR-RFLP进行申克孢子丝菌的分子生物学鉴定（论文文献综述）
陈瑞丽[1]（2021）在《5-氨基酮戊酸光动力对球形孢子丝菌杀伤作用的体外研究及碘化钾对其杀伤效果的影响》文中研究表明孢子丝菌病（Sporotrichosis）是一种常见的深部真菌感染性疾病,皮损表现多样,主要累及皮肤、皮下组织及淋巴组织,偶见内脏、骨骼等系统性感染,迁延不愈。该病在世界范围内均有报道,其病原体申克孢子丝菌复合体（Sporothrix schenckii complex）的主要致病型包括申克孢子丝菌（Sporothrix schenckii）、巴西孢子丝菌（Sporothrix brasiliensis）和我国主要流行的球形孢子丝菌（Sporothrix globosa）。孢子丝菌病的发病机制尚不明确,治疗方法也十分有限,以碘化钾和抗真菌药伊曲康唑、特比萘芬、两性霉素B为主,疗程一般为3-6个月。碘化钾价格低廉,疗效确切,可能会引起皮疹、胃肠道反应等不良反应。长时间应用抗真菌药物可能会引起患者肝肾功能障碍、胃肠道反应等不良反应,甚至出现耐药菌株导致治疗失败。其他治疗方法包括温热疗法、液氮冷冻治疗、物理治疗等。黑素作为孢子丝菌重要的毒力因子,可帮助真菌抵御逆环境,如极端温度、酸碱、紫外线、电离辐射等,降低菌株对抗真菌药物的敏感性,对治疗也有一定影响。近年来有光动力疗法治疗（phtodynamic therapy,PDT）孢子丝菌病的报道,但相关研究十分有限。本研究采用临床分离的球形孢子丝菌野生株Mel+、培养基中含三环唑（tricyclazole,TCZ）以抑制黑素合成的球形孢子丝菌TCZ-Mel+、使用紫外线诱变法获得的不产黑素的白化突变株Mel-和分离自7位孢子丝菌病患者皮损处的球形孢子丝菌,选用5-氨基酮戊酸（5-aminolevulinic acid,ALA）作光敏剂、发光二极管（light-emitting diode,LED）红光作为光源,探讨了威伐光、红光和LED红光等物理治疗手段及ALA-PDT对球形孢子丝菌的杀伤作用、黑素的保护作用及ALA-PDT的杀伤机制、碘化钾（potassium iodide,KI）对ALA-PDT杀伤作用的增强,旨在探索孢子丝菌病的新型治疗方法,以缩短疗程,提高疗效。本研究第一部分以威伐光、红光和54、108、162J/cm2的LED红光分别照射球形孢子丝菌Mel+分生孢子后培养并计算其存活率,另外照射培养基中含三环唑的球形孢子丝菌TCZ-Mel+和白化突变株Mel-分生孢子以观察黑素对菌株的保护作用。结果显示,威伐光照射后Mel+分生孢子存活率为78.9%,显着低于对照组,表明在体外实验中威伐光照射对球形孢子丝菌有杀伤作用,而红光和LED红光则没有。威伐光、红光和LED红光对TCZ-Mel+和Mel-均有不同程度的杀伤效果,但比较三株菌的存活率,在威伐光、红光及162J/cm2的LED红光照射后,TCZ-Mel+和Mel-分生孢子存活率显着低于Mel+分生孢子,提示黑素可帮助菌株抵抗照光过程中的杀伤作用。本实验第二部分研究了ALA-PDT对球形孢子丝菌的体外杀伤效果及黑素的作用。首先以0、0.3M、0.6M、1.19M浓度的ALA和0、54、108、162J/cm2的LED红光摸索对球形孢子丝菌Mel+分生孢子和酵母细胞的杀伤效率;以同样条件处理TCZ-Mel+和Mel-分生孢子,观察黑素的防护作用;7株球形孢子丝菌分生孢子和酵母细胞与1.19M ALA共孵育后给予162J/cm2 LED红光照射以观察ALA-PDT对其他球形孢子丝菌的杀伤效果;采用CCK-8法检测经ALA-PDT处理后的HaCaT细胞活性以评价ALA-PDT的安全性。结果表明,1.19M ALA和162J/cm2 LED红光联合作用时对Mel+分生孢子杀伤作用最强,达97.38%,对酵母细胞100%杀伤,酵母细胞对ALA-PDT的杀伤作用更敏感。比较同样条件下Mel+、TCZ-Mel+和Mel-三株菌的存活率,TCZ-Mel+和Mel-的存活率低于Mel+,表明黑素保护菌株抵抗ALA-PDT的杀伤。1.19M ALA和162J/cm2 LED红光联合作用对另外7株球形孢子丝菌及2株参考菌株的分生孢子和酵母细胞也有同样的抗菌活性。经ALA-PDT处理的HaCaT细胞活性与未处理组无明显差异,ALA-PDT对HaCaT细胞无明显杀伤作用。本研究第三部分进一步探索了ALA-PDT对球形孢子丝菌的杀伤机制。采用DCFH-DA探针检测1.19M ALA和162J/cm2 LED红光共同作用后Mel+分生孢子生成ROS水平,扫描电子显微镜和透射电子显微镜观察ALA-PDT后Mel+分生孢子形态与超微结构,彗星实验检测ALA-PDT后Mel+分生孢子DNA损伤水平。结果显示,经ALA-PDT处理的Mel+分生孢子荧光强度明显增加;扫描电镜下可见分生孢子表面粗糙,有毛刺和突起,形态凹陷;透射电镜下可见分生孢子外层黑素脱失,细胞结构疏松,细胞器被破坏;彗星实验观察到ALA-PDT处理的Mel+分生孢子拖尾率增加,表明DNA损伤水平升高。本研究第四部分研究了KI对ALA-PDT杀伤球形孢子丝菌的影响。本实验中ALA浓度为0.6M,LED红光剂量为108J/cm2,通过在ALA-PDT前或后添加KI及加入不同浓度的KI对其抗菌活性的影响,确定KI加入的时间和浓度;在ALA-PDT前加入100m M KI,观察对Mel+分生孢子及另外7株球形孢子丝菌杀伤作用的影响;采用DCFH-DA探针检测加入KI后Mel+分生孢子的ROS产量。结果显示,在ALA-PDT前添加KI,且KI浓度为100m M时对ALA-PDT抗菌活性增强效果较好;ALA-PDT对球形孢子丝菌Mel+杀伤效果为12.06%,加入100m M KI后,杀伤效率提高至50.5%,在对另外7株球形孢子丝菌的实验上也观察到杀伤效果的增强;加入KI的ALA-PDT过程中ROS产量明显减少。本研究显示威伐光和ALA-PDT对球形孢子丝菌有杀伤作用,黑素在威伐光、红光和162J/cm2的LED红光照射及ALA-PDT过程中帮助菌株抵御杀伤效果,ALA-PDT通过生成大量ROS产生杀伤作用,导致分生孢子超微结构破坏和DNA损伤,KI可增强ALA-PDT对球形孢子丝菌的杀伤效果,为孢子丝菌病的治疗提供了新思路。
吕莎[2]（2020）在《孢子丝菌病临床流行病学特征分析和诊断方法的探索》文中研究指明背景:孢子丝菌病是一种被忽视的真菌病,发病率逐年上升,在巴西已被认为是公共卫生问题。吉林省作为全世界高发区之一,对吉林省的临床流行病学特征进行分析研究,对全国及全世界孢子丝菌病的流行病学都有着非常重要的意义。孢子丝菌病的常规诊断方法包括组织病理学检查及真菌培养,组织病理学检查缺乏特异性,真菌培养耗时长。近年来流行的分子生物学方法可做到快速诊断及分型,但对实验室条件要求较高。孢子丝菌病常发生于农村及医疗卫生条件相对较差的地区,误诊漏诊机率较大,因此探索在临床中便于实施、操作简单、敏感性高的诊断方法有着非常重要的意义。方法:1、收集吉林大学第二医院皮肤科（我科）2010-2019年间明确诊断为孢子丝菌病的病例,并与1990-2009年的吉林省孢子丝菌病流行病学调查分析进行对比,了解孢子丝菌病临床流行病学特征;并通过“中国知网”、“万方数据知识平台”、“维普中文期刊全文数据库”及“Pubmed”搜索我国孢子丝菌病的文献报道,尽量完善我国孢子丝菌病的发病区域等流行病学资料。2、收集我科明确诊断为孢子丝菌病的福尔马林固定石蜡包埋（Formalin-Fixed and Paraffin-Embedded,FFPE）组织,探索钙荧光白（Calcofluor white,CFW）荧光染色法在FFPE组织中对孢子丝菌病的诊断价值,并与之前常用特殊染色方法六胺银法（Grocott’s sliver stain,GSS）,过碘酸雪夫染色（Periodic acid schiff,PAS）法在检出率、操作步骤及结果读取程度的难易性三个方面进行对比。3、探索球形孢子丝菌感染豚鼠模型建立的方法,并比较不同浓度的球形孢子丝菌悬液及不同的皮下注射方式对豚鼠孢子丝菌病模型建立的影响,为孢子丝菌素皮内试验做前期基础。结果:1、本次收集我科就诊的2133例患者中,男性758例（35.54%）,女性1375例（64.46%）。职业中农民1750例,所占比例最大（82.04%）。春冬寒冷的季节更多见,比例为65.02%。发病区域中吉林省中部（长春、四平、吉林、辽源）1374例,所占比例最高（64.41%）。平均病程5.27±2.52月。临床表现中固定型1629例（占76.37%）,面部固定型832例,所占比例最多（51.07%）;淋巴管型501例（23.49%）,四肢淋巴管型359例,所占比例最多（71.66%）;播散型3例（0.14%）。皮损形态中,结节所占比例最大（43.55%）。组织病理检查可见不典型三区病变1802例,占84.48%;典型的三区病变331例,占15.52%。2、孢子丝菌病临床流行病学特征分析近10年与1990-2009年相比好发人群、好发季节、好发部位、临床表现等均未见明显变化;此次调查平均发病年龄为52±1岁,发病比例最高的是60岁以上;1990-2009年分析的平均发病年龄为45±1岁,发病比例最高的是51-60岁,发病年龄有增高趋势;此次平均发病病程为5.27±2.52月,1990-2009年未明确统计到平均病程,但大部分病程在2-6个月,比例79.55%,病程有延长趋势。3、通过“中国知网”、“万方数据知识平台”、“维普中文期刊全文数据库”搜索我国发表的孢子丝菌病文献,收集病例3273例;通过“Pubmed”收集病例1194例;共4467例。吉林省、黑龙江省和辽宁省发病比例居于前三位。性别明确者3986例,男性1857例,女性2129例。临床型别明确者2243例,固定型1450例,淋巴管型771例,皮肤播散型22例。241株菌株分子鉴定到种属,其中217株鉴定为球形孢子丝菌,其中长春41株,重庆37株,辽宁21株,四川19株,江西15株,北京14株,上海9株,山东9株,湖北4株,江苏6株,湖北3株,广州2株,安徽2株,内蒙古1株,河北1株,33株来源地区不明确;24株鉴定为狭义申克孢子丝菌,江西23株,湖北1株。4、100例已确诊为孢子丝菌病的FFPE组织分别进行PAS染色（简称PAS）、GSS、CFW荧光染色（简称CFW）,结果显示PAS检出31例（31%）,GSS检出40例（40%）,CFW检出74例（74%）,CFW检出率与PAS、GSS相比有统计学意义（P<0.05）;PAS与GSS检出率相比无统计学意义（P>0.05）。100例中仅有3例PAS诊断为阳性,1例银染为阳性,荧光染色为阴性,PAS+GSS+CFW的检出率为77%,单一荧光染色方法与三种染色方法共同的检出率相比无统计学意义（P>0.05）。CFW操作步骤简单,结果读取容易。5、球型孢子丝菌感染豚鼠模型建立的探索,当菌悬液浓度为1×108孢子/ml时,给予四种皮下注射方式时（实验时为排除注射体积不同导致的差异,还注射了生理盐水）,包括一次皮下注射0.1ml的菌悬液（简称方法1）;一次皮下注射0.3ml的菌悬液（简称方法2）;地塞米松连续3天皮下注射后+1次皮下注射0.1ml菌悬液（简称方法3）;一次注射0.1ml菌悬液,连续3天皮下注射（简称方法4）,方法3及方法4都可使豚鼠产生皮下结节,初起结节最大,约10天后可自行消退;提高菌悬液浓度为1×109孢子/ml时,方法2、3、4均可使豚鼠产生皮下结节。菌悬液浓度为1×109孢子/ml时,一次皮下注射0.3ml的菌悬液,豚鼠皮下结节的直径最大,但皮下结节维持时间并未延长。结论:1、孢子丝菌病在我国好发于吉林省,高发病率考虑和玉米秸秆的不当处理密切相关。吉林省孢子丝菌病男女发病比例为1:1.40,好发人群为中老年妇女,好发职业为农民,好发季节为春冬季节。临床表现以固定型多见,不同发病部位与临床型别之间有关联性,四肢相比于其他部位更容易表现为淋巴管型孢子丝菌病;皮损形态以结节多见。本次孢子丝菌病临床流行病学特征分析与吉林省1990-2009年相比好发人群、好发季节、好发部位、临床表现型别比例等均未见明显变化;而发病年龄和平均病程都有增高和延长趋势。2、我国孢子丝菌病男女发病比例为1:1.15;临床表现以固定型多见。吉林省、黑龙江省和辽宁省发病比例居于前三位。我国的孢子丝菌种属目前包括球形孢子丝菌和申克孢子丝菌;江西和湖北发现申克孢子丝菌,余发病地区均为球形孢子丝菌。3、CFW荧光染色法对孢子丝菌病诊断有非常重要的价值,该方法在人FFPE组织中孢子的检出率为74%,明显高于PAS、GSS;且在操作步骤、结果读取程度上明显优于GSS、PAS。4、球形孢子丝菌感染豚鼠的模型,给予皮下注射时皮损表现为皮下结节。当菌悬液浓度为109孢子/ml,一次皮下注射0.3ml时,豚鼠的皮下结节直径最大。皮下结节持续时间约10天,即可自行消退,提示我们如果想建立球形孢子丝菌慢性皮肤感染的豚鼠模型,可尝试采用出现皮损后给予免疫抑制或连续多次皮下注射球形孢子丝菌菌悬液。
姚蕾[3]（2020）在《球形孢子丝菌诱导THP-1巨噬细胞免疫应答的初步研究及黑素对其免疫功能的影响》文中认为孢子丝菌病（Sporotrichosis）是一种累及皮肤、皮下组织甚至内脏、骨骼等器官的深部真菌感染,病程迁延不愈,严重者可危及生命。我国东北尤其是吉林省是较为严重的流行区域之一。该病病原体为申克孢子丝菌复合体,目前已发现该复合体含7种基因型,其中主要的致病型为3种:申克孢子丝菌、巴西孢子丝菌及球形孢子丝菌,而我国的流行株以球形孢子丝菌（Sporothrix globosa）为主,且目前为止,球形孢子丝菌是我国东北地区发现的唯一基因型。但目前对于孢子丝菌病的发病机制尚未能完全明确,尤其明确其基因型的差别以后,对于我国的流行菌种球形孢子丝菌的研究极少。孢子丝菌属暗色真菌,具备合成黑素的能力,黑素是其重要的毒力因子之一,但在孢子丝菌方面的相关研究不多。为初步明确人体在感染孢子丝菌后局部的免疫应答状态、球形孢子丝菌诱发巨噬细胞免疫应答的机制以及黑素在其中的作用,本研究对吉林省孢子丝菌病患者的皮损组织进行了免疫组化及蛋白研究,体外采用球形孢子丝菌野生菌株及使用紫外线诱变法获得的相应白化菌株,研究二者刺激THP-1巨噬细胞后发生的免疫应答及其差别,并进一步探索了球形孢子丝菌诱导THP-1巨噬细胞发生免疫应答的分子调控机制。本研究第一部分收集了15例吉林省孢子丝菌病患者的皮损,与3例正常皮肤进行对照研究,对组织进行了84个真菌感染相关基因的q PCR array检测,发现孢子丝菌病患者皮损内表达增高的基因有5个,分别是STAT1、TLR2、LYN、MYD88、PYCARD;表达降低的基因有17个,分别是IL-12β、FOS、TLR9、CHIA、MBL2、IL-2、COLEC12、NPTX1、C5AR1、IL-12α、CSF2、TIRAP、IKBKB、IL-10、CARD9、IL-23α、MAPK8。经过免疫组化研究显示皮损组织内IFN-γ、TNF-α、IL-18表达增高,与正常皮肤比较有显着性差异（p<0.01）,其中IFN-γ主要在表皮表达;皮损组织内IL-1β、IL-4、IL-10未见明显表达,其中IL-1β表达与正常皮肤组织比较无统计学差异（p=0.250）,正常皮肤组织内可见IL-4、IL-10表达,与皮损组织比较有显着性差异（p<0.01）。对皮损组织的蛋白进行免疫印迹分析发现孢子丝菌病患者皮损组织TLR2表达较正常皮肤增高,而TLR4及NLRP3表达未见明显变化。说明孢子丝菌患者皮损内以Th1方向炎症反应为主,TLR2可能是介导其免疫应答的重要模式识别受体。第二部分进行了体外试验,采用的菌株经过CAL基因测序证实为球形孢子丝菌,并且该菌株序列已上传至Gen Bank（登陆号为KT008664）。利用紫外线诱变法得到了稳定的白化突变株（MEL-）,白化株不产黑素,其他性状与野生菌株（MEL+）高度相似。将MEL+、MEL-分别与THP-1巨噬细胞共培养,采用免疫荧光染色、ELISA、流式细胞术、q PCR、western blot等方法,检测THP-1巨噬细胞被菌株刺激后的免疫应答反应及模式识别受体表达情况。结果表明体外培养THP-1巨噬细胞能够吞噬球形孢子丝菌分生孢子,吞噬指数随共培养时间延长而增加,MEL+与MEL-相比较,THP-1巨噬细胞对MEL-吞噬指数大于MEL+,共培养4h时,二者吞噬指数具有显着性差异（p<0.05）。裂解吞噬了分生孢子的THP-1巨噬细胞后,将释放的孢子悬液接种SDA平板培养基,28℃培养7日后MEL+菌株可见多数菌落生长,而MEL-菌株几无生长;且MEL+菌株随共培养时间延长,菌落数量逐渐减少,说明随共培养时间延长,THP-1巨噬细胞对MEL+菌株杀伤孢子能力增强;而THP-1巨噬细胞对MEL-菌株的杀伤作用明显强于MEL+菌株。将MEL+、MEL-以及从野生株提纯出黑素颗粒分别与THP-1巨噬细胞共培养,检测THP-1巨噬细胞释放NO及ROS的水平,结果表明球形孢子丝菌分生孢子可刺激THP-1巨噬细胞释放NO及ROS,且NO释放水平随共孵育时间延长而增加,在共孵育4h时,MEL-组NO及ROS水平均显着高于MEL+组。检测球形孢子丝菌分生孢子刺激THP-1巨噬细胞分泌细胞因子的水平,结果表明THP-1巨噬细胞与MEL+分生孢子共孵育2h时,IL-6及IL-18水平显着性增高,但3h及4h时IL-18水平无显着性差异;4h时TNF-α水平显着性增高;但直至4h时IL-1β水平仍无显着性差异。THP-1巨噬细胞与MEL-分生孢子共孵育2h时,IL-6、IL-1β及IL-18水平均有显着性增高;3h时TNF-α水平也出现显着性增高。3h时,MEL-分生孢子刺激THP-1巨噬细胞分泌TNF-α及IL-18水平高于MEL+分生孢子;4h时,MEL-分生孢子刺激THP-1巨噬细胞分泌四种细胞因子水平均显着高于MEL+分生孢子。而单纯黑素对NO、ROS及细胞因子分泌均无显着性影响。实时荧光定量PCR及免疫蛋白印迹检测THP-1巨噬细胞TLR2、TLR4、NLRP3的表达,结果表明TLR2及TLR4表达增高,且TLR2表达高于TLR4,但NLRP3表达无明显变化。提示我们TLR2在巨噬细胞识别球形孢子丝菌的重要性,而黑素能够抑制THP-1巨噬细胞抵御球形孢子丝菌分生孢子的免疫效能。最后,采用si RNA方法对THP-1细胞进行TLR2分子的敲减,以验证TLR2在THP-1巨噬细胞识别球形孢子丝菌分生孢子及诱发后续炎症反应中的作用。结果表明THP-1巨噬细胞与球形孢子丝菌分生孢子共孵育4小时后,正常THP-1巨噬细胞对球形孢子丝菌分生孢子的吞噬指数为30.01±5.32,TLR2敲减的THP-1巨噬细胞对球形孢子丝菌分生孢子的吞噬指数为6.09±1.62,较正常组明显降低（p=0.00174）;正常THP-1巨噬细胞分泌TNF-α为（2475.93±245.12）pg/ml,IL-6为（743.75±55.34）pg/ml,较空白对照组显着性增高（p均<0.01）,而TLR2敲减的THP-1巨噬细胞分泌TNF-α为（1476.18±313.79）pg/ml,IL-6为（452.65±29.93）pg/ml,较空白对照组无显着性变化（p=0.951及0.068）。说明TLR2分子在识别以及介导分泌炎症因子以抵御球形孢子丝菌感染的过程中具有重要作用。本研究初步发现了孢子丝菌患者皮损内的免疫状态及差异表达基因,体外试验进一步阐明了黑素作为球形孢子丝菌的重要的毒力因子在抑制宿主免疫应答中的作用,确证了TLR2是宿主识别球形孢子丝菌的重要受体,为明确孢子丝菌病的发病机制提供了新的理论基础。
吴永卓,刘晓明,张振颖[4]（2020）在《孢子丝菌病快速诊断方法的探究》文中研究说明目的研究申克孢子丝菌DNA提取方法;探索申克孢子丝茵的种特异性引物,运用聚合酶链反应方法鉴定申克孢子丝菌;从而为临床孢子丝茵病的分子诊断奠定基础。方法用Viscozyme L酶替代液氮研磨破壁提取孢子丝菌的基因组DNA;根据申克孢子丝茵钙调蛋白基因序列设计一对寡核苷酸引物,分别对52株申克孢子丝菌及3种6株普通真茵的基因组DNA进行PCR扩增。结果用Viscozyme L酶替代液氮研磨破壁成功提取出孢子丝菌的基因组DNA。特异性引物对52株申克孢子丝菌可扩增出一条约430 bp的片段,而对念珠菌、曲霉、黑霉基因组DNA扩增结果均为阴性。结论用Viscozyme L酶替代液氮研磨破壁提取孢子丝菌基因组DNA与传统的CTAB法相比不仅操作更简便,而且避免了液氮研磨过程中难于避免的污染。运用我们所设计的特异性引物,结合PCR方法对申克孢子丝菌进行分子鉴定,结果显示不仅该引物对申克孢子丝菌特异、敏感而且该方法简便、快捷;可用于申克孢子丝菌病的临床诊断。
侴梦微,郭亚南,刘慧瑜[5]（2021）在《孢子丝菌病诊断及治疗进展》文中提出孢子丝菌病是由孢子丝菌复合体感染引起的亚急性或慢性感染性疾病,广泛分布于世界各地,特别是热带和亚热带地区。诊断的金标准为经典的菌种培养及鉴定,但其耗时较长,且结果易受杂菌影响,不利于临床的快速诊断。随着分子生物学、血清学及免疫研究的深入,涌现出一系列快速的诊断方法,如基于PCR的一系列诊断方法、酶联免疫吸附试验、孢子丝菌皮内试验等;孢子丝菌病的治疗有新进展,如传统治疗药物的新发现、治疗的新手段、新药的研究等。该文围绕孢子丝菌病诊断及治疗的进展进行综述。
暴芳芳[6]（2019）在《孢子丝菌病病因学分析及发病机理研究》文中进行了进一步梳理研究背景孢子丝菌病是由申克孢子丝菌复合体引起的深部真菌感染性疾病。该病病原体为双相真菌,在不同温度条件下可产生不同形态学特征,自然环境中以菌丝相生长,而感染人体后可适应人体37℃体温而转化为酵母相生长。孢子丝菌病除皮肤受累外,致病菌尚可进入淋巴系统并播散全身,引起多系统性损害,严重者可致患者死亡。孢子丝菌病呈全球性分布,在热带及亚热带地区最高发病率可达2.5%,我国东北地区及山东地区为孢子丝菌病的高发地带。孢子丝菌病作为一种机会性感染,由于宿主免疫状态和病原体毒力不同,机体感染孢子丝菌后临床呈不同表型:固定型、皮肤淋巴管型、皮肤播散型和皮肤外型。研究已经证实宿主的遗传素质在机体抵抗病原体感染中发挥重要作用,原发性免疫系统遗传缺陷可影响宿主的免疫状态从而导致不同的临床转归。因此,探讨宿主的遗传素质并从基因水平阐释人类不同个体间感染差异的本质成为当前研究的一个热点。已有研究证实CARD9、MBL2、M4SP2等基因缺陷与多种真菌疾病如暗色丝孢霉病、侵袭性曲霉病等易感相关,而孢子丝菌病是否与先天遗传缺陷相关尚未知。除宿主的遗传素质外,病原菌的形态、数量、毒力因素等也影响到疾病的发展及预后。既往认为申克孢子丝菌是孢子丝菌病的唯一致病菌种,然而近年来分子生物学研究发现孢子丝菌病的致病菌实际为6个菌种组成的复合体:狭义申克孢子丝菌、球形孢子丝菌、巴西孢子丝菌、卢里孢子丝菌、墨西哥孢子丝菌、白孢子丝菌,上述菌种在地理分布、致病能力、毒力强弱、临床表现、药物敏感性等方面均存在差异。明确病原菌具体型别并阐释其毒力因素等对临床疾病的诊疗及预后将有重要指导意义。而当前对我国孢子丝菌的基因分型研究甚少,且国内目前报道以球形孢子丝菌为主。因此对我国不同地区分离的孢子丝菌进行基因分型有助于了解我国孢子丝菌病病原菌的现状,进一步阐释不同型别的致病菌在疾病发生发展中的作用机理,这对临床诊治具有重要意义。基于以上研究背景,本研究主要分以下三部分进行:第一部分61例孢子丝菌病临床特征分析目的分析本院61例孢子丝菌病临床资料,总结该病临床特征。方法回顾性分析本院2015-2017年经真菌培养确诊为孢子丝菌病的患者临床资料,共计61例。统计分析临床特征,包括患者性别、年龄、居住地、发病季节及病程、外伤史、疾病类型及部位、治疗以及真菌检查和病理检查结果。结果61例患者中男性39例（64%）,女性22例（36%）,年龄分布从31-87岁不等,平均年龄62.81岁;发病季节多见于冬春季节,病程平均2.5月;有明确外伤史者21例（34%）;临床分型为固定型35例（57%）,皮肤淋巴管型21例（35%）,皮肤播散型5例（8%）;皮损分布部位从多到少依次为面部23例（38%）,手部17例（28%）,上肢15例（24%）,四肢及背部1例（2%）,面部及下肢1例（2%）,下肢4例（6%）;平均疗程3个月;5例（8%）真菌直接镜检见孢子,33（54%）例组织病理中见真菌孢子,28（46%）例组织病理未见真菌结构呈感染性肉芽肿改变。结论61例孢子丝菌病患者均来自山东地区,临床特征为冬春高发,中老年男性易感且以面部、上肢等暴露部位多见,临床分型以固定型及皮肤淋巴管型多见。第二部分 宿主先天免疫相关基因缺陷及功能研究目的探讨CARD9、MBL2、MASP2基因与孢子丝菌病的相关性,并对发现的遗传基因缺陷进行功能实验验证。方法对61例孢子丝菌病患者及300例非孢子丝菌病患者的外周血提取DNA,采用Sanger测序方法对CARD9、MBL2、MASP2基因进行PCR扩增及测序。统计样本中的基因突变情况,运用费舍尔精确检验分析比较病例组与对照组之间基因变异差异。运用免疫组化及酶联免疫吸附试验（ELISA）分别在病例及对照中对以上基因表达差异进行初步分析。结果CARD9测序结果显示在3名患者中分别发现3个不同的突变位点:c.25G>A（p.Glu9Lys）,c.820821insG（p.Asp274Glyfs）,c.1118G>C（p.Arg373Pro）,其中c.25G>A为本研究发现的新发基因突变。患者中的变异携带率4.9%（3/61）明显高于本研究中对照人群0%（0/300,P=4.63×10-3,Fisher’s exact test）和东亚人群0.09%（4/4291,Exome Aggregation Consortium database,P=8.81×10-5,Fisher’s exact test）。MASP2基因测序结果显示在1名患者4号外显子发现1个罕见突变位点:c.477478insTGCCACAACCAC（CHNH156159）,而在另外匹配的300例对照中（0/300,P=0.169,Fisher’s exact test）和东亚人群（0/4290,Exome Aggregation Consortium database,P=0.014,Fisher’s exact test）未检测到以上突变位点。此外MASP2中c.464 A>G（p.H155R）、c.1111 G>T（p.D371Y）、c.1130 T>C（p.V377A）、c.1479 C>T（p.S493=）以及MBL2基因中c.161G>A（p.G54D）在病例与对照中无显着性差异（P>0.05,Fisher’s Test）。免疫组化结果:与对照相比,CARD9在病例组皮肤组织中高表达,病例组中突变者与未突变者中均有高表达。ELISA结果:MBL和MASP2在病例组血清含量低于对照组血清含量,表达有显着性差异（分别为平均值304 vs 365 ng/ml P=0.002;平均值244 vs 396 ng/ml P=0.022,T test）,MASP2突变未影响蛋白表达。结论孢子丝菌病患者群体中CARD9基因及MASP2基因变异率高于对照人群。初步研究显示基因突变未影响蛋白的表达,但突变是否影响蛋白的功能需要进一步实验探索。第三部分 致病菌表型特征、基因分型及药物敏感性研究目的对致病菌进行表型特征、基因分型及体外药物敏感性试验,明确山东地区孢子丝菌病致病菌的菌种类型并为临床用药提供指导。方法（1）菌株形态学鉴定及碳源同化实验:对所有分离菌株接种于沙堡弱培养基（SDA）27℃,并接种脑心浸液琼脂培养基（BHI）37℃,进行双相观察,同时通过酵母氮源基础（YNB）液体培养基检测不同菌株对3种糖（葡萄糖,蔗糖和棉子糖）的同化作用。（2）菌株基因分型:临床分离出的61株孢子丝菌提取菌株DNA,运用Sanger测序方法进行序列分析。利用核糖体内部转录间隔区（ITS）、钙调蛋白（CAL）、部分微管蛋白（β-tubulin）基因序列通用引物进行PCR,并将PCR产物进行电泳跑胶,纯化后上机测序,将测序结果在NCBI数据库及CBS数据库进行比对,应用MEGA5.0分子进化分析软件构建进化树。（3）体外药敏试验:对分离的61株孢子丝菌分别转种马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基和BHI培养基获得菌丝相和酵母相菌落,比较两种生物学形态的孢子丝菌的体外药物敏感性差别。采用SensititreTM YeastOneTM药敏板、微量液基稀释法检测菌丝相和酵母相孢子丝菌对临床常用抗真菌药物伊曲康唑、两性霉素B、伏立康唑、泊沙康唑、氟康唑、5-氟胞嘧啶、卡泊芬净、米卡芬净、阿尼芬净和特比萘芬的体外敏感性,统计菌丝相及酵母相最低抑菌浓度（MIC）值,计算几何均数（GM）、MIC50、MIC90,应用SPSS 19.0软件对MIC值进行非参数秩和检验,P<0.05认为差异有统计学意义。结果61株孢子丝菌均可进行双相转化,均可同化葡萄糖和蔗糖,不能同化棉子糖。经测序比对及构建进化树分析,61株菌株均为球形孢子丝菌。经体外药敏试验显示本院临床分离的孢子丝菌菌株菌丝相及酵母相均对特比萘芬最敏感,其次是伊曲康唑,对氟康唑敏感性最差。同一菌株的酵母相与菌丝相相比,对伊曲康唑、特比萘芬、泊沙康唑、伏立康唑、阿尼芬净、米卡芬净、卡泊芬净、5-氟胞嘧啶敏感性更强（P<0.05）,而氟康唑、两性霉素B对菌丝相及酵母相的差异不明显。结论本院临床分离的孢子丝菌菌株均为球形孢子丝菌,菌丝相及酵母相均对特比萘芬最敏感,其次是伊曲康唑,对氟康唑敏感性最差。同一菌株的酵母相与菌丝相相比,酵母相敏感性更强。
张明瑞,杨鑫,赵飞,吕莎,龚杰,周盈,李福秋[7]（2019）在《孢子丝菌复合体分子分型研究进展》文中进行了进一步梳理孢子丝菌复合体属于双相真菌,全球分布,可引起人类及动物的慢性深部感染。不同地域的菌株在致病力、传播途径及药物敏感性等方面均存在差异。孢子丝菌病作为一种人兽共患病,其发病率逐年上升,出现多次暴发流行。分子分型不仅是明确感染源和传播途径、预防和控制疾病流行的有力手段,同时有助于了解孢子丝菌基因型与表型的相关性,在研究其致病机制以及临床诊治过程中都具有十分重要的意义。本文对孢子丝菌的分子分型方法的研究进行综述。
张明瑞[8]（2019）在《我国部分地区孢子丝菌群体遗传学分析及分子诊断》文中研究指明背景:孢子丝菌复合体是全球分布的双相真菌,主要包含6个亲缘种,其中球形孢子丝菌、申克孢子丝菌以及巴西孢子丝菌为主要的临床致病菌。不同的种在地域分布、致病力、传播途径等方面均存在一定的差异。孢子丝菌通过侵袭皮肤、皮下组织及附近淋巴系统,导致人类和其他动物的慢性感染,引起孢子丝菌病,其临床表现多样,严重程度不一。孢子丝菌病的临床诊断主要通过真菌培养及组织病理学检查。目前,一些基于核酸扩增技术的分子生物学方法逐渐应用于孢子丝菌病的诊断,但仍存在耗时长、灵敏度低、操作复杂等缺点。研究表明,孢子丝菌病的发病率逐年上升,引起众多研究学者的关注。我国东北地区是孢子丝菌病的高发地区,几乎全部由球形孢子丝菌引起。球形孢子丝菌遗传差异小,常规方法难以进行种内区分,其群体遗传结构尚未阐明。为了解析我国球形孢子丝菌的遗传多态性,弥补孢子丝菌临床快速诊断方面的不足,本研究拟采用具有高分辨能力的微卫星长度多态性分型技术对我国球形孢子丝菌群体遗传结构进行分析,并建立孢子丝菌实时荧光PCR检测方法,希望为孢子丝菌流行病学监控及快速诊断提供有力的工具。方法:1、球形孢子丝菌群体遗传学分析（1）收集来自中国不同地区的球形孢子丝菌120株并进行鉴定。（2）基于球形孢子丝菌基因组测序结果,分离微卫星座位并设计引物。（3）通过梯度PCR明确每个微卫星标记的最佳扩增条件。检测部分样品,筛选出具有遗传多态性的微卫星标记。（4）运用优化后的标记及反应条件检测120个临床分离株,通过生物信息学软件分析数据。2、球形孢子丝菌实时荧光PCR检测方法的建立及初步评价（1）比对NCBI数据库中所有孢子丝菌内转录间隔区序列,设计引物及探针。（2）优化反应体系。（3）通过球形孢子丝菌、其他常见致病真菌、细菌以及人类基因组DNA进行特异性、敏感性、最低检测限的检测,构建标准曲线。（4）通过球形孢子丝菌感染的临床标本评估检测能力。3、孢子丝菌病多重实时荧光PCR诊断方法的建立及初步评价（1）比对NCBI数据库中所有孢子丝菌钙调蛋白序列,设计引物及探针。（2）优化反应体系。（3）通过球形孢子丝菌、申克孢子丝菌、巴西孢子丝菌、其他常见致病真菌、细菌以及人类基因组DNA进行特异性、敏感性检测。（4）通过标准浓度的阳性质粒进行最低检测限的检测,构建标准曲线。（5）通过单一荧光及多重荧光、单一样本及混合样本的比较;临床标本及模拟感染样本,对多重实时荧光PCR检测体系进行评估。结果:1、球形孢子丝菌基因组中发现200个微卫星位点,其中10个位点能够稳定扩增。每个基因座的等位基因数量范围为3到13,平均值为5.50,中等PIC值为0.441,10个位点的累积鉴别能力为1.0000。STRUCTURE分析确定最佳的K值为3,即呈出三个不同谱系。长春菌株在三个谱系中均有发现,大连和重庆的菌株只发现两个谱系。谱系II包含三个地区的菌株。引起固定型和淋巴型的菌株,三个谱系中均有分布。由于标本量不足,无法明确引起播散型孢子丝菌病的菌株群体的状况。PCo A分析支持STRUCTURE分析的结果,表明球形孢子丝菌的种群分为三个谱系。AMOVA结果表明,按照地域分布划分的组比按临床类型划分的组遗传变异更显着。2、球形孢子丝菌实时荧光PCR检测方法灵敏度及特异性均为100%,检测下限10fg,30例临床标本检测阳性率为100%,Ct值34.3-39.24。3、孢子丝菌病多重实时荧光PCR诊断方法对于球形孢子丝菌、申克孢子丝菌、巴西孢子丝菌灵敏度及特异性均为100%,检测下限分别为10、10、100 copies。在相同模板量和反应条件下,单重实时荧光PCR的Ct值为21.67±0.15、24.64±0.15、27.00±0.11,多重实时荧光PCR的Ct值分别为21.80±0.07、24.77±0.07、27.32±0.08。在不同比例模板混合下,能够对相应的模板进行检测。33例临床确诊标本中,培养、普通PCR以及本研究的多重实时荧光PCR的阳性率分别为87.9%（29/33）、39.4%（13/33）、93.9%（31/33）。多重实时荧光PCR与培养检测阳性率差异不具有统计学意义（χ2,p=0.4142）,与特异性引物PCR检测阳性率具有统计学意义（χ2,p<0.0001）。模拟标本检测阳性率均为100%,Ct值分别为33.03-38.57及30.23-34.84。结论:1、球形孢子丝菌种内遗传多态性较低,本研究提供了一套多态性较高的微卫星标记,将球形孢子丝菌分为三个谱系。2、长春地区种群结构多态性较高;谱系II的遗传多态性最高。3、通过微卫星分子分型显示,球形孢子丝菌遗传多态性与地域分布具有一定相关性,尚未发现三个谱系与临床类型的相关性。4、球形孢子丝菌实时荧光PCR检测方法灵敏度及特异性均为100%,检测下限10fg,能够检测球形孢子丝菌感染组织,阳性率100%。5、多重实时荧光PCR检测方法灵敏度及特异性均为100%,对于球形孢子丝菌、申克孢子丝菌、巴西孢子丝菌检测下限分别为10、10、100 copies,能够对组织中病原菌进行特异性检测,可同时检测混合感染。
杨伟利[9]（2019）在《球形孢子丝菌致1例皮肤淋巴管型孢子丝菌病临床及相关实验室研究》文中研究表明报道由球形孢子丝菌所致皮肤淋巴管型孢子丝菌病1例临床及相关实验室研究。患者,男,48岁,菜农。右侧手背及前臂起皮疹,无痛痒1月余。查体:右侧手背及前臂可见数个红色丘疹、结节和溃疡,呈线状分布。对脓液进行真菌镜检和革兰氏染色均为阴性。皮损病理呈感染性肉芽肿改变。根据真菌试管培养、玻片培养和分子生物学鉴定为球形孢子丝菌。扫描电镜可见分生孢子梗侧生或顶生分生孢子,孤立、直立生长;合轴产孢,全壁芽生孢子在基底部产生横隔,脱落后遗留有齿状突起。诊断:皮肤淋巴管型孢子丝菌病。予患者口服伊曲康唑联合特比萘芬,外用卢立康唑乳膏,治疗2个月后明显好转。孢子丝菌病是由孢子丝菌复合体感染皮肤、皮下组织、黏膜和局部淋巴系统,甚至全身播散、累及各个系统的慢性感染性疾病。皮肤型孢子丝菌病患者发病前多有外伤史。淋巴管型是皮肤型中最常见的类型,典型表现为接种部位出现的结节、溃疡和在沿淋巴管向心性出现线状排列的类似皮疹。本病根据临床表现和实验室检查可诊断,其中真菌培养是诊断的金标准。扫描电镜可观察到菌体的微观结构。分子生物学技术为准确而快速鉴定菌种提供了新的方法。目前,对孢子丝菌病的治疗主要为药物治疗,包括伊曲康唑、特比萘芬、碘化钾及两性霉素B等,其中伊曲康唑是治疗皮肤型孢子丝菌病的首选药物。药物联合治疗具有协同抗菌作用,适用于单一药物治疗效果不佳者。
赵莉佩[10]（2017）在《中国不同地区球形孢子丝菌临床分离株的扩增片段长度多态性分析及表型特征研究》文中研究表明背景:孢子丝菌病是由双相型真菌申克孢子丝菌复合体（Sporothrix schenckii complex）感染引起的常见深部真菌病,在世界各地广泛流行,可累及皮肤甚至造成系统性感染,迁延不愈。最近分子生物学研究发现申克孢子丝菌是由6个亲缘种构成的复合体,包括狭义的申克孢子丝菌（Sporothrix schenckii sensu stricto）、巴西孢子丝菌（Sporothrix brasiliensis）、球形孢子丝菌（Sporothrix globosa）、卢艾里孢子丝菌（Sporothrix luriei）、墨西哥孢子丝菌（Sporothrix mexicana）和苍白球孢子丝菌（Sporothrix pallida）。球形孢子丝菌是我国孢子丝菌病的主要优势菌种,然而我国不同地区来源的临床菌株表型仍存在差异,且部分研究表明存在一定的遗传变异性,因此深入研究球形孢子丝菌是否存在基因型、表型特征、药物敏感性等的差异具有重要意义。目的:对我国不同地区孢子丝菌病的临床分离株进行种系发生分析及表型特征分析,利用扩增片段长度多态性（Amplified fragment length polymorphism,AFLP）研究我国不同地区来源的球形孢子丝菌临床分离株基因多态性,并探讨其与临床分型、地理来源、药物敏感性及菌株生长速度的相关性。方法:1.收集2009年至2013年来自中国8个不同省市孢子丝菌病的225株临床分离株及患者临床资料。对所有临床分离株的钙调蛋白（CAL）基因片段进行扩增并测序,将CAL序列上传至Genbank数据库进行比对,利用MEGA 6.0软件,采用Neighbor-Joining法进行系统进化分析构建种系发生树。2.通过限制性内切酶组合Eco RⅠ和Saq AⅠ,对AFLP分析中各实验步骤进行优化,并用64对引物进行筛选,选取1对DNA多态性较好的引物;采用优化后的AFLP反应体系,对225株临床分离株进行AFLP分析,利用NTSYS-pc version 2.10对结果进行聚类分析。3.将225株临床分离株接种于马铃薯琼脂培养基（PDA）中,分别置于30℃、35℃和37℃温箱中,于7天、14天、21天分别观察菌落直径,计算生长速度;同时将临床分离株进行碳源同化实验。4.参照Clinical and Laboratory Standards Institute（CLSI）颁布的微量液基稀释法M38-A2方案,选用临床分离株的菌丝相,对来源于不同AFLP基因型别,分别包括Ⅰ型（n=10）、Ⅱ型（n=10）,Ⅲ型（n=2）、Ⅳ型（n=9）、Ⅴ型（n=4）、Ⅵ型（n=2）、Ⅶ型（n=3）、Ⅷ型（n=3）,共43株临床分离株进行体外药物敏感性实验,检测的抗真菌药物包括氟康唑、伊曲康唑、伏立康唑、特比萘芬、两性霉素B、泊沙康唑、卡泊芬净、阿巴康唑。结果:1.建立球形孢子丝菌AFLP反应的最佳体系:约1000ng模板DNA经限制性内切酶Fast Digest Eco RⅠ与Fast Digest Saq AⅠ（各1U）,37℃酶切5min;取8μl酶切液加入1μl Eco RⅠ接头、1μl Saq AⅠ接头、T4DNA连接酶2.5U,25℃连接1h;20μl扩增体系,取稀释20倍的连接产物5μl,加入Mg2+2m M、Taq酶1U、d NTPs 0.2m M each、引物0.1μM;20μl扩增体系,取稀释20倍的预扩增产物5μl,加入Mg2+1m M、Taq酶1.5U、d NTPs 0.15m M each、引物0.06μM。选择性扩增引物采用E4:GACTGCGTACCAATTCACT,M1:GATGAGTCCTGAGTAACAA效果较好。2.通过对225株临床分离株的CAL基因序列鉴定,结果显示所有菌株均为球形孢子丝菌,系统进化树显示各地区的球形孢子丝菌可分为3个Subgroup（命名为globosaⅠ,globosaⅡ,globosaⅢ）,globosaⅠ最常见,首次发现globosaⅢ。AFLP聚类分析可得到8个区分明显的型别（命名为I至Ⅷ）,其中Ⅰ型（23%）、Ⅱ型（41%）和Ⅳ型（22%）最为常见。来自长春的临床分离株主要分为Ⅱ型（35/60）和Ⅳ型（25/60）,四平的临床分离株主要聚类于Ⅱ型（23/31）,吉林市的临床分离株（18/20）和白城的临床分离株（12/13）以Ⅰ型为主,Ⅲ型（n=2）和Ⅷ型（n=3）全部为松原的临床分离株。AFLP基因分型和地理来源之间存在一定的相关性,但并未发现与临床分型的相关性。3.所有球形孢子丝菌在PDA上于30℃培养21天后,菌落直径达1642mm,于35℃培养21天后,菌落直径达315mm,而大部分临床分离株（218/225）在37℃呈限制性生长（菌落直径达1.55.5mm）,少数（7/225）不能生长;所有球形孢子丝菌临床分离株均能同化蔗糖不能同化棉子糖;对于球形孢子丝菌的菌丝相,特比萘芬表现最好的抗真菌活性,MIC值为0.038μg/ml,GM值为0.05μg/ml;其次为泊沙康唑、阿巴康唑、卡泊芬净,MIC值分别为0.5>16μg/ml、416μg/ml、0.25>16μg/ml,GM值分别为2.99μg/ml、8.26μg/ml、9.55μg/ml;而伊曲康唑、伏立康唑、两性霉素B、氟康唑的MIC值均较高,分别为1>16μg/ml、8>16μg/ml、>16μg/ml、>64μg/ml。统计学分析显示,每种抗真菌药对不同临床分型、不同基因型别、不同地理来源的球形孢子丝菌的MIC值无明显差异。结论:1.球形孢子丝菌为我国孢子丝菌病的主要致病菌种。2.在种系发生上,球形孢子丝菌可进一步分为3个亚组。我国globosaⅠ最常见,首次发现globosaⅢ。3.采用AFLP方法,利用Eco RⅠ-ACT/Saq AⅠ-CAA引物可将球形孢子丝菌分为8个主要基因型别。孢子丝菌病的临床分型与AFLP基因分型无相关性。4.中国南北区域的球形孢子丝菌AFLP基因分型有明显的地域分布特征,其中吉林省的基因分型与省内城市分布有一定的相关性。5.大部分球形孢子丝菌在37℃呈限制性生长,仅有少数不能生长;球形孢子丝菌能同化蔗糖,不能同化棉子糖;八种抗真菌药物中,特比萘芬的抗真菌活性最高,其次为泊沙康唑、阿巴康唑、卡泊芬净,而伊曲康唑、伏立康唑、两性霉素B、氟康唑的MIC值均较高。球形孢子丝菌对药物的敏感性与孢子丝菌病致病的临床分型、菌株的基因分型、地理来源无关。
二、应用PCR-RFLP进行申克孢子丝菌的分子生物学鉴定（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、应用PCR-RFLP进行申克孢子丝菌的分子生物学鉴定（论文提纲范文）
（1）5-氨基酮戊酸光动力对球形孢子丝菌杀伤作用的体外研究及碘化钾对其杀伤效果的影响（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 中英文缩略词对照表 |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 孢子丝菌病的研究现状 |
| 1.1.1 孢子丝菌病的病原体研究 |
| 1.1.2 孢子丝菌的黑素研究 |
| 1.1.3 孢子丝菌病的传播及流行 |
| 1.1.4 孢子丝菌病的治疗 |
| 1.2 光动力治疗的研究进展 |
| 1.2.1 光动力治疗的历史和起源 |
| 1.2.2 光动力治疗的机制研究 |
| 1.2.3 光敏剂 |
| 1.2.4 光源 |
| 1.2.5 临床应用 |
| 1.2.8 总结和展望 |
| 第2章 威伐光、红光、LED光对球形孢子丝菌的杀伤及黑素的保护作用 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料与试剂 |
| 2.2.1 主要仪器与设备 |
| 2.2.2 主要试剂与配制方法 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 PDA斜面培养基的配制 |
| 2.3.2 PDA平皿培养基的配制 |
| 2.3.3 含三环唑的PDA斜面培养基和平皿的制备 |
| 2.3.4 菌株及培养条件 |
| 2.3.5 菌丝相孢子悬液的制备 |
| 2.3.6 光源的准备 |
| 2.3.7 威伐光、红光及LED光对球形孢子丝菌Mel+的杀伤效果 |
| 2.3.8 黑素的保护作用 |
| 2.3.9 统计分析 |
| 2.4 实验结果 |
| 2.4.1 威伐光、红光和LED光对Mel+的杀伤作用 |
| 2.4.2 在威伐光、红光及LED光照射过程中黑素对菌株的保护作用 |
| 2.5 讨论 |
| 2.6 小结 |
| 第3章 5-氨基酮戊酸光动力对球形孢子菌的杀伤效果 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料与试剂 |
| 3.2.1 主要仪器与设备 |
| 3.2.2 主要试剂及配制方法 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 SDA斜面培养基的配制 |
| 3.3.2 BHI琼脂斜面培养基的配制 |
| 3.3.3 光敏剂 |
| 3.3.4 光源的准备 |
| 3.3.5 菌株与培养条件 |
| 3.3.6 球形孢子丝菌菌丝相孢子和酵母细胞的制备 |
| 3.3.7 不同剂量ALA-PDT对球形孢子丝菌菌丝相及酵母相杀伤效果的评价 |
| 3.3.8 ALA-PDT对球形孢子丝菌及参考菌株的杀伤效果评价 |
| 3.3.9 在ALA-PDT过程中黑素的保护作用 |
| 3.3.10 安全性评价 |
| 3.3.11 统计分析 |
| 3.4 实验结果 |
| 3.4.1 ALA-PDT对球形孢子丝菌菌丝相分生孢子的杀伤作用 |
| 3.4.2 ALA-PDT对 Mel+菌株酵母细胞的杀伤作用 |
| 3.4.3 ALA-PDT对球形孢子丝菌临床菌株菌丝相分生孢子和酵母相及参考菌株的杀伤作用评价 |
| 3.4.4 在ALA-PDT过程中黑素对Mel+分生孢子的保护作用 |
| 3.4.5 ALA-PDT的安全性评价 |
| 3.5 讨论 |
| 3.6 小结 |
| 第4章 5-氨基酮戊酸光动力杀伤球形孢子丝菌机制的研究 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验材料与试剂 |
| 4.2.1 主要仪器与设备 |
| 4.2.2 主要试剂与配制方法 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 光动力过程中ROS产量的检测 |
| 4.3.2 光动力过程中NAC的保护作用 |
| 4.3.3 扫描电镜 |
| 4.3.4 透射电镜 |
| 4.3.5 彗星实验 |
| 4.3.6 统计分析 |
| 4.4 实验结果 |
| 4.4.1 ALA-PDT后 Mel+分生孢子ROS生成水平 |
| 4.4.2 ALA-PDT处理后Mel+分生孢子超微结构的改变 |
| 4.4.3 彗星实验 |
| 4.5 讨论 |
| 4.6 小结 |
| 第5章 碘化钾对5-氨基酮戊酸光动力的增强效果研究 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 实验材料和试剂 |
| 5.2.1 主要仪器与设备 |
| 5.2.2 主要试剂 |
| 5.3 实验方法 |
| 5.3.1 ALA的配制及光源的准备 |
| 5.3.2 KI的配制 |
| 5.3.3 KI对 ALA-PDT杀伤球形孢子丝菌效果的影响 |
| 5.3.4 KI添加顺序对ALA-PDT效果的影响 |
| 5.3.5 KI浓度对ALA-PDT杀伤效果的影响 |
| 5.3.6 KI对 ALA-PDT过程中ROS生成的影响 |
| 5.3.7 KI对 ALA-PDT杀伤其他球形孢子丝菌临床菌株效果的影响 |
| 5.3.8 统计分析 |
| 5.4 实验结果 |
| 5.4.1 KI对 ALA-PDT的影响 |
| 5.4.2 KI添加顺序对ALA-PDT的影响 |
| 5.4.3 KI浓度对ALA-PDT的影响 |
| 5.4.4 KI对 ALA-PDT过程中ROS生成的影响 |
| 5.4.5 KI对 ALA-PDT杀伤其他球形孢子丝菌临床菌株效果的影响 |
| 5.5 讨论 |
| 5.6 小结 |
| 第6章 结论 |
| 参考文献 |
| 作者简介及在学期间所取得的科研成果 |
| 致谢 |
（2）孢子丝菌病临床流行病学特征分析和诊断方法的探索（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 中英文缩略词对照表 |
| 第一章 综述—孢子丝菌病的研究进展 |
| 1.1 前言 |
| 1.2 病原体 |
| 1.3 流行病学 |
| 1.3.1 孢子丝菌病分布地区 |
| 1.3.2 孢子丝菌病原体的分布 |
| 1.3.3 传播方式 |
| 1.3.4 住院率与死亡率 |
| 1.4 临床表现 |
| 1.4.1 临床表现类似于其他疾病的孢子丝菌病 |
| 1.4.2 特殊部位的孢子丝菌病 |
| 1.4.3 系统型孢子丝菌病 |
| 1.5 诊断 |
| 1.5.1 诊断方法 |
| 1.5.2 孢子丝菌病诊断方法的适用途径 |
| 1.6 孢子丝菌病的治疗 |
| 1.6.1 系统药物治疗 |
| 1.6.2 辅助治疗 |
| 1.6.3 病原菌抗真菌药物敏感性的研究 |
| 1.6.4 新的抗真菌药物的研发 |
| 1.6.5 治疗评价 |
| 1.7 孢子丝菌的免疫机制 |
| 1.7.1 孢子丝菌的致病毒力 |
| 1.7.2 宿主免疫 |
| 1.7.3 疫苗 |
| 1.8 总结 |
| 第二章 孢子丝菌病临床流行病学特征分析 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 吉林省孢子丝菌病临床流行病学特征分析 |
| 2.2.1 材料与方法 |
| 2.2.2 结果 |
| 2.3 我国孢子丝菌病临床流行病学特征 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 结论 |
| 第三章 CFW荧光染色法在FFPE组织中对孢子丝菌病的诊断价值探索 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 实验材料 |
| 3.2.1 主要仪器和设备 |
| 3.2.2 主要试剂 |
| 3.2.3 组织切片 |
| 3.3 试验方法 |
| 3.3.1 切片 |
| 3.3.2 染色 |
| 3.4 实验结果 |
| 3.4.1 不同染色方法的结果检出率及分析 |
| 3.4.2 PAS、GSS、CFW染色方法的对比 |
| 3.5 讨论 |
| 3.6 结论 |
| 第四章 球形孢子丝菌感染豚鼠模型建立的探索 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 实验材料 |
| 4.2.1 实验菌株来源 |
| 4.2.2 实验动物来源 |
| 4.2.3 实验主要仪器设备 |
| 4.2.4 实验主要试剂和药物 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 培养基的制作 |
| 4.3.2 菌种鉴定 |
| 4.3.3 真菌转种培养 |
| 4.3.4 菌悬液的制备 |
| 4.3.5 实验动物的分组及动物模型的建立 |
| 4.3.6 临床观察及统计学方法 |
| 4.3.7 病理切片的制作 |
| 4.3.8 真菌培养 |
| 4.4 实验结果 |
| 4.4.1 菌株鉴定结果 |
| 4.4.2 动物模型的建立 |
| 4.4.3 组织病理检查 |
| 4.4.4 真菌培养 |
| 4.5 讨论 |
| 4.6 结论 |
| 第五章 结论 |
| 5.1 主要结论 |
| 5.2 创新点及不足 |
| 5.3 展望 |
| 参考文献 |
| 作者简介及在学期间所取得的科研成果 |
| 致谢 |
（3）球形孢子丝菌诱导THP-1巨噬细胞免疫应答的初步研究及黑素对其免疫功能的影响（论文提纲范文）
| 前言 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 孢子丝菌病及其病原体——申克孢子丝菌复合体 |
| 1.2 中国及吉林省孢子丝菌病近况 |
| 1.3 孢子丝菌的毒力因素研究现状 |
| 1.3.1 双相性 |
| 1.3.2 耐热性 |
| 1.3.3 蛋白酶 |
| 1.3.4 细胞壁表面成分 |
| 1.3.5 黑素 |
| 1.4 机体抗孢子丝菌免疫研究现状 |
| 第2章 孢子丝菌病患者皮损免疫状态的初步研究 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料和试剂 |
| 2.2.1 主要仪器设备 |
| 2.2.2 主要试剂 |
| 2.3 临床标本 |
| 2.4 实验方法 |
| 2.4.1 实时荧光定量PCR检测相关基因表达分布 |
| 2.4.2 免疫组化染色 |
| 2.4.3 免疫蛋白印迹 |
| 2.4.4 统计分析 |
| 2.5 实验结果 |
| 2.5.1 临床标本来源 |
| 2.5.2 孢子丝菌病患者皮损内真菌感染相关基因表达情况 |
| 2.5.3 皮损内相关炎性因子的免疫组化 |
| 2.5.4 皮损内相关模式识别受体蛋白表达情况 |
| 2.6 讨论 |
| 2.7 总结 |
| 第3章 THP-1 巨噬细胞抗球形孢子丝菌的免疫机制及黑素对其功能的影响 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料和试剂 |
| 3.2.1 主要仪器设备 |
| 3.2.2 主要试剂 |
| 3.2.3 主要培养基的配制 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 THP-1 细胞复苏及培养 |
| 3.3.2 PMA诱导THP-1 分化为巨噬细胞 |
| 3.3.3 菌株 |
| 3.3.4 突变菌株的鉴定 |
| 3.3.5 分生孢子悬液的制备 |
| 3.3.6 孢子丝菌黑素颗粒的制备 |
| 3.3.7 THP-1 巨噬细胞对分生孢子吞噬及杀伤效应 |
| 3.3.8 流式细胞术检测THP-1 巨噬细胞内ROS水平 |
| 3.3.9 NO试剂盒检测THP-1 巨噬细胞NO水平 |
| 3.3.10 ELISA试剂盒检测THP-1 巨噬细胞分泌细胞因子水平 |
| 3.3.11 实时荧光定量PCR检测THP-1 巨噬细胞TLR2、TLR4、NLRP3的表达 |
| 3.3.12 免疫蛋白印迹检测THP-1 巨噬细胞TLR2、TLR4、NLRP3蛋白表达情况 |
| 3.3.13 统计分析 |
| 3.4 结果 |
| 3.4.1 PMA诱导THP-1 分化为巨噬细胞 |
| 3.4.2 突变白化菌株(MEL-)的鉴定 |
| 3.4.3 THP-1 巨噬细胞对分生孢子的吞噬效应 |
| 3.4.4 THP-1 巨噬细胞对分生孢子的杀伤效应 |
| 3.4.5 THP-1 巨噬细胞与球形孢子丝菌共孵育后细胞内ROS水平 |
| 3.4.6 THP-1 巨噬细胞与球形孢子丝菌共孵育后释放NO水平 |
| 3.4.7 THP-1 巨噬细胞分泌细胞因子水平 |
| 3.4.8 实时荧光定量PCR检测THP-1 巨噬细胞TLR2、TLR4、NLRP3的表达 |
| 3.4.9 免疫蛋白印迹检测THP-1 巨噬细胞TLR2、TLR4、NLRP3蛋白表达情况 |
| 3.5 讨论 |
| 3.6 总结 |
| 第4章 THP-1 巨噬细胞TLR2在球形孢子丝菌感染免疫中的作用机制 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验材料和试剂 |
| 4.2.1 主要仪器设备 |
| 4.2.2 主要试剂及抗体 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 THP-1 细胞转染 |
| 4.3.2 分生孢子悬液的制备 |
| 4.3.3 THP-1 巨噬细胞的吞噬效应 |
| 4.3.4 ELISA试剂盒检测THP-1 巨噬细胞分泌细胞因子水平 |
| 4.3.5 统计分析 |
| 4.4 结果 |
| 4.4.1 siRNA干扰技术建立TLR2低表达的THP-1 巨噬细胞模型 |
| 4.4.2 TLR2敲减后THP-1 巨噬细胞对球形孢子丝菌吞噬指数的变化 |
| 4.4.3 TLR2对THP-1 巨噬细胞感染球形孢子丝菌后分泌TNF-α及IL-6 的影响 |
| 4.5 讨论 |
| 4.6 总结 |
| 第5章 结论 |
| 5.1 结论 |
| 5.2 本研究的创新点包括 |
| 参考文献 |
| 作者简介及在学期间所取得的科研成果 |
| 致谢 |
（4）孢子丝菌病快速诊断方法的探究（论文提纲范文）
| 1 材料和方法 |
| 1.1 研究对象 |
| 1.2 主要试剂及来源 |
| 1.3 真菌培养与DNA提取 |
| 1.4 PCR扩增 |
| 2 结 果 |
| 3 讨 论 |
（5）孢子丝菌病诊断及治疗进展（论文提纲范文）
| 1 诊断 |
| 1.1 分子生物学 |
| 1.1.1 RCA |
| 1.1.2 T3B指纹识别 |
| 1.1.3 多重实时荧光定量PCR |
| 1.2 血清学 |
| 1.3 免疫学测试 |
| 2 治疗 |
| 2.1 药物 |
| 2.1.1 伊曲康唑 |
| 2.1.2 特比萘芬 |
| 2.1.3 碘化钾 |
| 2.1.4两性霉素B |
| 2.1.5 新药的研究 |
| 2.2 辅助治疗 |
| 2.2.1 温热疗法 |
| 2.2.2 冷冻 |
| 2.2.3光动力 |
| 2.2.4 外科手术 |
| 2.2.5 电外科 |
| 3 总结与展望 |
（6）孢子丝菌病病因学分析及发病机理研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 符号说明 |
| 前言 |
| 第一部分 61例孢子丝菌病临床特征分析 |
| 1.研究目的 |
| 2.研究方法 |
| 3.研究结果 |
| 4.研究结论 |
| 第二部分 宿主先天免疫相关基因缺陷及功能研究 |
| 1.研究目的 |
| 2.研究方法 |
| 3.研究结果 |
| 4.研究结论 |
| 第三部分 致病菌表型特征、基因分型及药物敏感性研究 |
| 1.研究目的 |
| 2.研究方法 |
| 3.研究结果 |
| 4.研究结论 |
| 讨论 |
| 总结与展望 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的论文 |
| 英文论文1 |
| 英文论文2 |
| 英文论文3 |
| 英文论文4 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
（7）孢子丝菌复合体分子分型研究进展（论文提纲范文）
| 1 限制性片段长度多态性分析 |
| 2 脉冲场凝胶电泳 |
| 3 随机引物扩增DNA多态性分析 |
| 4 扩增片段长度多态性分析 |
| 5 多位点序列分型 |
| 6 微卫星长度多态性分型 |
| 7 展望 |
（8）我国部分地区孢子丝菌群体遗传学分析及分子诊断（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 中英文缩略词对照表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 概述 |
| 1.1.1 孢子丝菌 |
| 1.1.2 孢子丝菌病 |
| 1.2 流行病学现状 |
| 1.3 孢子丝菌分子生物学研究 |
| 1.3.1 分子分型 |
| 1.3.2 分子诊断 |
| 1.4 研究展望 |
| 第二章 球形孢子丝菌群体遗传学分析 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.2.1 主要仪器和设备 |
| 2.2.2 主要试剂及试剂盒 |
| 2.2.3 实验菌株 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 菌株常规鉴定 |
| 2.3.2 基因组DNA提取 |
| 2.3.3 微卫星引物设计 |
| 2.3.4 微卫星条件优化及检测 |
| 2.3.5 微卫星数据分析 |
| 2.4 实验结果 |
| 2.4.1 菌株鉴定结果 |
| 2.4.2 球形孢子丝菌微卫星位点 |
| 2.4.3 微卫星反应条件 |
| 2.4.4 球形孢子丝菌的谱系分化 |
| 2.4.5 球形孢子丝菌的遗传多态性及其分布状况 |
| 2.5 讨论 |
| 2.6 结论 |
| 第三章 球形孢子丝菌实时荧光PCR检测方法的建立及初步评价 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 实验材料 |
| 3.2.1 主要仪器和设备 |
| 3.2.2 主要试剂 |
| 3.2.3 实验菌株 |
| 3.2.4 组织标本收集 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 引物探针设计 |
| 3.3.2 培养 |
| 3.3.3 临床标本病理组织学检查 |
| 3.3.4 基因组DNA提取 |
| 3.3.5 临床标本分离菌株常规分子鉴定 |
| 3.3.6 临床样本入组标准 |
| 3.3.7 实验条件优化 |
| 3.3.8 结果判定 |
| 3.3.9 特异性、敏感性、最低检测限以及标准曲线的构建 |
| 3.3.10 临床标本评价 |
| 3.3.11 伦理声明 |
| 3.4 实验结果 |
| 3.4.1 引物及探针序列 |
| 3.4.2 优化体系及反应条件 |
| 3.4.3 特异性、敏感性、最低检测限以及标准曲线的构建 |
| 3.4.4 临床标本检测 |
| 3.5 讨论 |
| 3.6 结论 |
| 第四章 孢子丝菌病多重实时荧光PCR诊断方法的建立及初步评价 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 实验材料 |
| 4.2.1 主要仪器和设备 |
| 4.2.2 试剂 |
| 4.2.3 相关试剂盒 |
| 4.2.4 实验菌株 |
| 4.2.5 组织标本收集 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 引物探针设计 |
| 4.3.2 培养 |
| 4.3.3 病理 |
| 4.3.4 基因组DNA提取 |
| 4.3.5 临床标本分离菌株常规分子鉴定 |
| 4.3.6 质粒构建 |
| 4.3.7 实验条件优化及结果判定 |
| 4.3.8 特异性、敏感性、最低检测限以及标准曲线的构建 |
| 4.3.9 单重荧光及多重荧光 |
| 4.3.10 单一样本及混合样本 |
| 4.3.11 多重荧光PCR与特异性引物PCR比较 |
| 4.3.12 临床标本及模拟标本评价 |
| 4.3.13 统计分析 |
| 4.3.14 伦理声明 |
| 4.4 实验结果 |
| 4.4.1 引物及探针序列 |
| 4.4.2 质粒构建 |
| 4.4.3 优化体系及反应条件 |
| 4.4.4 特异性、敏感性、最低检测限以及标准曲线的构建 |
| 4.4.5 单重荧光和多重荧光 |
| 4.4.6 混合模板检测能力评估 |
| 4.4.7 多重实时荧光PCR与特异性引物PCR比较 |
| 4.4.8 临床标本信息分析 |
| 4.4.9 临床标本及模拟标本检测 |
| 4.5 讨论 |
| 4.6 结论 |
| 第五章 结论 |
| 5.1 主要结论 |
| 5.2 创新点及不足 |
| 5.3 展望 |
| 附录 |
| 参考文献 |
| 作者简介及在学期间所取得的科研成果 |
| 致谢 |
（9）球形孢子丝菌致1例皮肤淋巴管型孢子丝菌病临床及相关实验室研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 英文缩写 |
| 病例分析 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 孢子丝菌病的临床及相关实验室研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（10）中国不同地区球形孢子丝菌临床分离株的扩增片段长度多态性分析及表型特征研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 中英文缩略词对照表 |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 孢子丝菌病与申克孢子丝菌 |
| 1.1.1 生态学 |
| 1.1.2 基因分型 |
| 1.1.3 地理分布 |
| 1.1.4 致病性 |
| 1.1.5 传播途径 |
| 1.2 我国孢子丝菌病现状及治疗 |
| 1.2.1 我国孢子丝菌病现状 |
| 1.2.2 我国孢子丝菌病的治疗 |
| 1.3 DNA分子标记技术及其在申克孢子丝菌遗传多态性的应用 |
| 1.3.1 限制性片段长度多态性分析 |
| 1.3.2 随机扩增DNA多态性 |
| 1.3.3 扩增片段长度多态性 |
| 1.3.4 展望 |
| 第2章 球形孢子丝菌AFLP反应体系的建立及优化 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.2.1 主要仪器与设备 |
| 2.2.2 主要实验试剂 |
| 2.2.3 实验试剂的配制 |
| 2.2.4 引物序列 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 提取基因组DNA |
| 2.3.2 球形孢子丝菌AFLP体系的优化 |
| 2.3.3 引物的筛选 |
| 2.4 结果 |
| 2.4.1 球形孢子丝菌基因组DNA的质量 |
| 2.4.2 球形孢子丝菌AFLP体系的优化 |
| 2.4.3 引物的筛选 |
| 2.5 讨论 |
| 2.6 结论 |
| 第3章 我国球形孢子丝菌的分类鉴定及AFLP分析 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 实验材料 |
| 3.2.1 主要仪器与设备 |
| 3.2.2 主要实验试剂 |
| 3.2.3 实验试剂的配制 |
| 3.2.4 钙调蛋白基因（CAL）引物序列 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 菌株来源 |
| 3.3.2 基因组DNA的提取与检测 |
| 3.3.3 PCR（CAL基因）扩增 |
| 3.3.4 AFLP反应 |
| 3.4 结果 |
| 3.4.1 基因组DNA质量检测及PCR（钙调蛋白基因）扩增分析 |
| 3.4.2 AFLP反应 |
| 3.5 讨论 |
| 3.6 结论 |
| 第4章 我国球形孢子丝菌的表型特征及体外药物的敏感性研究 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 实验材料 |
| 4.2.0 实验菌株及质控菌株 |
| 4.2.1 主要仪器设备 |
| 4.2.2 实验抗真菌药物及实验主要试剂 |
| 4.2.3 主要实验试剂的配制 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 生长试验 |
| 4.3.2 碳源同化实验 |
| 4.3.3 体外药敏试验 |
| 4.3.4 统计学分析 |
| 4.4 结果 |
| 4.4.1 生长实验和碳源同化实验 |
| 4.4.2 43 株球形孢子丝菌体外药敏试验 |
| 4.5 讨论 |
| 4.6 结论 |
| 第5章 结论 |
| 参考文献 |
| 作者简介及在学期间所取得的科研成果 |
| 致谢 |
四、应用PCR-RFLP进行申克孢子丝菌的分子生物学鉴定（论文参考文献）
- [1]5-氨基酮戊酸光动力对球形孢子丝菌杀伤作用的体外研究及碘化钾对其杀伤效果的影响[D]. 陈瑞丽. 吉林大学, 2021(01)
- [2]孢子丝菌病临床流行病学特征分析和诊断方法的探索[D]. 吕莎. 吉林大学, 2020(08)
- [3]球形孢子丝菌诱导THP-1巨噬细胞免疫应答的初步研究及黑素对其免疫功能的影响[D]. 姚蕾. 吉林大学, 2020(08)
- [4]孢子丝菌病快速诊断方法的探究[J]. 吴永卓,刘晓明,张振颖. 中国真菌学杂志, 2020(01)
- [5]孢子丝菌病诊断及治疗进展[J]. 侴梦微,郭亚南,刘慧瑜. 中国现代医学杂志, 2021(21)
- [6]孢子丝菌病病因学分析及发病机理研究[D]. 暴芳芳. 山东大学, 2019(02)
- [7]孢子丝菌复合体分子分型研究进展[J]. 张明瑞,杨鑫,赵飞,吕莎,龚杰,周盈,李福秋. 菌物学报, 2019(08)
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