一、端粒酶RNA及蛋白组分在泌尿系统研究进展（论文文献综述）
王燕[1]（2021）在《基于代谢/蛋白组学及网络药理学研究补阴补阳剂的抗衰老作用》文中研究说明目的基于UPLC-QTOF/MS代谢组学和i TRAQ定量蛋白质组学技术,观察补阳剂金匮肾气丸与补阴剂六味地黄丸对自然衰老小鼠内源性代谢物和差异蛋白的影响,分析金匮肾气丸和六味地黄丸对自然衰老小鼠的调节作用。结合网络药理学及分子对接技术,通过多数据库挖掘,进一步构建补阴补阳方剂-衰老靶点多层次网络,多维度比较分析补阳剂金匮肾气丸与补阴剂六味地黄丸干预衰老的作用特点。方法基于课题组前期研究,选用3月龄小鼠为低龄组,20月龄自然衰老小鼠随机分为老龄组、六味地黄丸组和金匮肾气丸组,每组20只（雌、雄各10只）。六味地黄丸组给药量9.75 g/kg,金匮肾气丸组给药量10.53 g/kg,低龄组、老龄组灌胃同体积的生理盐水。连续灌胃30天后,制备血浆、脾、肾组织样本用于UPLC-Q-TOF/MS代谢组学分析,制备肝组织样本用于i TRAQ定量蛋白质组学分析。网络药理学研究选用TCMSP数据库获取金匮肾气丸和六味地黄丸药物相关化学成分对应的靶点,分别在Gene Cards、OMIM、Pharm GKB、Drug Bank数据库搜索衰老靶点,通过Cytoscape＿v3.7.0构建补阴补阳方剂-衰老靶点多层次网络,探究补阴补阳方剂与衰老的关联性,选择两首补益方中与靶点联系较多的共同成分及共同靶蛋白,应用Auto Dock Vina软件进行分子对接。最后结合生物信息学功能分析探讨补阴剂六味地黄丸与补阳剂金匮肾气丸调节衰老的作用机制特点。结果1代谢组学研究发现,衰老进程中各组织样本中代谢物质及其富集的代谢通路均发生改变,且不同组织样本中衰老代谢标志物及通路存在差异。雌鼠血浆、脾和肾组织样本中分别鉴定筛选出24、14和20个代谢标志物;雄鼠血浆、脾和肾组织样本中分别鉴定筛选出22、26和34个代谢标志物。对于雌鼠,脾和肾组织中相同标志物有肌苷、9,10-环氧十八烯酸、鞘氨醇3个;血浆和脾组织中相同标志物是D-赤藓糖-4-磷酸;血浆和肾组织中相同标志物是L-二氢乳清酸。对于雄鼠,脾和肾组织中相同标志物有L-谷氨酸、泛酸、焦谷氨酸、左旋棕榈酰肉碱4个;血浆和脾组织中相同标志物是二十二碳六烯酸。雌鼠脾和肾组织中相同代谢通路有8个;血浆和脾组织中相同代谢通路有4个;血浆和肾组织中相同代谢通路有5个,血浆、脾和肾组织中共同代谢通路有3个。雄鼠脾和肾组织中相同代谢通路有19个;血浆和脾组织中相同代谢通路有7个;血浆和肾组织中相同代谢通路有7个,血浆、脾和肾组织中共同代谢通路有6个。2蛋白质组学研究发现,衰老进程中差异蛋白及其富集的通路均发生改变,雌鼠低龄组（3M）与老龄组（20M）对比的肝组织中上调的差异蛋白163个,下调的差异蛋白97个;雄鼠低龄组（3M）与老龄组（20M）对比的肝组织中上调的差异蛋白165个,下调的差异蛋白91个。比较不同性别小鼠的差异蛋白,发现随着衰老进程,雌、雄鼠肝组织样本中均有155个共同差异蛋白表达上调、均表达下调的蛋白有63个。3六味地黄丸和金匮肾气丸对不同组织样本中衰老相关代谢标志物均有调节作用。对于雌鼠,六味地黄丸对血浆样本中13个衰老标志物有回调,脾组织样本中11个标志物有回调,肾组织样本衰老相关的标志性代谢物质中,六味地黄丸方对17个有回调;对于雄鼠,六味地黄丸对血浆样本中17个衰老标志物有回调,对脾组织样本中27个标志物有回调;雄鼠肾组织样本中,六味地黄丸回调的标志物有18个。金匮肾气丸能回调雌鼠血浆样本中10个衰老标志物、脾组织样本中12个标志物、肾组织样本中的15个衰老标志物;对于雄鼠,金匮肾气丸对血浆样本中20个衰老标志物有回调、对脾组织样本中25个标志物有回调、肾组织样本中的32个标志物有回调。4六味地黄丸和金匮肾气丸对衰老相关差异蛋白均有调节作用。在雌鼠肝组织样本中,六味地黄丸回调117个衰老相关差异蛋白,雄鼠肝组织样本中六味地黄丸回调46个的衰老相关差异蛋白;金匮肾气丸对雌鼠的115个衰老相关差异蛋白有回调作用,对雄鼠的58个衰老相关差异蛋白有回调作用。对于雌鼠,六味地黄丸和金匮肾气丸共同上调的衰老相关蛋白有44个,共同下调的衰老相关蛋白有66个;对于雄鼠,六味地黄丸和金匮肾气丸共同上调的衰老相关蛋白有3个。六味地黄丸和金匮肾气丸调节自然衰老雌鼠的共同通路有14个,调节雄鼠的衰老相关蛋白富集共同通路有4个。5网络药理学研究发现,六味地黄丸中46个主要成分对应靶基因190个,其中有159个与衰老相关;金匮肾气丸中48个主要成分对应靶基因194个,其中有162个与衰老相关。六味地黄丸和金匮肾气丸抗衰老靶点均能通过参与细胞对缺氧的反应、对脂多糖的反应、凋亡过程的负调控、老化、血管生成的正调控、细胞衰老、血管内皮生长因子产生的正调控、蛋白质磷酸化、细胞对胰岛素刺激的反应等生物进程调节衰老进程。6分子对接研究发现,原癌基因c-Fos（FOS）与槲皮素（quercetin）,α-丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶（AKT1）与薯蓣皂素（diosgenin）、山奈酚（kaempferol）、槲皮素（quercetin）,丝裂原活化蛋白激酶1（MAPK1）与槲皮素（quercetin）结合活性最强。结论1衰老进程中伴随代谢物质和蛋白的改变,且在不同组织不同性别存在差异。2补阴剂（六味地黄丸）和补阳剂（金匮肾气丸）对不同组织样本中衰老相关代谢标志物均有调节作用,两者调节作用有差异性。补阴剂（六味地黄丸）调节自然衰老雌鼠血浆、雄鼠脾组织、雌鼠肾组织样本中代谢标志物较补阳剂（金匮肾气丸）显着;补阳剂（金匮肾气丸）调节自然衰老雄鼠血浆、雌鼠脾组织和雄鼠肾组织样本中代谢标志物较补阴剂（六味地黄丸）显着。3补阴剂（六味地黄丸）和补阳剂（金匮肾气丸）对自然衰老小鼠肝组织样本中的衰老相关差异蛋白均有回调,均能通过干预老化、细胞黏附调节、蛋白质磷酸化、凋亡过程、心肌收缩、脂质代谢过程等生物进程调节衰老。代谢组学和蛋白质组学研究联合分析发现,六味地黄丸和金匮肾气丸共同调节的差异蛋白113个,与调节的共同代谢通路中72个代谢标志物存在生物信息学关联。4网络药理学研究发现,补阴剂六味地黄丸与补阳剂金匮肾气丸发挥抗衰老作用的主要靶点与细胞对缺氧的反应、凋亡过程的负调控、炎症反应、对脂多糖的反应、老化、细胞衰老、血管内皮生长因子产生的正调控等生物进程密切相关。分子对接结果提示两首方剂中的主要活性成分与FOS、TP53、MAPK1、AKT1、MYC、JUN、MTOR有较好的亲和力。蛋白质组学和网络药理学研究结果比较发现,抗衰老靶点/蛋白的共同富集通路有黏着斑、PI3K-Akt信号通路、HIF-1信号通路、甲状腺激素信号通路、阿尔茨海默病等9条通路。
程佳颖[2]（2021）在《EGF基因多态性与膀胱癌和肾癌关系的病例对照研究》文中提出(1)目的探讨表皮生长因子（epidermal growth factor,EGF）基因rs4444903、rs11568835、rs2237051、rs2302135四个位点单核苷酸多态性与中国人群膀胱癌和肾癌患病风险的相关性以及环境因素与四个位点多态性对膀胱癌和肾癌患病风险的交互作用。方法采用1:1配对的病例对照研究的方法,收集内蒙古自治区人民医院和内蒙古医科大学附属医院两家三甲医院泌尿外科新确诊的膀胱癌病人300例和肾癌病人152例作为病例组,对照组来源于这两家医院体检中心同期体检的健康个体,对照组与病例组按同性别、年龄（?）5岁1:1匹配。对研究对象进行面对面问卷调查,收集其基线资料,包括:一般情况、职业接触史、生活饮食习惯等,并收集研究对象血液样本、癌和癌旁组织样本及病理检查结果。采用多重高温连接酶检测反应技术（im LDR）检测EGF基因rs4444903、rs11568835、rs2237051、rs2302135四个位点的基因型。采用酶联免疫吸附测定法（ELISA）测定血清中EGF的蛋白表达量。采用实时荧光定量PCR的方法测定EGF基因中肾癌组织及癌旁组织中m RNA的相对表达量。所有数据全部录入Epidata3.1中,采用IBM SPSS25.0统计软件进行处理。定量资料如服从正态分布,采用（（?）s）表示,不服从正态分布采用“中位数（四分位数间距）”表示;两组间比较,如方差齐采用t检验,方差不齐则采用秩和检验;定性资料用率或者构成比表示,两组间的比较采用X2检验。以拟合优度X2检验分析基因型在对照组人群中的分布是否符合Hardy-Weinberg平衡,分析EGF基因rs4444903、rs11568835、rs2237051、rs2302135四个位点的基因型频率及等位基因频率在两组间的分布。应用二元logistic回归分析计算共显性、显性、隐性三种遗传模型的比值比（odds ratios,OR）;采用多因素条件Logistic回归分析计算生活和饮食习惯与膀胱癌和肾癌发生风险OR及其相应的95%置信区间（confidence intervals,CI）;采用广义多因子降维法（generalized multifactor dimensionality reduction,GMDR）进行基因-环境交互作用分析。结果（1）单因素分析显示,膀胱癌病例组与对照组相比,在文化程度、农药接触史、工厂工作史、吸烟、饮食荤素、食用油种类、水果摄入、饮水类型、染发、劳动强度、憋尿频率、取暖做饭方面差异有统计学意义（P<0.05）;而在BMI、饮酒、乳制品摄入、油炸品摄入、饮水量、空气清新剂的使用方面差异无统计学意义（P>0.05）。肾癌病例组与对照组相比,在文化程度、农药接触史、饮食荤素、食用油种类、水果摄入、乳制品摄入、饮水类型、染发、劳动强度、取暖做饭方面差异有统计学意义（P<0.05）;而在BMI、工厂工作史、吸烟、饮酒、油炸品摄入、饮水量、憋尿情况、使用空气清新剂方面差异无统计学意义（P>0.05）。（2）多因素条件logistic回归结果显示,接触农药、工厂工作史、吸烟、劳动强度重是膀胱癌的危险因素（OR值分别为3.732、2.239、2.498、2.103）,文化程度高是膀胱癌的保护因素（OR=0.339）。接触农药、食用动物油为主、饮用深井水是肾癌的危险因素（OR值分别为3.194、3.212、8.606）,文化程度高、乳制品摄入多是肾癌的保护因素（OR值分别为0.129、0.386）。（3）EGF基因rs11568835、rs4444903、rs2237051、rs2302135四个位点的三种遗传模型与膀胱癌和肾癌的患病均未见有明显关联（P>0.05）。（4）EGF基因四个位点等位基因及基因型与膀胱癌病理分级及临床分期均未见有明显关联（P>0.05）。rs2237051位点的基因型与肾癌病理分级有关（P=0.029）。（5）EGF基因rs11568835、rs4444903、rs2237051、rs2302135四个位点基因型及等位基因频率在膀胱癌和肾癌病例组与对照组之间差异均无统计学意义（P>0.05）。（6）GMDR分析结果显示:农药接触史与工厂工作史为膀胱癌交互作用的优势模型（P=0.001）;rs2302135位点与食用食用油种类、水果摄入情况为肾癌交互作用的优势模型（P=0.011）。（7）膀胱癌和肾癌血清中EGF蛋白表达量显着高于对照组（P<0.05）。（8）肾癌癌旁组织中m RNA的相对含量明显高于肾癌组织,差异具有统计学意义（P<0.05）。结论（1）接触农药、在工厂工作、吸烟、劳动强度重是膀胱癌患病的危险因素;文化程度高为膀胱癌保护因素。接触农药、食用动物油为主、饮用深井水是肾癌的危险因素;文化程度高、乳制品摄入多是肾癌的保护因素。（2）EGF基因四个位点等位基因及基因型与膀胱癌病理分级及临床分期无关;rs2237051位点的基因型与肾癌病理分级有关。（3）本研究结果提示EGF基因rs11568835、rs4444903、rs2237051、rs2302135四个位点的三种遗传模型与膀胱癌和肾癌的患病均不相关。（4）农药接触史、工厂工作史在膀胱癌的发生中存在交互作用;rs2302135位点与食用食用油种类、水果摄入情况在肾癌的发生中存在交互作用。（5）膀胱癌和肾癌血清中EGF蛋白表达量显着高于对照组。（6）肾癌癌旁组织中m RNA的相对含量明显高于肾癌组织。
闫菲[3]（2021）在《归肾丸改善氧化应激治疗早发性卵巢功能不全的临床及实验研究》文中指出目的:1.通过对归肾丸的主要化学成分及相关靶点、早发性卵巢功能不全疾病相关靶点的挖掘、筛选及综合,预测归肾丸治疗早发性卵巢功能不全的共同靶点。通过STRING人类背景基因数据库筛选出共同靶点中的核心靶点,并使用Cytoscape软件绘制核心靶点相互作用关系网络图;同时运用DAVID数据库对核心靶点进行GO功能富集分析及KEGG信号通路富集分析,获得关键生物过程及信号通路,为后期归肾丸治疗早发性卵巢功能不全的体内外研究奠定生物信息学基础。2.观察归肾丸加减方（加减归肾丸）对早发性卵巢功能不全属于脾肾不足、肝郁血瘀型患者治疗前后中医证候积分、血清性激素水平、血清氧化应激相关指标的改善,观察补肾健脾、疏肝活血法对早发性卵巢功能不全的临床切实功效,同时探究加减归肾丸对早发性卵巢功能不全患者的血清氧化应激水平的影响,为其抗卵巢功能减退的内在作用机制奠定临床基础。3.探索归肾丸中重要单体表儿茶素对人卵巢颗粒细胞系KGN氧化应激状态的改善及对PI3K/AKT/Nrf2信号通路的影响,初步明确重要抗氧化剂表儿茶素对卵巢颗粒细胞的抗氧化作用及PI3K/AKT/Nrf2信号通路中核心蛋白的上调及下调趋势,为归肾丸治疗早发性卵巢功能不全的体外研究奠定研究基础。方法:1.网络药理学研究:在TCMSP、TCM-ID、BATMAN数据库中筛选归肾丸中八味中药的有效化合物及化合物相关靶点并进行综合,在OMIM、Gene Cards疾病靶点数据库中检索早发性卵巢功能不全相关疾病靶标,将取交集后获得的共同靶标导入至STRING网站,获取归肾丸治疗早发性卵巢功能不全的核心靶点。将核心靶点导入DAVID网站进行GO生物学功能及KEGG信号通路富集分析,筛选出核心生物过程和信号通路,同时运用Cytoscape软件绘制各类可视化网络图。2.临床研究:采用自身前后对照方法,选取就诊于北京中医药大学东直门医院妇科门诊的20例脾肾不足、肝郁血瘀型POI患者给予加减归肾丸口服治疗3个月经周期（闭经者治疗3个月）,对患者治疗前后中医证候积分、改良Kupperman量表积分、性激素相关指标（FSH、LH、E2、FSH/LH）、及血清氧化应激相关指标（SOD、GSH）进行评价,验证加减归肾丸对早发性卵巢功能不全的治疗作用。3.体外实验:将人卵巢颗粒细胞系KGN适应性培养,使用CCK-8法摸索出H2O2及表儿茶素的最佳作用浓度（区间）。实验共分为5个组别,分别为空白对照组、模型组及表儿茶素低、中、高剂量组,首先进行细胞适宜浓度种板,第二天进行除空白对照组的H2O2造模,第三天对表儿茶素实验低、中、高剂量组进行表儿茶素相关浓度的干预,最后一天取材。细胞上清液进行氧化应激相关指标（SOD）的检测,细胞进行PI3K/AKT/Nrf2信号通路核心蛋白及下游关键蛋白mRNA及蛋白的检测。结果:1.网络药理学研究:共检索出归肾丸中的活性成分162个,其中熟地2个,山药18个,山茱萸23个,茯苓16个,当归6个,杜仲42个,枸杞子43个,菟丝子12个,共预测化合物潜在靶点829个。检索POI疾病相关靶点4854个,两者取交集,共得到AKT1、CASP3、CASP8、CASP9、FAS、EGF 等 152 个核心靶点。构建“成分-靶点”网络,结果提示槲皮素、豆甾醇、山萘酚、β-胡萝卜素、表儿茶素位于前五位。构建PPI蛋白相互作用网络,结果提示TP53、AKT1、MMP9、ASP3、IL6处于核心位置。GO富集分析结果提示生物过程显着富集在含氧化合物反应、细胞对化学刺激的反应等;分子功能主要富集在酶结合、信号受体结合等;细胞组分主要富集在细胞外空间、细胞外区域等。KEGG富集分析结果提示主要富集在TNF、PI3K/AKT、凋亡、FoxO、Toll样受体、VEGF、MAPK等信号通路。2.临床研究:患者使用加减归肾丸治疗3个月经周期后,对患者前后各项情况进行比较。在中医证候积分方面,多数患者在月经情况方面有不同程度的改善,包括月经周期的恢复和月经血量的增加等。同时对于患者腰膝酸软、头晕耳鸣、性欲减退、潮热盗汗、烦躁易怒、胸闷胁痛、失眠多梦、神疲乏力、经黯有块等症状,加减归肾丸也具有显着改善疗效;在改良Kupperman量表评分方面,患者潮热出汗、失眠、焦虑、抑郁、疲倦乏力、头晕症状评分在治疗前后有显着性差异,治疗总有效率为70%;在性激素相关指标方面,患者血清FSH、LH值在治疗前后明显提高;在OS相关指标方面,患者血清SOD、GSH检测值均较治疗前提升,其中GSH有显着性差异。3.体外实验:CCK-8法结果提示H2O2最佳造模浓度为50μM/L,表儿茶素安全浓度区间为100μM/L至300μM/L。氧化应激相关指标:模型组的SOD活性相比于空白对照组显着降低（p<0.05）,在使用三种剂量表儿茶素干预后仅低剂量（100μM/L）未体现出明显差异（p≥0.05）,中高剂量（200μM/L、300μM/L）时均具有显着性差异（p<0.05,p<0.01）,可见细胞受到的氧化应激损伤随着EC浓度的增加而减轻;Western Blot相关指标:模型组中PI3K、AKT、Nrf2的蛋白浓度均显着下降（p<0.05,p<0.01）,使用三种剂量表儿茶素干预后三种蛋白表达量均提高,除低剂量组（100μM/L）的PI3K蛋白外（p≥0.05）,其余均具有显着性差异（p<0.05,p<0.01）;模型组HO-1蛋白浓度显着降低（p<0.01）,三种剂量表儿茶素干预后HO-1的蛋白表达水平均显着逆转（p<0.001）;模型组eNOS蛋白浓度显着升高（p<0.01）,三种剂量表儿茶素干预后蛋白浓度逐渐下降,但仅在高剂量组（300μM/L）表现出了与模型组的显着性差异（p<0.01）;PCR相关指标:与对照组相比,模型组中PI3K、AKT、Nrf2三类蛋白的mRNA表达水平均显着降低（p<0.001）,使用三种剂量表儿茶素干预后三类蛋白mRNA表达水平逐渐升高,均显示出显着性差异（p<0.001）;模型组HO-1、NQO1的mRNA表达水平明显下降（p<0.001）,使用三种剂量表儿茶素干预后两类蛋白mRNA表达水平逐渐升高,均显示出显着性差异（p<0.01,p<0.001）;模型组NADPH的mRNA表达水平显着上升（p<0.001）,使用三种剂量表儿茶素干预后mRNA表达水平逐渐降低,均显示出显着性差异（p<0.05,p<0.001）。结论:1.预测出归肾丸可以通过多途径、多靶点对早发性卵巢功能不全产生治疗作用,其内在作用机制可能与调节炎症反应、改善氧化应激、抑制凋亡和雌激素受体调节等作用途径相关。2.加减归肾丸可以降低脾肾不足、肝郁血瘀证型POI患者血清FSH、LH水平,调整月经周期,增加月经血量,对于中医证候积分、围绝经期相关症状和氧化应激水平均具有一定调节作用,表明加减归肾丸对于POI患者的卵巢功能有一定的治疗作用。3.表儿茶素可以改善H2O2介导的人卵巢颗粒细胞系KGN的氧化应激状态,作用机制可能与PI3K/AKT/Nrf2信号通路相关。
郑建波[4]（2020）在《肾细胞癌组织中hTERT启动子甲基化水平与其临床病理意义》文中提出研究背景:肾癌是泌尿生殖系统最常见的恶性肿瘤之一,全世界每年诊断出超过40万名新患者,其中约17万名患者死于肾癌。近些年来肾癌的发病率呈上升趋势,其发病机制仍未被明确。近来发现端粒及端粒酶的活性在肿瘤包括肾癌等疾病的发生发展中可能起到了重要作用。端粒是位于真核细胞染色体末端的DNA-蛋白质复合体,由重复排列的富含鸟嘌呤的六聚体DNA及特定的端粒结合蛋白组成。对维持基因组和染色体稳定起重要作用。端粒酶是一种核糖核蛋白聚合酶,是一种能够延长端粒重复序列的酶,通过在人类染色体末端添加5’-TTAGGG-3’重复序列来维持端粒末端的T-Loop结构。在出生后的体细胞中端粒酶的表达通常受到抑制,如果其失调可能与致癌性有关。虽然它在大多数正常人类细胞中被抑制,但在高达90%的人类恶性肿瘤中可检测到端粒酶活性。端粒酶主要有人端粒酶逆转录酶（hTERT）、人端粒酶RNA组分（hTR）及相关蛋白3个不同的亚基组成,hTERT是端粒酶全酶的催化亚基,是端粒酶活性的限速因子。已知人hTERT基因的表达和功能通过多种途径调节,包括转录因子,启动子甲基化/突变,染色质重塑,交替剪接,蛋白质修饰导等。在这些调节手段中,转录调节是最重要的。自从发现正常细胞上大多数癌基因启动子存在高甲基化后,甲基化的遗传修饰被引起广泛的兴趣。DNA甲基化,一般发生在CpG位点。hTERT启动子区域没有TATA和CAAT盒,但含有一个致密的富含CG的CpG岛,这表明DNA甲基化在hTERT表达调控中可能起潜在的作用。对重亚硫酸氢盐处理后的基因组组测序,Theodora等人研究了 37种细胞系中hTERT的启动子甲基化状态,包括正常细胞,干细胞和癌细胞。虽然他们研究没有发现特异性甲基化位点或区域与hTERT表达相关,却证实了在端粒酶阴性的SUSM-1细胞系中通过去甲基化处理诱导了 hTERT表达。目前一些研究表明hTERT启动子的CpG岛甲基化与体内较低的端粒酶活性有关,然而更多研究表明hTERT启动子区域的超甲基化与hTERT mRNA表达正相关,这与我们通常认为的基因上某个区域的甲基化升高导致该基因的表达降低相反,因此DNA甲基化在hTERT表达和端粒酶活性调节中的潜在作用仍然有待阐明。肾细胞癌（RCC）是肾脏恶性肿瘤中最常见的癌症病理类型,诊断时转移率为25-30%。据报道,hTERT基因表达可以通过各种反式作用元件和顺式作用元件调节,包括 c-Myc,Sp1,WT1,HIF-1α,P53,TGF-β,SMYD3,染色质重塑和启动子突变。然而很少有研究涉及RCC中hTERT启动子的DNA甲基化状态。为此,我们使用焦磷酸测序定量评估了 hTERT启动子区域中转录上游的筛选出的5个CpG位点的甲基化水平,进一步探讨hTERT启动子甲基化百分比和hTERT表达,端粒酶活性,临床分期和患者预后之间的相关性,并对hTERT启动子甲基化水平与其表达和端粒酶活性之间的关系进行了探讨,探索hTERT启动子甲基化在肾肿瘤发生发展中的潜在作用,筛选预测肾肿瘤预后的生物标志物。研究目的:通过收集103例肾细胞癌患者的年龄、性别、肿瘤类型、TNM分期、Fuhrman分级等临床病理特征并随访手术后预后情况,检测肾细胞癌及配对癌旁正常组织的hTERT启动子甲基化水平、hTERT mRNA相对表达丰度,端粒酶活性。分析hTERT启动子甲基化水平与hTERT mRNA相对表达丰度,端粒酶活性3者之间的相互关系及其与肾细胞癌患者年龄、性别、肿瘤类型、TNM分期、Fuhrman分级等特征之间的关系,对hTERT启动子甲基化水平在肾细胞癌中的潜在作用机制进行初步的研究。研究对象及方法:收集2009年至2014年期间,在山东大学齐鲁医院入院手术的103名患者中,通过根治性肾切除术（n=99）或肾单位保留手术（n=4）获得成对的肾肿瘤组织和与肿瘤相邻的正常组织（NAT）。所有标本均通过组织病理学检查确认诊断。将标本在-80℃冷冻直至随后的实验室分析。对这些患者进行随访研究,随访时间从2009年1月1日起,截止时间2016年11月30日。以手术时间作为观察起点,直至患者出现死亡,记录每个病例的年龄、性别、左右、病理类型、TNM分期、Fuhrman分级、生存时间等资料。按照DNeasy组织试剂盒（Qiagen Ltd,Venlo,Netherlands）说明书从冷冻组织标本中提取DNA。通过分光光度法测量DNA浓度并调节至50ng/ml。采用EpiTect Bisulfite试剂盒（Qiagen）,严格按照产品说明书进行基因组DNA的亚硫酸氢盐修饰。通过采用特异性的引物对亚硫酸氢盐转化的基因组DNA进行PCR,PCR结果确认DNA的亚硫酸氢盐转化成功。使用PyroMark PCR试剂盒（Qiagen）进行 PCR。使用 PyroMark Assay Design Software 2.0 设计引物。对于所有样品,用0.5μl亚硫酸氢盐转化的基因组DNA进行PCR反应。使用生物素标记的引物（反向引物）通过使用链霉抗生物素蛋白包被的Sepharose珠（GE Healthcare,UK）纯化PCR产物。将PCR产物与Sepharose珠结合,纯化,洗涤,用0.2M NaOH溶液变性,并再次洗涤。然后将0.3μM测序引物与纯化的单链PCR产物退火,并根据产品说明在PyroMark Q96（Qiagen）中进行焦磷酸测序。为了总亚硫酸氢盐转化的内部对照,焦磷酸测序的区域中的非CG胞嘧啶也被包括。使用TRizol试剂（Invitrogen）从组织样品中提取总细胞RNA。使用总共1μg的RNA用M-MLV逆转录酶（Thermo,Lithuania）进行逆转录。使用SYBR Green PCR Master Mix（Applied Biosystems,Foster City,CA）在 7000 实时 PCR系统（Applied Biosystems）中进行QPCR。β2-作为内参照物。根据阈值循环值,使用2-△△Ct方法计算标本中hTERT mRNA的相对水平。使用TeloTAGGG端粒酶PCR ELISA试剂盒（Roche Diagnostics）测定端粒酶活性。提取1.0μg蛋白质进行测定,并且在端粒酶-引物延伸反应后进行30个PCR循环。使用ELISA显色反应检测PCR产物。端粒酶活性水平表示为吸光度[测定在450nm上的OD值（参考波长690nm）]。对正态分布的采用t检验。不符合正态分布的未配对组采用Mann-Whitney U检验,配对组采用Wilcoxon秩和检验,3组样本之间比较采用多样本比较的秩和检验,Kruskal-Wallis法来进行整体分析及两两比较。对于指标与预后之间的关系,采用Kaplan-Meier分析,对Log-rank检验有意义的单因素纳入多因素Cox回归分析,报告的所有P值均为双尾检验,并且采用值小于0.05。SPSS 16.0软件统计结果提示P=0.000,做图时按P<0.001显示处理。研究结果:我们提取12个肾癌组织和相对应癌旁正常组织（NAT）的DNA,采用重亚硫酸盐转化后,设计了 3对PCR引物对hTERT启动子的三个区域的14个CpG位点进行焦磷酸测序。在所有14个检查的CpG位点中发现,与NAT相比,我们发现肾癌组织中的hTERT启动子区CpG甲基化百分比更高,按P小于0.05,2组之间均有显着统计学意义。同时在三个区域PCR过程中,我们发现包含位点1至5区域的PCR扩增信号最稳定。以这个区域为研究对象,我们扩大检测样本,使用焦磷酸测序检测了 103名肾癌患者配对样本中位点1至位点5的甲基化百分比。我们发现与NAT相比,肾癌组织中所有5个CpG位点都显着高甲基化。在所有103个肾肿瘤组织和配对NAT中,患者的年龄与MMP1-5（means of methylation percentage of CpG sitel to site2）之间均不存在线性相关性。肾癌组织中MMP 1-5和hTERT全长mRNA表达（R2=0.450）之间观察到较高的正相关。一致地,在MMP 1-5和端粒酶活性之间也发现了正相关（R2=0.446）。我们的数据表明hTERT启动子在肾癌组织中是高甲基化的,并且甲基化水平与hTERT mRNA表达和端粒酶活性密切相关。我们研究hTERT启动子甲基化水平与临床病理特征之间的关联,发现所有患者的甲基化与年龄和性别无关。同时我们发现较高水平的hTERT启动子甲基化水平与疾病阶段显着相关,但是我们的数据发现Fuhrman等级之间与hTERT甲基化水平没有统计学显着差异。同时,透明细胞RCC（ccRCC）和非ccRCC之间的hTERT启动子甲基化水平没有显着差异。肾肿瘤组织与NAT相比,全长hTERT mRNA表达及端粒酶活性有明显的统计学差异,hTERT表达与端粒酶活性之间存在直线相关性。经单因素的分析,患者的TNM分期,细胞Fuhrman分级,hTERT启动子甲基化水平,hTERT mRNA表达水平,端粒酶活性对肾癌术后生存率有影响,经多因素Cox回归分析发现AJCC分期、hTERT启动子甲基化水平是影响肾癌病人预后的独立因素。研究结论:综上所述,我们通过对人肾癌中hTERT启动子甲基化水平、hTERT表达及端粒酶活性与临床特征和预后之间的相关性研究,我们发现hTERT启动子甲基化与hTERT表达/端粒酶活性之间存在正相关,hTERT表达与端粒酶活性之间存在正相关。hTERT启动子甲基化此外,我们发现了 hTERT启动子甲基化、hTERT mRNA表达及端粒酶活性与临床结果之间的密切关联,是肾癌预后不良的危险因素。hTERT启动子CaAvg（按48.3%分层）,AJCC分层是影响肾癌患者手术之后预后的独立因素,hTERT启动子甲基化水平影响hTERT mRNA表达及端粒酶活性,影响肾癌预后,揭示这种表观遗传改变可以作为RCC诊断和预后的有价值的生物标志物。
杨玉洁[5]（2020）在《二硫化钼传感阵列的构建及在膀胱癌标志物检测中的应用》文中研究说明膀胱癌是人体泌尿系统常见的恶性肿瘤,发病率和术后复发率都极高。目前,膀胱镜检查和组织活检是诊断膀胱癌的金标准,但这些诊断方法由于具有高侵入性给患者带来了极大的痛苦。近年来,无创液体活检可以通过检测各种体液中的生物标志物进行疾病筛查,为早期临床诊断提供了新思路。膀胱是储尿器官,膀胱癌的发生和发展与尿液成分密切相关。因此,膀胱癌尿液诊断将为膀胱癌的无创早期诊断带来希望。然而,尿液中膀胱癌标志物含量极低,背景干扰非常严重,对检测方法的灵敏度和选择性同时提出了极高的要求。且目前开发的液体活检诊断方法主要依赖于单个生物标志物的检测,大大限制了诊断的准确性。为此,开发一种能够同时高灵敏地检测多种膀胱癌生物标志物的有效方法,对于实现膀胱癌的早期准确诊断极为必要。纳米生物传感器的发展为膀胱癌液体活检带来了机会。基于场效应晶体管（FET）的生物传感器近年来发展迅猛,具有高灵敏度,超快速响应和低检测限等优点。特别是通过调控材料合成和器件制备工艺,可以构建具有多通道传感单元的FET传感阵列,能够同时检测多个疾病生物标志物,从而提高诊断的准确性。在构建FET的纳米材料中,二硫化钼（Mo S2）具有优异的电学性能,包括直接带隙、高开关比和高载流子迁移率,基于Mo S2构建的FET生物传感器能够对生物标志物实现高灵敏度和高准确性的快速检测。在本论文中,我们设计构建了基于Mo S2纳米薄片的FET传感阵列,用于同时检测人类尿液中的两种膀胱癌生物标志物。主要研究内容如下:（1）对化学气相沉积法（CVD）生长制备的Mo S2纳米薄片进行形貌与结构表征,并利用其制备Mo S2 FET阵列器件,探究Mo S2 FET的电学性能。均匀性良好的三角Mo S2纳米片具有超薄的双层结构,利用其制备的FET阵列展现出优异的电学性能,具有较高的载流子迁移率和电流开关比,这对于构建高灵敏度的FET生物传感器具有重要意义。（2）分别用两种特定的识别分子对Mo S2 FET阵列进行功能化,构建Mo S2 FET传感阵列,利用Mo S2 FET传感阵列对两种膀胱癌标志物即核基质蛋白22（NMP22）和细胞角蛋白8（CK8）进行特异性定量检测。研究表明,Mo S2 FET生物传感阵列对NMP22和CK8蛋白的检测限极低,并且具有较宽的线性传感范围。高灵敏度和特异性的Mo S2 FET传感阵列还可用于检测人类尿液样本中的膀胱癌生物标志物,能够有效地将膀胱癌患者与健康人的尿液样本进行区分。
黄理杰[6]（2019）在《琼玉膏通过Klotho/FGF-23信号通路延缓斑马鱼衰老的研究》文中提出目的:探讨琼玉膏（由生地黄、蜂蜜、茯苓、人参4种成分组成）对H202诱导氧化损伤的斑马鱼血清超氧化物岐化酶（Superoxide Dismutase,SOD）、肾组织丙二醛（Malondialdehyde,MDA）水平,肾组织Klotho基因和蛋白表达水平,肾组织Klotho基因甲基化水平的影响情况,探究Klotho/FGF-23信号通路在琼玉膏延缓斑马鱼衰老中发挥作用的分子机制,开拓琼玉膏抗衰老分子机制研究的新领域。方法:模型:选取3月龄成年斑马鱼H202刺激,检测4周存活率和氧化应激水平。同时观察7个不同浓度琼玉膏对斑马鱼存活率的影响。确定最佳H202浓度,设立琼玉膏高、中、低浓度用于后续研究,并确定正式实验高、中、低浓度具体琼玉膏浓度值。分组:共5组,A:正常对照组,B:模型组（200 μ M H202）,C:低浓度琼玉膏组（100 μ g/ml琼玉膏+200 u M H202）,D:中浓度琼玉膏组（200 μ g/ml琼玉膏+200 μ M H202）,E:高浓度琼玉膏组（400 μ g/ml琼玉膏+200μM H202）,每组斑马鱼20尾（雌雄各半）。饲养与给药方法:成鱼于28℃恒温系统集中养殖与繁育,PH=7.2～7.6,水电导率550～650 μ s/cm,流动水,明暗交替变化比例为14H:10H。饲料喂养:每日两次,孵化脱壳丰年虾。给药方法:模型组斑马鱼每天8:00am～16:00pm用纯净养殖水孵育8h,16:00pm～次日8:00am用200 μ M过氧化氢养殖水孵育16h,持续6周;低、中、高浓度琼玉膏组斑马鱼每天8:00am～16:00pm分别用100 μ g/ml、2 00 μ g/ml、4 00 μ g/ml琼玉膏养殖水孵育8h,16:00pm～次日8:00am用200 μM过氧化氢养殖水孵育16h,持续6周。检测指标及对应方法:（1）生化试剂盒检测超氧化物歧化酶（SOD）,丙二醛（MDA）水平;（2）实时定量PCR（Real time PCR）检测Klotho基因表达水平;（3）免疫印迹法（Western blotting）检测Klotho蛋白表达水平;（4）甲基特异性PCR（Methylmion specific PCR,MSP）检测Klotho基因甲基化水平。结果:1.琼玉膏浓度梯度预实验结果:0 μ g/ml、100 μ g/ml、200 μ g/ml、400 μ g/ml组,3月龄斑马鱼4周存活率均为100%;琼玉膏浓度为800 μ g/ml、1600 μ g/ml、3200μ g/ml时,3月龄斑马鱼4周存活率低于100%,从数据结果分析,琼玉膏浓度达到800 μ g/ml时可能药物浓度过高,我们确定琼玉膏浓度梯度为:100 μ g/ml为低浓度琼玉膏组,200 μ g/ml为中浓度琼玉膏组,400 μ g/ml为高浓度琼玉膏组。H2O2浓度梯度预实验表明,H2O2浓度在200 μM以下时,斑马鱼4周存活率均为100%,随着H2O2浓度在400 μM或以上时,斑马鱼出现死亡,从结果分析,我们确定选用浓度为200μM H202作为建模衰老斑马鱼的氧化剂。2.斑马鱼血清SOD结果:多组间差异具有显着统计学意义（P=0.000,P<0.01）。对照组与实验组间Dunett（邓尼特）检验显示:模型组vS正常对照组,P=0.000;低浓度琼玉膏组vs正常对照组,P=0.000;中浓度琼玉膏组vs正常对照组,P=0.000;Evs正常对照组,P=0.090;以上数据表明低浓度琼玉膏组及中浓度琼玉膏组SOD值明显低于正常对照组SOD值,且差异有显着统计学意义,P<0.01;而高浓度琼玉膏组SOD值几乎接近正常对照组SOD值,差异无统计学意义,P>0.05,反映高浓度琼玉膏干预下,衰老斑马鱼中的抗氧化酶SOD几乎接近正常值,抗氧化效果较确切。模型组与实验组间Bonferroni（邦弗伦尼）检验显示:模型组vs低浓度琼玉膏组,P=1.000;模型组vs中浓度琼玉膏组,P=0.000;模型组vs高浓度琼玉膏组,P=0.000;低浓度琼玉膏组vs中浓度琼玉膏组,P=0.001;低浓度琼玉膏组vs高浓度琼玉膏组,P=0.000;中浓度琼玉膏组vs高浓度琼玉膏组,P=0.000;以上数据表明低浓度琼玉膏对提高已造成氧化衰老斑马鱼SOD值无明显效果,差异无统计学意义,P>0.05;但中浓度琼玉膏组及高浓度琼玉膏组对提高衰老斑马鱼SOD值有明显效果,且高浓度琼玉膏效果优于中浓度琼玉膏,差异有显着统计学意义,P<0.01。3.斑马鱼肾组织MDA结果:多组间差异具有显着统计学意义（P=0.000,P<0.01）,对照组与实验组间Dunett（邓尼特）检验显示:模型组vs正常对照组,P=0.000;低浓度琼玉膏组vs正常对照组,P=0.000;中浓度琼玉膏组vs正常对照组,P=0.000;高浓度琼玉膏组vs正常对照组,P=0.018;以上数据表明低、中、高三个浓度琼玉膏组MDA值与正常对照组MDA值间差异有统计学意义,P<0.05,反映低、中、高三个浓度琼玉膏组干预下均未能使衰老斑马鱼中的自由基MDA值下降到接近正常水平。模型组与实验组间Bonferroni（邦弗伦尼）检验显示:模型组vs低浓度琼玉膏组,P=1.000;模型组vs中浓度琼玉膏组,P=0.001;模型组vs高浓度琼玉膏组,P=0.000;低浓度琼玉膏组vs中浓度琼玉膏组,P=0.002;低浓度琼玉膏组vs高浓度琼玉膏组,P=0.000;中浓度琼玉膏组vs高浓度琼玉膏组,P=0.056;以上数据表明低浓度琼玉膏组MDA值与模型组MDA值间差异无统计学意义,P>0.05,反映低浓度琼玉膏对降低已衰老斑马鱼MDA值效果不明显;中浓度琼玉膏组及高浓度琼玉膏组对降低已衰老斑马鱼MDA值效果较为确切,差异有显着统计学意义,P<0.01,但中浓度琼玉膏组效果与高浓度琼玉膏组间差异无统计学意义,P>0.05,这反映可能琼玉膏浓度达到200 μ g/ml以后,增加琼玉膏浓度并不能增加其降低衰老斑马鱼MDA值的效果。4.Real time PCR反应体系检测肾组织Klotho基因表达结果:多组间差异具有显着统计学意义（P=0.000,P<0.01）,对照组与实验组间Dunett（邓尼特）检验显示:模型组vs正常对照组,P=0.000,低浓度琼玉膏组vs正常对照组,P=0.000,中浓度琼玉膏组vs正常对照组,P=0.000,高浓度琼玉膏组vs正常对照组,P=0.209,以上数据表明,低浓度琼玉膏组及中浓度琼玉膏组肾Klotho基因表达水平与正常对照组间差异有显着统计学意义,P<0.01,而高浓度琼玉膏组肾Klotho基因表达水平与正常对照组间差异无统计学意义,P>0.05,反映低浓度琼玉膏及中浓度琼玉膏对增加肾组织Klotho基因表达效果不确切,但高浓度琼玉膏增加肾组织Klotho基因表达效果较为明显。模型组与实验组间Bonferroni（邦弗伦尼）检验显示:模型组vs低浓度琼玉膏组,P=1.000;模型组vs中浓度琼玉膏组,P=0.000;模型组vs高浓度琼玉膏组,P=0.000;低浓度琼玉膏组vs中浓度琼玉膏组,P=0.000;低浓度琼玉膏组vs高浓度琼玉膏组,P=0.000;中浓度琼玉膏组vs高浓度琼玉膏组,P=0.000;以上数据表明低浓度琼玉膏对促进衰老斑马鱼的肾Klotho基因表达无明显效果,差异无统计学意义,P>0.05,但中浓度琼玉膏及高浓度琼玉膏对促进衰老斑马鱼的肾Klotho基因表达有明显效果,且高浓度琼玉膏组优于中浓度琼玉膏组,差异有显着统计学意义,P<0.01。5.Westen blotting检测肾组织Klotho蛋白表达结果:多组间差异具有显着统计学意义（P=0.000,P<0.01）,对照组与实验组间Dunett（邓尼特）检验显示:模型组vs正常对照组,P=0.000,低浓度琼玉膏组vs正常对照组,P=0.000,中浓度琼玉膏组vs正常对照组,P=0.002,高浓度琼玉膏组vs正常对照组,P=0.095;以上数据表明,低、中浓度琼玉膏组肾Klotho蛋白表达水平与正常对照组肾Klotho蛋白表达水平差异有显着统计学意义,P<0.01,但高浓度琼玉膏组肾Klotho蛋白表达水平与正常对照组肾Klotho蛋白表达水平差异无统计学意义,P>0.05,反映只有高浓度琼玉膏能使衰老斑马鱼肾Klotho蛋白表达水平接近正常水平。模型组与实验组间Bonferroni（邦弗伦尼）检验显示:模型组vs低浓度琼玉膏组,P=1.000;模型组vs中浓度琼玉膏组,P=0.006;模型组vs高浓度琼玉膏组,P=0.000;低浓度琼玉膏组vs中浓度琼玉膏组,P=0.038;低浓度琼玉膏组vs高浓度琼玉膏组,P=0.001;中浓度琼玉膏组vs高浓度琼玉膏组,P=0.382;以上数据表明,低浓度琼玉膏组肾Klotho蛋白表达水平与模型组肾Klotho蛋白表达差异无统计学意义,P>0.05,而中、高浓度琼玉膏组与模型组间肾Klotho蛋白表达水平差异有统计学意义,P<0.05,反映低浓度琼玉膏对增加易造成衰老的斑马鱼肾Klotho蛋白表达水平无明显效果,而中浓度琼玉膏及高浓度琼玉膏对增加易造成衰老的斑马鱼肾Klotho蛋白表达水平有较明显效果,且高浓度琼玉膏优于中浓度琼玉膏,差异有统计学意义,P<0.05。6.甲基特异性 PCR（Methylmion specific PCR,MSP）检测肾组织 Klotho 基因甲基化结果:在正常:对照组中,表现为部分甲基化,在模型组和低中剂量组表现为全甲基化,在高剂量琼玉膏组表现为部分甲基化。结论:在过去琼玉膏抗衰老机制研究的基础上,对新的动物模型斑马鱼完善了的琼玉膏浓度梯度预实验,通过观察比较成年斑马鱼的成活率,最终选取100 μ g/ml为低浓度琼玉膏组,200 μg/ml为中浓度琼玉膏组,400 μ g/ml为高浓度琼玉膏组,探索确定了诱导斑马鱼衰老的适当H202浓度为200 μ M。在抗氧化相关指标衰老斑马鱼血清SOD以及肾MDA自由基生产量研究中,可发现中浓度琼玉膏及高浓度琼玉膏对提高氧化衰老斑马鱼SOD值有明显效果,且高浓度琼玉膏效果优于中浓度琼玉膏,高浓度琼玉膏可将衰老斑马鱼血清SOD提高至与正常对照组水平,抗氧化效果较明显。中浓度琼玉膏组及高浓度琼玉膏组对降低氧化衰老斑马鱼MDA值效果较为明显,但琼玉膏浓度达到中浓度200 μ g/ml以后,增加琼玉膏浓度并不能增加其降低衰老斑马鱼MDA值的效果,且低、中、高三个浓度琼玉膏组对降低衰老斑马鱼MDA值均未能达到正常对照组水平。综上所述,琼玉膏对提高衰老斑马鱼抗氧化酶并使其自由基得到一定量清除,证明了琼玉膏可能通过抗氧化应激损伤从而延缓衰老的机制。在过去sirtl/p53信号通路研究琼玉膏延缓斑马鱼衰老的研究基础上,本实验创新研究衰老斑马鱼Klotho/FGF-23信号通路,并发现琼玉膏可提高衰老斑马鱼Klotho基因及蛋白的表达水平,还可一定程度上逆转衰老斑马鱼肾组织Klotho基因甲基化水平,为琼玉膏抗衰老分子机制研究开拓了新的领域。关于琼玉膏抗衰老的机制研究,笔者的导师及其团队在过去10年做了很多工作,对琼玉膏抗衰老蛋基因组学、蛋白组学及代谢组学等方面有丰富的研究基础,过去实验发现琼玉膏的组方虽然简约,却具有很好抗氧化、抗衰老、美容等功效,从中医机制而言,琼玉膏通过健脾补肾,起到充养先天补后天,调补后天以滋养先天的作用;从现代医学机理而言,琼玉膏可能通过逆转抗衰老基因的甲基化、抗氧化、促进抗衰老基因及蛋白的表达,从而促进相关信号通路的表达,起到延缓衰老的作用。本课题是建立在过去研究的基础上不断创新,在导师“全养生”理念指导下,不断更全面、更深入研究,预期通过科研实验,将琼玉膏这一经典养生古方转化为人们可方便使用的养生保健产品、用品。抗衰老工程是一个系统工程,应当涵盖我们的日常生活、衣食住行等方方面面,琼玉膏是我们研究食疗养生、美容养生等具体养生方式的一个有巨大潜力的切入点,为更全面满足日益增长的人们对健康和美丽的需求,作为古方研究者,应该不断革新、创新研究方法和实践方法,古为今用,为当下我国人口老龄化问题以及粤港澳大湾区经济和社会的健康可持续发展作更大贡献。
柴莉[7]（2018）在《恶性黑素瘤中调控hTERT基因相关miRNAs的筛选与功能研究》文中研究说明目的:检测hTERT mRNA及其蛋白在恶性黑素瘤及色素痣石蜡包埋组织中的表达,分析hTERT mRNA表达与恶性黑素瘤临床病理特征及其蛋白之间的关系;预测并筛选恶性黑素瘤中调控hTERT基因的相关miRNAs,分析候选miRNAs与hTERT mRNA表达之间的关系;通过细胞功能学实验探索过表达或抑制相关miRNAs表达后对hTERT mRNA及其蛋白表达的影响;采用双荧光素酶报告基因实验分析相关miRNAs与hTERT基因的靶向调控机制。方法:采用qPCR及免疫组化检测hTERT mRNA及其蛋白在恶性黑素瘤及色素痣石蜡包埋组织中的表达;通过TargetScan在线软件预测hTERT基因调控相关的miRNAs,按照筛选标准筛选出候选miRNAs;采用定制的miRNA PCR Array检测候选miRNAs在恶性黑素瘤和色素痣石蜡包埋组织中的表达情况,筛选出相关差异表达的miRNAs;合成相关差异miRNAs的类似物和抑制物,转染到人恶性黑素瘤A 375细胞中,通过MTT法、流式细胞术、划痕实验和Transwells方法检测转染前后人恶性黑素瘤A375细胞的增殖、周期、凋亡、迁移和侵袭能力等生物学行为的变化,同时采用qPCR及western-blot技术检测转染前后hTERT mRNA及其蛋白的变化水平;采用双荧光素酶报告基因实验探索相关差异miRNAs靶向调控hTERT基因的机制。结果:恶性黑素瘤组织中hTERT mRNA及其蛋白的表达均高于色素痣,发生远处转移者hTERT mRNA表达明显高于未发生者,且hTERT mRNA的表达与hTERT蛋白的表达呈正相关关系。经预测和筛选,共筛选出14个候选miRNAs,经定制的miRNA PCR Array检测发现5个差异表达的miRNAs:miR-497-5p、miR-195-5p和miR-455-3p表达明显下调,而miR-212-5p和mi R-424-5p表达明显上调;且miR-497-5p、miR-195-5p和miR-455-3p的表达与hTERT mRNA及其蛋白的表达呈负相关。细胞功能学实验结果表明:过表达miR-497-5p、miR-195-5p和miR-455-3p均能够显着抑制人恶性黑素瘤A375细胞的增殖、迁移和侵袭能力,并阻滞细胞周期、促进细胞凋亡;而抑制miR-497-5p、miR-195-5p和miR-455-3p的表达后均能够逆转过表达的效应。同时,过表达miR-497-5p、miR-195-5p和mi R-455-3p后hTERT mRNA及其蛋白表达均明显减少。双荧光素酶报告基因实验结果显示,miR-497-5p、miR-195-5p和miR-455-3p通过与hTERT基因3’UTR区直接结合参与调控恶性黑素瘤的发生和发展。结论:在人恶性黑素瘤中,miR-497-5p、miR-195-5p和miR-455-3p通过直接靶向作用于hTERT 3’UTR区发挥抑癌基因样作用,有望成为恶性黑素瘤靶向治疗的新选择。
闫泽晨[8]（2017）在《PHD3对Desmin的调控在前列腺癌骨转移中的作用及分子机制》文中提出背景前列腺癌是泌尿外科较为常见的一种恶性肿瘤。全球癌症发病率及致死率情况统计中,前列腺癌占全球癌症总发病率的7.8%;而在致死率方面,前列腺癌的癌症相关死亡率也仅次于肺癌、乳腺腺癌及结直肠癌。在我国,随着寿命的延长、健康意识的提高及前列腺癌早期诊断方法的不断进步,前列腺癌新发病例呈逐年增加趋势,据预测,未来相当长的一段时期内可能还会存在一个较大程度的増长。前列腺癌的早期诊断和治疗对疾病的预后具有重要意义。随着医疗技术的提高,目前多种方法可在早期发现前列腺癌。但即便如此,仍有较大比例的患者在发现时已发生骨转移。骨骼是前列腺癌的首要转移靶器官。发生骨转移的前列腺癌患者治疗难度加大,且患者常出现周身骨骼疼痛、骨折、瘫痪等,严重影响前列腺癌患者的生活质量。目前前列腺癌骨转移的发生原因并不清楚。明确骨转移的发生机制对延长患者的生存期及改善生活质量具有重要意义。研究目的1筛选、鉴定与前列腺癌发生及骨转移相关的差异性表达蛋白;2检测筛选得到的差异蛋白PHD3及Desmin在前列腺癌中的表达及相关性;3探究PHD3对Desmin的调控在前列腺癌骨转移过程中的作用及分子机制,为前列腺癌的治疗提供新的靶点。研究方法1前列腺癌发生及骨转移相关差异性表达蛋白的筛选与鉴定1.1 SELDI-TOF-MS筛选前列腺癌发生及骨转移相关差异性表达蛋白应用SELDI-TOF-MS技术测定前列腺癌癌旁组（癌旁组）、前列腺癌无骨转移组（无骨转移组）及前列腺癌骨转移组（骨转移组）组织标本的差异性表达蛋白的m/z值。1.2前列腺癌发生及骨转移相关差异性表达蛋白的分离与鉴定应用TRICINE-聚丙烯酰胺凝胶电泳（TRICINE-SDS-PAGE）、MALDI-TOF/TOF-MS技术分离纯化、鉴定前列腺癌骨转移相关差异性表达蛋白。2 PHD3及Desmin在前列腺癌中的表达及二者的相关性分析2.1免疫组织化学检测组织标本中PHD3及Desmin的表达水平并分析二者相关性使用免疫组织化学技术观察PHD3及Desmin在癌旁组、无骨转移组及骨转移组组织标本中的表达情况。统计学方法分析PHD3与Desmin二者表达的相关性。2.2免疫印记分析组织标本中PHD3及Desmin的蛋白表达水平提取各组标本的总蛋白,Western blot法检测PHD3及Desmin在不同组组织中的表达水平。2.3实时荧光定量PCR技术检测组织标本中PHD3及Desmin的m RNA水平以癌旁组织为对照,应用实时荧光定量PCR技术检测不同组的前列腺癌肿瘤组织中PHD3及Desmin的m RNA水平。3 PHD3及Desmin在前列腺癌骨转移中的作用及分子机制3.1 PHD3对Desmin m RNA及蛋白表达水平的影响使用sh RNA干扰PHD3蛋白表达,Western blot及q RT-PCR检测Desmin m RNA及蛋白表达水平。使用过表达质粒转染LNCa P细胞后,再次使用上述方法检测Desmin m RNA及蛋白表达水平。免疫荧光观察Desmin表达定位及多少变化。明确PHD3对Desmin表达的调控作用。3.2 PHD3可通过结合于NEDD4蛋白从而抑制NEDD4与Desmin的结合使用免疫共沉淀的方法检测PHD3与NEDD4是否能够结合。使用sh RNA干扰PHD3表达后观察NEDD4蛋白表达是否受影响。并通过免疫共沉淀的方法检测PHD3对NEDD4与Desmin的结合是否存在影响。明确PHD3、NEDD4及Desmin三者的相互结合及影响。3.3裸鼠成瘤实验验证过表达Desmin对PHD3缺失的LNCa P增殖及转移的影响细胞分组:正常培养LNCa P组,sh RNA干扰PHD3组,sh RNA干扰PHD3+过表达Desmin组。检测各组PHD3及Desmin的蛋白表达水平。通过裸鼠成瘤实验明确PHD3及Desmin对肿瘤细胞转移及侵袭能力的影响。结果1前列腺癌骨转移相关差异性表达蛋白的筛选与鉴定1.1 SELDI-TOF-MS筛选前列腺癌骨转移相关差异性表达蛋白应用SELDI-TOF-MS技术筛选癌旁组、无骨转移组及骨转移组标本的差异性表达蛋白,结果显示其差异性表达蛋白的m/z位于8452Da及13367Da。1.2前列腺癌发生及转移相关差异性表达蛋白的分离与鉴定应用聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离纯化目标蛋白,并将检测出的m/z位于8452Da及13367Da的肽段/蛋白质样品分别酶解及检测肽段。通过将肽段导入SEQUEST检索程序并在Bioworks数据库检索,m/z位于8452Da及13367Da的肽段/蛋白质分别为脯氨酸羟化酶3（prolyl hydroxylase 3,PHD3）与结蛋白（Desmin）。2 PHD3及Desmin在前列腺癌中的表达及相关性2.1免疫组织化学检测组织标本中PHD3及Desmin的蛋白表达水平及二者相关性免疫组织化学的方法发现在前列腺癌肿瘤组织中的PHD3及Desmin的表达水平明显低于癌旁组织中PHD3及Desmin的表达水平,且发生骨转移的患者前列腺癌组织中的PHD3及Desmin的表达水平更低。统计学方法分析发现PHD3及Desmin蛋白表达呈正相关。2.2免疫印记分析组织标本中PHD3及Desmin的蛋白表达水平应用免疫印记分析实验对上述筛选出的蛋白进行验证,结果显示在癌旁组、无骨转移组及骨转移组中,组织PHD3、Desmin的蛋白表达均呈逐渐降低趋势。2.3实时荧光定量PCR技术检测组织标本中PHD3及Desmin的m RNA水平实时荧光定量PCR技术发现在前列腺癌肿瘤组织中的PHD3的表达水平明显低于癌旁组织中PHD3的表达水平,且发生骨转移的前列腺癌组织中PHD3表达水平更低。而Desmin的m RNA水平在各组中无明显变化。提示Desmin可能存在转录后水平的调控。3 PHD3及Desmin在前列腺癌骨转移中的作用及分子机制3.1 PHD3对Desmin蛋白及m RNA表达水平的影响使用sh RNA及过表达质粒对PHD3表达进行干预,q RT-PCR结果提示干预效率高,可用于后续实验。使用sh RNA干扰PHD3蛋白表达后,Desmin蛋白及m RNA表达水平均显着下降。使用PHD3过表达质粒转染LNCa P细胞后,Desmin蛋白表达量显着上调,但m RNA水平无明显变化。免疫荧光染色提示,过表达PHD3后Desmin表达升高。提示PHD3对Desmin存在转录后调控作用。3.2 PHD3可通过结合于NEDD4蛋白从而抑制NEDD4与Desmin的结合免疫共沉淀结果提示:PHD3与NEDD4可直接结合。干扰PHD3表达虽然对NEDD4蛋白水平并无显着影响,但其与Desmin的结合显着增加,而反应体系中加入纯化PHD3后,NEDD4与Desmin的结合受到抑制。提示PHD3不影响NEDD4表达,但通过与其结合,影响NEDD4对Desmin的调控作用。3.3裸鼠成瘤实验验证过表达Desmin对PHD3缺失的LNCa P增殖及转移的影响裸鼠成瘤实验结果提示,干扰PHD3可明显增加前列腺癌的肿瘤转移,但过表达Desmin可抑制PHD3缺失导致的肿瘤细胞转移及侵袭。结论1使用SELDI-TOF-MS技术筛选并分离鉴定出前列腺癌发生及骨转移相关蛋白PHD3及Desmin。2 PHD3及Desmin与人前列腺癌骨转移相关,二者在发生转移的肿瘤组织中表达显着下降并呈正相关性。3 PHD3通过与NEDD4结合,竞争性抑制NEDD4对Desmin的结合及降解作用。恢复PHD3及Desmin表达可能是抑制前列腺癌骨转移的治疗新靶点。创新性本研究通过蛋白质组学的方法筛选并鉴定出前列腺癌骨转移相关的差异表达蛋白PHD3及Desmin,发现二者在前列腺癌特别是发生骨转移的组织中表达下降,且呈正相关性。在机制上,PHD3可通过结合于NEDD4,竞争性抑制NEDD4对Desmin的结合及调控作用。动物实验进一步证实,PHD3表达降低可促进前列腺癌转移,恢复Desmin的表达则对前列腺癌的转移具有重要的抑制作用。PHD3调控的Desmin在前列腺癌骨转移中的作用尚未见文献报道。通过干预PHD3调控的Desmin通路可能为抑制前列腺癌的转移提供新的治疗靶点。
营孙阳,熊加秀,麦洪旭,林佳佳,姜丽娜,程龙,叶棋浓[9]（2016）在《端粒酶调控研究进展》文中认为端粒酶主要包括催化组分端粒酶逆转录酶（Telomerase reverse transcriptase,TERT）和端粒酶RNA组分（Telomerase RNA component,TERC）,二者与其他端粒酶复合体亚基共同组装成具有延伸端粒末端功能的全酶,在细胞衰老和肿瘤发生过程中发挥关键的作用。端粒酶调控的分子机制复杂,调控过程包括组装前各组分的转录调节、转录后调控、翻译后修饰以及亚细胞定位的调控,还包括组装过程中各组分的运输和装配的调控,以及组装后募集到端粒末端的调控。本文从以上几个方面对端粒酶的调控机制进行了综述,旨在为端粒酶相关领域的研究以及开发以端粒酶为靶点的药物奠定理论基础。
李海龙[10]（2015）在《PinX1基因作为肾癌的独立预后因子通过NF-κB/MMP-2信号通路抑制其转移的研究》文中进行了进一步梳理目的利用组织芯片研究PinX1基因与肾癌转移及预后的关系;利用体外体内实验研究其在肾癌细胞转移过程中的具体分子机制。方法1.对本实验室已构建完成的具有完整临床资料和随访信息的两套独立的肾癌患者组织芯片（共353例）进行免疫组化染色,并对PinX1染色进行评分,研究PinX1与肾癌临床特征的相关性,探讨其与肾癌转移及预后的关系。利用Cox回归分析判断PinX1是否可作为独立预后因子判断肾癌患者的预后。2.利用PinX1 siRNA及pEGFP-C3-PinX1表达载体转染人肾癌786-O和ACHN细胞,Western Blot检测转染后两株肾癌细胞中PinX1蛋白表达情况,确定PinX1 siRNA及pEGFP-C3-PinX1表达载体的有效性。CCK-8细胞增殖实验检测PinX1基因低表达及高表达对两株肾癌细胞增殖能力的影响。细胞迁移、侵袭实验检测PinX1基因低表达及高表达对肾癌786-O和ACHN细胞迁移、侵袭能力的影响。Western Blot实验检测PinX1基因低表达及高表达对两株肾癌细胞中MMPs及TIMPs蛋白表达的影响;明胶酶谱实验检测PinX1基因低表达及高表达对两株肾癌细胞MMPs活性的影响。为证实PinX1通过MMP-2调节肾癌细胞的转移能力,在PinX1基因低表达的两株肾癌细胞中加入MMP-2外源性抑制剂阻断MMP-2通路,观察阻断MMP-2通路后低表达PinX1对肾癌细胞迁移和侵袭能力的影响。为证实PinX1通过NF-κB通路调节MMP-2的表达及活性进而调控肾癌细胞的转移能力。Western Blot及RT-PCR检测PinX1基因低表达及高表达的两株肾癌细胞中NF-κB p65的蛋白表达及mRNA的表达;Western Blot检测p65的核、浆分布。对肾癌786-O及ACHN细胞同时转染PinX1 siRNA和p65-siRNA与单独转染PinX1 siRNA的细胞相比较,Western Blot检测PinX1低表达或PinX1和p65同时低表达的肾癌细胞中MMP-2表达的变化。迁移、侵袭实验检测PinX1低表达或PinX1和p65同时低表达的肾癌细胞迁移、侵袭能力的变化。3.包装携带PinX1表达基因及PinX1 shRNA的慢病毒及对照病毒,对肾癌786-O细胞进行转染,构建PinX1高、低表达及对照的肾癌稳转细胞系。Western blot鉴定稳转细胞系PinX1蛋白的表达情况。自裸鼠尾静脉注射PinX1高、低表达及对照的肾癌稳转细胞,建立裸鼠肾癌肺转移模型。2月后处死裸鼠,检测肺部转移瘤情况,对转移瘤进行统计、比较。免疫组化检测转移瘤中PinX1、MMP-2、p65的表达情况。结果1.组织芯片染色显示与正常组织及癌旁组织相比肾癌组织中PinX1表达显着降低;研究PinX1的表达与肾癌临床特征的相关性显示:在试验组中PinX1表达水平与肿瘤浸润程度,区域淋巴结转移及TNM分期呈负相关（Two sided Fisher’s exact tests,P值分别为0.018,0.043和0.013）,验证组中PinX1表达水平同样与肿瘤浸润程度,淋巴结转移及TNM分期呈负相关（Two sided Fisher’s exact tests,P值分别为0.001,0.006和0.002）;分析PinX1表达水平与肾癌患者预后的关系显示:PinX1表达水平与术后5年总生存时间及疾病特异性生存时间均呈正相关（Log-rank test,P值均为0.002）。单因素及多因素Cox回归分析提示PinX1可作为判断肾癌患者预后的独立预测分子。2.分别使用PinX1 siRNA和pEGFP-C3-PinX1表达载体转染人肾癌细胞786-O和ACHN后Western Blot实验显示:与对照组相比,转染PinX1 siRNA成功降低786-O和ACHN细胞中PinX1的表达,转染pEGFP-C3-PinX1成功在两株肾癌细胞中高表达PinX1;CCK-8增殖实验显示:PinX1基因低表达和高表达对两株肾癌细胞增殖能力的影响均无统计学意义（P>0.05）;迁移实验显示,PinX1基因的低表达或高表达可显着提升或抑制肾癌细胞的迁移能力（P<0.001）;侵袭实验显示,PinX1基因的低表达或高表达可显着提升或抑制肾癌细胞的侵袭能力（P<0.001）;Western Blot实验显示:PinX1低表达或高表达可增强或降低MMP-2的表达,但MMP-9的表达无明显改变,且PinX1基因低表达和高表达对基质金属蛋白酶特异性内源性抑制剂TIMP-1及TIMP-2的表达均无明显影响;明胶酶谱实验显示:PinX1低表达或高表达可增强或降低MMP-2的活性。以上结果提示PinX1基因可抑制肾癌细胞的迁移、侵袭能力,同时抑制其MMP-2的表达及活性,但其对MMP-2的调节是不依赖与TIMP-2的。利用MMP-2的外源性抑制剂处理经PinX1 siRNA沉默的肾癌细胞,Western Blot实验显示经MMP-2外源性抑制剂处理后,因PinX1被干扰后引起的MMP-2表达的上调被阻断;明胶酶谱实验显示:经MMP-2外源性抑制剂处理后,因PinX1被干扰后引起的MMP-2活性的增加被阻断;迁移、侵袭实验显示:肾癌细胞原本因PinX1干扰而提升的迁移、侵袭能力在MMP-2外源性抑制剂处理后又降回至常规水平（P<0.001）。以上结果提示:PinX1可通过MMP-2调节肾癌细胞的转移能力。Western blot检测PinX1低表达和高表达的两株肾癌细胞中NF-κB p65的表达情况显示:PinX1的低表达或高表达可增强或减弱p65的蛋白表达;RT-PCR结果显示:PinX1的低表达或高表达可增强或减弱p65的mRNA的表达水平;Western blot检测PinX1低表达的两株肾癌细胞中p65发生了明显的核转位。这表明PinX1低表达可以上调p65的转录并增加其核转位,从而激活NF-κB通路的转录活性。NF-κB p65 siRNA与PinX1 siRNA共转染肾癌786-O及ACHN细胞,与PinX1 siRNA单独转染细胞对比,Western blot结果显示:PinX1干扰后MMP-2表达水平上调,而当PinX1和p65双干扰后MMP-2表达又回调至正常水平;迁移、侵袭实验结果显示:PinX1干扰后肾癌细胞的迁移、侵袭能力均明显增加（P<0.001）,而当PinX1和p65双干扰后细胞的迁移、侵袭能力又回调至正常水平（P<0.001）。以上结果进一步提示PinX1可通过NF-κB/MMP-2信号通路调节肾癌细胞的迁移、侵袭能力。3.包装携带PinX1表达基因或PinX1 shRNA的慢病毒,对肾癌786-O细胞进行转染,构建PinX1高表达及低表达的肾癌稳转细胞系。Western blot结果显示:PinX1高、低表达的肾癌稳转细胞系成功过表达或敲减了PinX1。裸鼠肾癌肺转移模型建立2月后,处死并解剖裸鼠,肺组织石蜡切片H&E染色显示:肺部新生结节为肾癌转移瘤;对各组肺部转移结节进行统计,结果显示:PinX1低表达组的裸鼠肺转移结节数明显多于PinX1高表达组及对照组,且各组间均存在显着差异（χ2 test,P<0.001）;免疫组化显示:PinX1高表达或低表达组的转移瘤中MMP-2及p65同时呈低表达或高表达,且TIMP-2的表达无明显变化。以上结果进一步在体内验证了PinX1通过NF-κB/MMP-2信号通路调节肾癌细胞转移能力的机制。结论综上所述,我们在该研究中得出的结论是:与正常肾组织及癌旁组织相比肿瘤组织中PinX1表达降低,且其降低与淋巴结转移,肿瘤TNM分期及患者预后不良高度相关,Cox回归分析提示PinX1可作为独立预测分子判断肾癌患者的预后。体内及体外实验证实,PinX1可通过NF-κB/MMP-2信号通路调节肾癌细胞的转移能力。我们的工作对以后研究PinX1在肿瘤转移中的作用提供了重要的线索,并有望为肾癌的分子诊断和基因治疗提供新的靶点。
二、端粒酶RNA及蛋白组分在泌尿系统研究进展（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、端粒酶RNA及蛋白组分在泌尿系统研究进展（论文提纲范文）
（1）基于代谢/蛋白组学及网络药理学研究补阴补阳剂的抗衰老作用（论文提纲范文）
| 缩略语表 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 引言 |
| 第一部分 文献综述 |
| 一、代谢组学、蛋白质组学和网络药理学技术及应用 |
| 二、衰老的研究进展 |
| 三、六味地黄丸、金匮肾气丸调节衰老的研究进展 |
| 第二部分 基于UPLC-Q-TOF/MS技术的代谢组学研究 |
| 一、血浆代谢组学 |
| 1 实验方案 |
| 2 小鼠血浆代谢物质分析 |
| 3 补阴(六味地黄丸)、补阳(金匮肾气丸)方剂对衰老小鼠血浆代谢物的调节 |
| 二、脾组织代谢组学 |
| 1 实验方案 |
| 2 小鼠脾组织代谢物质分析 |
| 3 补阴、补阳方剂对衰老小鼠脾组织代谢物的调节 |
| 三、肾组织代谢组学 |
| 1 实验方案 |
| 2 小鼠肾组织代谢物质分析 |
| 3 补阴(六味地黄丸)、补阳(金匮肾气丸)剂对衰老小鼠肾组织代谢物的调节 |
| 第三部分 基于iTRAQ的定量蛋白质组学技术探究补阴补阳方剂对自然衰老小鼠的调节作用 |
| 一、实验方案 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 LC-MS/MS分析条件 |
| 4 蛋白定性和定量分析 |
| 二、实验结果 |
| 1 蛋白定量结果 |
| 2 聚丙烯酰胺凝胶电泳检测结果 |
| 3 质谱分析结果 |
| 4 数据分析结果 |
| 5 六味地黄丸对衰老相关差异蛋白的调节分析 |
| 6 金匮肾气丸对衰老相关差异蛋白的调节分析 |
| 三、小结 |
| 第四部分 基于网络药理学方法结合分子对接技术探究补阴补阳方剂抗衰老的作用机制 |
| 第一节 六味地黄丸抗衰老作用机制的网络药理学研究 |
| 第二节 金匮肾气丸抗衰老作用机制的网络药理学研究 |
| 第三节 采用分子对接技术分析补阴、补阳方剂抗衰老作用机制 |
| 第五部分 讨论 |
| 一、衰老进程中代谢物质和蛋白变化 |
| 1 不同组织样本中衰老代谢标志物及通路的差异比较 |
| 2 不同性别衰老小鼠肝组织中蛋白的变化比较 |
| 二、比较六味地黄丸、金匮肾气丸对衰老相关代谢标志物和差异蛋白的调节 |
| 1 六味地黄丸、金匮肾气丸对衰老相关代谢标志物的调节 |
| 2 六味地黄丸、金匮肾气丸调节衰老相关蛋白及通路的比较分析 |
| 3 六味地黄丸、金匮肾气丸调节衰老相关代谢标志物及蛋白的联合分析 |
| 第六部分 结论 |
| 参考文献 |
| 创新点说明 |
| 致谢 |
| 博士在读期间发表的论文 |
| 个人简历 |
（2）EGF基因多态性与膀胱癌和肾癌关系的病例对照研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 研究对象 |
| 1.2 研究对象纳入及排除标准 |
| 1.3 样本量的估计 |
| 1.4 基线资料的收集 |
| 1.5 调查指标界定及变量定义 |
| 1.6 EGF基因多态位点选择 |
| 1.7 实验仪器与试剂 |
| 1.8 实验方法 |
| 1.9 统计学处理 |
| 1.10 质量控制 |
| 2 结果 |
| 2.1 EGF基因多态性与膀胱癌关系的病例对照研究 |
| 2.2 EGF基因多态性与肾癌关系的病例对照研究 |
| 3 讨论 |
| 3.1 生活行为习惯与膀胱癌和肾癌的关系 |
| 3.2 EGF基因多态性与膀胱癌和肾癌的关系 |
| 3.3 膀胱癌和肾癌基因型与临床特征的关系 |
| 3.4 基因-环境交互作用与膀胱癌肾癌的关系 |
| 3.5 血清中EGF蛋白浓度与膀胱癌和肾癌的关系 |
| 3.6 癌和癌旁组织中EGFmRNA相对含量 |
| 3.7 展望与不足 |
| 4 结论 |
| 参考文献 |
| 文献综述 表皮生长因子基因与膀胱癌和肾癌关系研究进展 |
| 参考文献 |
| 附录 缩略语表 |
| 攻读学位期间发表文章情况 |
| 个人简历 |
| 致谢 |
| 生活状况与健康调查表 |
（3）归肾丸改善氧化应激治疗早发性卵巢功能不全的临床及实验研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 第一部分 文献综述 |
| 综述一 中医药治疗早发性卵巢功能不全的研究进展 |
| 1. 病因病机 |
| 2. 中医药治疗 |
| 3. 讨论与展望 |
| 参考文献 |
| 综述二 氧化应激在卵巢衰老中的作用机制研究进展 |
| 1. ROS、OS与卵巢的生理病理 |
| 2. OS性衰老 |
| 3. OS和卵巢衰老 |
| 4. 小结 |
| 参考文献 |
| 前言 |
| 第二部分 基于网络药理学探讨归肾丸治疗早发性卵巢功能不全的作用机制 |
| 1. 研究方法 |
| 2. 研究结果 |
| 3. 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 加减归肾丸改善氧化应激治疗早发性卵巢功能不全的临床研究 |
| 1. 临床资料 |
| 2. 观测指标 |
| 3. 结果 |
| 4. 讨论 |
| 5. 小结 |
| 参考文献 |
| 第四部分 表儿茶素通过PI3K/AKT/Nrf2信号通路改善H_2O_2介导的人卵巢颗粒细胞KGN氧化应激状态的实验研究 |
| 1. 实验材料 |
| 2. 实验方法 |
| 3. 结果 |
| 4. 讨论 |
| 5. 小结 |
| 参考文献 |
| 结语 |
| 致谢 |
| 附录 |
| 在学期间主要研究成果 |
（4）肾细胞癌组织中hTERT启动子甲基化水平与其临床病理意义（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 第一部分 人TERT启动子甲基化水平及其与肾细胞癌病理特征的关系研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 附图 |
| 参考文献 |
| 第二部分 人hTERT启动子甲基化水平等影响肾细胞癌预后的多因素分析 |
| 前言 |
| 对象与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 附图表 |
| 参考文献 |
| 综述 肾癌DNA甲基化研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文目录 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
| 附英文文章 |
（5）二硫化钼传感阵列的构建及在膀胱癌标志物检测中的应用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 膀胱癌诊断研究进展 |
| 1.1.1 膀胱癌诊断方法概述 |
| 1.1.2 膀胱癌生物标志物研究 |
| 1.2 场效应晶体管传感器及其应用 |
| 1.2.1 场效应晶体管传感器的工作原理 |
| 1.2.2 场效应晶体管传感器用于生物标志物检测 |
| 1.3 二硫化钼材料简介 |
| 1.3.1 二硫化钼材料及其制备方法概述 |
| 1.3.2 二硫化钼纳米薄片在场效应晶体管生物传感器中的应用 |
| 1.4 本论文研究思路 |
| 第二章 二硫化钼场效应晶体管阵列的制备及性能测试 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 试剂与仪器 |
| 2.2.2 二硫化钼的转移和二硫化钼场效应晶体管阵列的制备 |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.3.1 二硫化钼纳米薄片的表征 |
| 2.3.2 二硫化钼场效应晶体管阵列的表征 |
| 2.3.3 二硫化钼场效应晶体管的电学性能表征 |
| 2.4 本章小结 |
| 第三章 二硫化钼场效应晶体管传感阵列的制备及对膀胱癌标志物传感性能研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 试剂与仪器 |
| 3.2.2 二硫化钼场效应晶体管传感阵列的制备 |
| 3.2.3 尿液样本的预处理 |
| 3.2.4 膀胱癌标志物检测 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 二硫化钼场效应晶体管传感阵列的功能化表征 |
| 3.3.2 二硫化钼场效应晶体管传感阵列对NMP22的传感性能 |
| 3.3.3 二硫化钼场效应晶体管传感阵列对CK8的传感性能 |
| 3.3.4 二硫化钼场效应晶体管传感阵列的特异性评估 |
| 3.3.5 二硫化钼场效应晶体管传感阵列对尿液样本的传感性能 |
| 3.4 本章小结 |
| 第四章 总结与展望 |
| 参考文献 |
| 附录 :攻读硕士学位期间参与发表的科研成果 |
| 致谢 |
（6）琼玉膏通过Klotho/FGF-23信号通路延缓斑马鱼衰老的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 第一章 文献研究 |
| 第一节 衰老机制与抗衰老研究基础 |
| 一、衰老的中医学机制研究 |
| 二、中医抗衰老的基础 |
| 三、衰老与抗衰老现代医学机制研究进展 |
| 第二节 琼玉膏抗衰老相关研究概述 |
| 一、琼玉膏之古文献研究 |
| 二、琼玉膏在抗衰老领域的最新研究 |
| 第三节 斑马鱼实验模型的研究进展 |
| 一、斑马鱼实验模型的起源 |
| 二、斑马鱼实验模型的优势 |
| 三、斑马鱼实验模型在人类疾病与衰老相关领域的应用研究 |
| 第四节 Klotho、FGF-23与衰老 |
| 一、Klotho基因基本生物学特征 |
| 二、Klotho蛋白的生物学功能 |
| 三、Klotho与衰老相关疾病的研究 |
| 四、FGF-23的生物学特征 |
| 第二章 实验研究 |
| 第一节 实验准备 |
| 一、实验动物 |
| 二、实验药物与试剂 |
| 三、主要仪器设备 |
| 第二节 实验研究方案 |
| 一、预实验分组 |
| 二、正式实验分组、给药方法及指标检测 |
| 三、统计学方法 |
| 四、技术路线 |
| 五、可行性分析 |
| 第三节 实验方法 |
| 一、不同浓度琼玉膏对斑马鱼存活率影响的预实验 |
| 二、不同浓度过氧化氢对斑马鱼存活率影响的预实验 |
| 三、斑马鱼血清SOD活性检测 |
| 四、斑马鱼肾组织MDA活性检测 |
| 五、斑马鱼Klotho基因表达水平检测 |
| 六、斑马鱼Kloho蛋白表达水平检测 |
| 七、斑马鱼肾脏Klotho启动子甲基化水平检测 |
| 第四节 实验结果 |
| 一、不同浓度琼玉膏对斑马鱼存活率的影响 |
| 二、不同浓度H_2O_2对斑马鱼存活率的影响 |
| 三、斑马鱼血清SOD含量变化 |
| 四、斑马鱼肾组织MDA含量变化 |
| 五、斑马鱼肾组织Klotho基因表达水平变化 |
| 六、斑马鱼肾组织Klotho蛋白表达变化 |
| 七、斑马鱼肾组织Klotho基因甲基化程度变化 |
| 第三章 讨论 |
| 一、不同浓度琼玉膏、H_2O_2对斑马鱼存活率的影响 |
| 二、琼玉膏对提高衰老斑马鱼抗氧化指标的影响 |
| 三、琼玉膏对衰老斑马鱼肾组织Klotho基因及蛋白表达的影响 |
| 四、琼玉膏对斑马鱼肾脏Klotho启动子甲基化影响 |
| 第四章 展望 |
| 一、“全养生”理论中延缓衰老的思想纲领 |
| 二、琼玉膏抗衰老研究在我国养老产业及粤港澳大湾区经济增长发展的重要作用 |
| 结语 |
| 一、结论 |
| 二、创新性 |
| 三、不足之处 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 在校期间发表论文情况 |
| 致谢 |
| 附件 |
| 详细摘要 |
（7）恶性黑素瘤中调控hTERT基因相关miRNAs的筛选与功能研究（论文提纲范文）
| 中英文缩略词对照表 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一部分 hTERT在黑素瘤中的表达 |
| 1 研究内容与方法 |
| 1.1 研究对象 |
| 1.2 实验相关试剂 |
| 1.3 主要实验仪器设备 |
| 1.4 实验步骤 |
| 1.5 质量控制 |
| 1.6 统计学分析 |
| 1.7 技术路线图 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第二部分 调控hTERT基因相关miRNAs的预测、筛选、表达及其与hTERT表达的相关性分析 |
| 1 研究内容与方法 |
| 1.1 调控hTERT基因相关miRNAs的预测和筛选 |
| 1.2 调控hTERT基因相关miRNAs的表达 |
| 1.3 实验步骤 |
| 1.4 调控hTERT基因相关miRNAs的表达与hTERT表达的相关性分析 |
| 1.5 质量控制 |
| 1.6 统计学分析 |
| 1.7 技术路线图 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第三部分 miR-497-5p、miR-195-5p和miR-455-3p在黑素瘤A375细胞中靶向调控hTERT的机制研究 |
| 1 研究内容与方法 |
| 1.1 研究对象 |
| 1.2 实验相关试剂 |
| 1.3 主要实验仪器设备 |
| 1.4 实验步骤 |
| 1.5 质量控制 |
| 1.6 统计学分析 |
| 1.7 技术路线图 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间获得的学术成果 |
| 个人简历 |
| 导师评阅表 |
（8）PHD3对Desmin的调控在前列腺癌骨转移中的作用及分子机制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 1 前列腺癌的研究现状 |
| 2 蛋白质组学发展现状 |
| 3 脯氨酸羟化酶(PHDs)研究进展 |
| 4 结蛋白(Desmin)研究进展 |
| 参考文献 |
| 第一部分 前列腺癌骨转移骨相关差异性表达蛋白的筛选与鉴定 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 参考文献 |
| 第二部分 PHD3及Desmin在前列腺癌中的表达及相关性 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 参考文献 |
| 第三部分 PHD3及Desmin在前列腺癌骨转移中的作用及分子机制 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 综述一 前列腺癌相关诊断及预后分子标志物的研究进展 |
| 参考文献 |
| 综述二 前列腺癌患者骨转移发生机制的研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（9）端粒酶调控研究进展（论文提纲范文）
| 1 端粒酶表达水平的调控 |
| 1.1 TERT的转录水平调控 |
| 1.2 TERT的翻译后修饰 |
| 1.3 TERC的转录和转录后调控 |
| 2 端粒酶装配与运输的调控 |
| 2.1 端粒酶复合体的装配 |
| 2.2 TERC的细胞核运输 |
| 3 端粒末端对端粒酶的调控 |
| 4 展望 |
（10）PinX1基因作为肾癌的独立预后因子通过NF-κB/MMP-2信号通路抑制其转移的研究（论文提纲范文）
| 缩略词表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 统计学处理 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| PinX1:位于人染色体8p23上的单倍体不足抑癌基因 综述 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间发表学术论文 |
| 致谢 |
四、端粒酶RNA及蛋白组分在泌尿系统研究进展（论文参考文献）
- [1]基于代谢/蛋白组学及网络药理学研究补阴补阳剂的抗衰老作用[D]. 王燕. 黑龙江中医药大学, 2021(01)
- [2]EGF基因多态性与膀胱癌和肾癌关系的病例对照研究[D]. 程佳颖. 内蒙古医科大学, 2021(02)
- [3]归肾丸改善氧化应激治疗早发性卵巢功能不全的临床及实验研究[D]. 闫菲. 北京中医药大学, 2021(08)
- [4]肾细胞癌组织中hTERT启动子甲基化水平与其临床病理意义[D]. 郑建波. 山东大学, 2020(01)
- [5]二硫化钼传感阵列的构建及在膀胱癌标志物检测中的应用[D]. 杨玉洁. 武汉大学, 2020(06)
- [6]琼玉膏通过Klotho/FGF-23信号通路延缓斑马鱼衰老的研究[D]. 黄理杰. 广州中医药大学, 2019
- [7]恶性黑素瘤中调控hTERT基因相关miRNAs的筛选与功能研究[D]. 柴莉. 新疆医科大学, 2018(12)
- [8]PHD3对Desmin的调控在前列腺癌骨转移中的作用及分子机制[D]. 闫泽晨. 郑州大学, 2017(02)
- [9]端粒酶调控研究进展[J]. 营孙阳,熊加秀,麦洪旭,林佳佳,姜丽娜,程龙,叶棋浓. 遗传, 2016(04)
- [10]PinX1基因作为肾癌的独立预后因子通过NF-κB/MMP-2信号通路抑制其转移的研究[D]. 李海龙. 南京医科大学, 2015(05)