一、基因表达芯片在心血管分子生物学研究中的应用（论文文献综述）
涂丁元[1]（2021）在《构建心力衰竭基因表达调控网络并验证SRSF3在其中的作用机制》文中进行了进一步梳理一、研究背景心力衰竭是各种心脏疾病的严重表现及终末阶段,主要临床表现为呼吸困难、运动耐量下降和水肿等。虽然目前多种新型的心衰治疗药物不断涌现,但心衰发病率、再住院率及死亡率居高不下,给患者家庭和医疗体系带来了沉重的负担。近年来随着基因芯片和高通量测序技术的飞速发展,人们开始从基因层面探索心衰的发病机制,并发现了许多心衰发生发展过程中的关键基因及信号通路,促进了心衰分子靶向治疗的兴起。作为转录后调控过程中的关键一环,可变剪接与这些关键基因及信号通路密切相关。利用公共数据库对心衰关键基因及信号通路进行挖掘,并寻找心衰病理变化过程中的异常可变剪接形式及调控方式,将帮助我们发现心衰潜在的标志物,为心力衰竭的功能研究和药物开发提供新的靶点。本研究旨在寻找心衰差异表达基因的蛋白互作网络中的核心基因,并构建心衰中可变剪接的调控网络,最后对网络中关键的RNA结合蛋白在心衰中的作用机制进行初步探索。二、第一部分 心力衰竭差异表达基因的数据挖掘（一）研究目的筛选心衰差异表达基因,并寻找心衰差异表达基因蛋白互作网络中的核心基因。（二）研究方法（1）从GEO数据库中筛选并下载心衰转录组高通量测序数据集,经过数据质控、序列比对和序列片段计数后,得到每个数据集的表达矩阵。（2）对表达矩阵进行标准化,筛选心衰与非心衰样本间的差异表达基因,使用稳健排序整合算法整合所有数据集里差异表达基因。（3）对差异表达基因行功能及通路富集分析,确定差异表达基因的显着富集通路。（4）构建心衰差异表达基因的蛋白-蛋白交互作用网络,根据一定的拓扑算法计算网络中的核心基因。（5）利用生物信息学方法在GEO心衰芯片数据中验证核心基因。（6）利用qPCR在长海医院获取的14个人体心脏组织进行核心基因实验验证。（三）研究结果（1）从GEO数据库下载心衰转录组测序数据集,经过数据质控和验证,最终纳入数据集GSE46224、GSE116250、GSE133054和GSE135055用于下一步分析,四个数据集共计有心衰样本100例,非心衰供体样本38例。（2）利用稳健排序整合算法整合四个数据集中的差异表达基因,并使用Cytoscape软件及cyto Hubba插件确定心衰差异表达基因蛋白互作网络中的核心基因为ASPN、COL1A1、COL9A2、COL10A1、COMP和FMOD。（3）利用心衰基因芯片数据集进行生物信息学验证,柱状图及ROC曲线显示ASPN、COL1A1、COMP和FMOD在四个数据集中具有明显的表达差异和良好的诊断效能。（4）利用长海医院心衰患者及非心衰供体的心脏样本进行实验验证,柱状图显示ASPN、COL1A1和FMOD具有明显的表达差异。（四）研究结论ASPN、COL1A1和FMOD为心衰差异基因蛋白互作网络中的核心基因。三、第二部分 基于生物信息学构建心力衰竭中m RNA可变剪接的调控网络（一）研究目的构建心衰中RNA结合蛋白调控可变剪接的网络,并从中筛选具有重要作用的子网络。（二）研究方法首先对心衰和非心衰样本间的差异剪接事件进行分析,其次筛选到与这些可变剪接事件相关的RNA结合蛋白,然后与ENCODE数据库中RNA结合蛋白敲减后剪接模式发生变化的基因取交集,得到心衰中RNA结合蛋白调控可变剪接的网络,最后在网络中筛选与第一部分核心基因相关性高的RNA结合蛋白及其调控的可变剪接事件,得到调控网络中的关键子网络。（三）研究结果与ASPN基因相关的子网络是SRSF3、TRADBP和它们调控的可变剪接事件,与COL1A1基因相关的子网络是SRSF3、IGF2BP2和它们调控的可变剪接事件,与FMOD基因相关的子网络是SRSF3、RBFOX2和它们调控的可变剪接事件,SRSF3在三个子网络中均存在。（四）研究结论SRSF3及其调控的可变剪接事件在心衰中具有关键作用。四、第三部分 SRSF3在心力衰竭中的功能与机制探索（一）研究目的初步探索SRSF3在心力衰竭中的作用机制。（二）研究方法（1）利用Western Blot检测SRSF3在心肌细胞和非心肌细胞中的表达量有无差异。（2）利用qPCR和Western Blot检测SRSF3在大鼠心肌细胞肥大模型、大鼠主动脉弓缩窄模型心肌组织和扩心病患者心肌组织中的表达量与对照组有无差异。（3）构建SRSF3的siRNA并转染至大鼠心肌细胞,利用Western Blot检测敲减了SRSF3的大鼠心肌细胞中MAPK信号通路和TGF-β信号通路中相关蛋白的表达情况。（三）研究结果（1）Western Blot的结果显示,SRSF3在大鼠心肌细胞、人AC16心肌细胞、大鼠胚胎H9C2心肌细胞中的表达量明显高于人肺动脉平滑肌细胞、人主动脉平滑肌细胞、人冠状动脉内皮细胞。（2）与对照组相比,大鼠心肌细胞肥大模型中SRSF3的m RNA水平无统计学差异,蛋白水平明显降低。（3）与假手术组相比,行主动脉弓缩窄术的大鼠心肌组织中SRSF3蛋白水平明显降低。（4）SRSF3在扩张型心肌病患者心肌组织中的m RNA及蛋白水平显着低于非心衰供体。（5）SRSF3可增加心肌细胞MAPK信号通路中AKT蛋白的磷酸化水平。（6）SRSF3可增加心肌细胞TGF-β信号通路中Smad2的磷酸化水平。（四）研究结论（1）SRSF3在心肌细胞中有较高的表达水平。（2）与对照组相比,SRSF3在大鼠心肌细胞肥大模型、大鼠主动脉弓缩窄模型心肌组织和扩心病患者心肌组织中的表达量均下调。（3）SRSF3通过增加MAPK信号通路中AKT蛋白的磷酸化水平和TGF-β信号通路中Smad2的磷酸化水平来参与心衰的发生发展过程。
宋祥[2]（2020）在《基底刚度通过TRPV4/miR-6740/ET-1力学响应通路调控内皮细胞功能的研究》文中指出心血管疾病（Cardiovascular diseases,CVDs）是人类死亡的首要原因,严重危害人类的健康。心血管疾病是全身性、系统性疾病,发病机制复杂多样,但心血管疾病的发生和发展过程一般都伴随着血管硬化。血管硬化在力学性质上表现为血管刚度（stiffness）增加,即血管抵抗弹性形变的能力增加,具体表现为血管受到血流等压力后不容易发生形变,缺乏弹性,增加了血管堵塞和破裂的风险。临床研究证据显示,动脉血管刚度的异常增加会导致心血管疾病的发生和死亡率增加。这提示探究血管刚度改变在心血管疾病发生和发展中的作用及其机制,有望成为阐释心血管病发病机理、改善疾病预后的重要切入点。血管刚度增加的主要原因是构成血管的胶原蛋白增多和弹性蛋白降解,血管壁发生钙化,血管壁中膜的平滑肌细胞大量增殖并向内膜迁移。这一系列血管结构和成分的异常改变导致血管壁力学性能改变,尤其是血管内皮细胞（Endothelial Cells,ECs）的细胞外基质层（Extracellular Matrix,ECM）刚度逐渐增加。研究报道了正常生理状态下内皮细胞外基质层弹性模量约为2.5-8 kPa,心血管疾病状态下可异常增加至30kPa以上。血管内皮细胞是紧密排列于血管内侧的单层细胞,能够合成和分泌多种血管活性物质,维持血管稳态。内皮细胞主要通过产生一氧化氮（Nitric Oxide,NO）和内皮细胞源性内皮素1（Endothelin-1,ET-1）维持血管稳态,两者被认为是反映血管内皮细胞血管活性功能的代表性指标。NO主要由内皮细胞一氧化氮合酶（Endothelial Nitric Oxide Synthase,eNOS）催化产生,是最重要的舒血管因子。ET-1是内皮细胞产生的一种长效促进血管收缩的内源性多肽。ET-1表达上调能够抑制eNOS表达,减少NO生成,导致血管活性物质稳态失衡和内皮细胞功能障碍,后者是引发心血管疾病的关键因素。因此,细胞外基质层刚度的变化对内皮细胞生成血管活性因子,维持血管稳态功能的调控作用是研究血管刚度增加引起心血管疾病的切入点。目前有研究在体外利用培养基底模拟细胞外基质的力学环境,发现基底刚度的变化能够影响血管内皮细胞的铺展、粘附、增殖及迁移等行为。本实验室前期的研究也发现基底刚度改变可以使内皮细胞传统内参基因表达不稳定性增加。然而,刚度改变对内皮细胞维持血管稳态这一重要功能的影响尚不明确。我们推测刚度增加不利于内皮细胞维持血管稳态的功能,在心血管疾病的发生和发展过程中具有重要的作用。在本研究中,我们通过不同刚度（4,25和50 kPa）的聚丙烯酰胺水凝胶基底模拟病生理状态下内皮细胞的力学环境,培养原代脐静脉内皮细胞（Human Umbilical Vein Endothelial Cells,HUVECs）,发现基底刚度增加抑制内皮细胞eNOS的表达,促进ET-1的表达和分泌,提示血管刚度异常增加可诱导内皮细胞功能发生障碍,而力学传导的具体作用机制还需要进一步探究。近年来在心血管疾病发病机制的研究中,微小RNA（microRNA,miRNA）是最受关注的一类小分子,miRNA是非编码短链RNA,能够特异性结合靶基因mRNA链的3’端非翻译区（3’-end untranslated region,3’-UTR）,抑制靶基因表达。为了进一步探究刚度增加引起内皮功能障碍的作用机制,我们以miRNA作为切入点展开研究。我们选取4kPa和50 kPa基底培养的内皮细胞作为样本,利用miRNA芯片分析筛选到差异表达miRNA基因,发现相对于4 kPa基底,50 kPa基底培养的内皮细胞有22条上调miRNA基因,8条下调miRNA基因,其中,生物信息学预测分析发现ET-1可能是hsa-miR-6740-5p（miR-6740）调控的靶基因。通过qPCR验证刚度对miR-6740的调控、双荧光素酶报告基因实验以及向内皮细胞转染人工合成的miR-6740模拟物和抑制物检测ET-1的表达变化,我们发现ET-1是内皮细胞miR-6740作用的靶基因,基底刚度增加显着下调miR-6740,引起ET-1表达和分泌增加。内皮细胞如何感知刚度变化并调控miR-6740和下游ET-1的表达是探明刚度增加引起内皮功能障碍机制需要解决的关键问题。细胞表面的力学感受器是细胞将胞外力学信号转化为胞内生化信号的关键元件。香草素受体4型瞬时感受器电位通道（Transient receptor potential vanilloid 4,TRPV4）是一种广泛分布在各器官、组织的钙离子通道和力学感受器,内皮、心肌等细胞的TRPV4离子通道在剪切力作用下,能改变通透性促进钙离子(Calcium ion,Ca2+)内流,调控血管紧张与心肌兴奋性。此外,作为细胞第二信使,钙离子也可以通过一系列信号通路影响核内转录因子活性,参与多种基因的调控表达。基于此,我们通过qPCR和细胞免疫荧光对不同刚度基底上内皮细胞TRPV4的表达水平进行检测,利用TRPV4的特异性激活剂GSK1016790A（GSK101）和特异性抑制剂GSK2193847（GSK219）处理内皮细胞,通过钙离子成像和膜片钳实验测定刚度对内皮细胞TRPV4离子通道活性的影响。我们还探究了TRPV4的活性对下游miR-6740和ET-1表达的影响。研究发现:基底刚度增加可抑制内皮细胞TRPV4的表达及其离子通道活性,抑制细胞钙离子内流。抑制TRPV4离子通道活性miR-6740表达下调,ET-1表达上调。激活TRPV4可以促进内皮细胞miR-6740表达,抑制ET-1表达。此外,本研究还对miR-6740是否具有临床生物标志物的应用潜力进行了探究,首先需要明确内皮细胞是否能够胞外分泌miR-6740。由于miRNA是单链RNA小分子,在胞外极不稳定,通常以外泌体的形式存在。内皮细胞上清液外泌体经过抽提、鉴定和miRNA的qPCR检测后,我们发现内皮细胞可以通过外泌体将miR-6740分泌到胞外,且4kPa基底内皮细胞上清液外泌体miR-6740含量显着高于50kPa基底,这提示内皮细胞可以通过外泌体调控血液中miR-6740的水平。接着,我们收集了15例健康人和21例动脉硬化患者的血浆样本,对样本中的miR-6740进行qPCR检测及分析,发现健康人血浆miR-6740含量显着高于动脉粥样硬化患者,血浆miR-6740水平与动脉粥样硬化的发生相关。综合以上,本研究明确了基底刚度增加促进内皮细胞的黏附和骨架生成,促进内皮细胞生成管舒张因子NO,抑制血管收缩因子ET-1的表达和分泌,导致内皮细胞功能障碍。进一步机制研究发现基底刚度通过TRPV4/miR-6740/ET-1力学响应通路调控内皮细胞功能。研究首次发现TRPV4钙离子通道是一种内皮细胞刚度感受器,首次揭示了miR-6740抑制ET-1表达的生物学作用以及血浆中miR-6740与动脉粥样硬化发生的相关性。研究有望为阐明血管刚度增加引发心血管疾病的发病机理提供一定的研究基础,为心血管疾病的生物标志物提供研究参考,为新型血管生物材料的开发和力学特性优化提供理论参考。
马静[3]（2020）在《传统中药与介入治疗对动脉粥样硬化病变的作用及其机制研究》文中进行了进一步梳理研究背景动脉粥样硬化性心血管疾病（ASCVD）是当今威胁人类健康的主要疾病,随着我国老龄化的加快,心血管疾病负担日渐加重,已成为重大的公共卫生问题。西医治疗是目前ASCVD的主流疗法,然即便接受了优化药物治疗,ASCVD患者心血管事件的发生率仍较高。因此寻找新的抗ASCVD的药物势在必行。中医是中国传统文化的重要组成部分,是在古代哲学思想的指导下通过长期实践逐步形成和发展的独特医疗理论体系。近年来,中药防治心血管疾病取得了多方面进展。在基础研究领域,中医药运用活血、化痰、解毒、通络、益气等方法,在改善血管内皮功能、斑块稳定性、血小板活化、缺血再灌注、缺血预适应、左室重构、血管重构以及微循环功能等领域进行了广泛研究并取得了长足的进步。通心络是以中医络病学说为指导治疗ASCVD的经典中药复方制剂,广泛应用于慢性冠心病和脑卒中病的治疗。以往研究表明,通心络（TXL）可通过降脂、抗炎和抗氧化应激反应等多种机制发挥抗动脉粥样硬化（AS）的作用。TXL抗AS效果已被多项基础和临床研究所证实。由于TXL是由多种中草药成分组成的复方制剂,含有多种抗AS的活性成分,治疗机制仍未阐明,成为TXL研究中难以突破的关键科学问题。目前关于TXL作用机制的研究常针对西药抗AS治疗的已知靶点如降脂、抗炎和抗氧化应激,但这些机制无法完全解释TXL的抗AS作用。在本研究中,我们使用小鼠全基因组表达芯片检测了 TXL对apoE-/-小鼠基因表达的影响,探讨TXL抗AS作用的可能机制。研究目的1.明确TXL对apoE-/-小鼠AS斑块形成的影响。2.探讨TXL发挥抗AS作用的可能机制。研究方法1.TXL溶液制备体内实验,将TXL超微粉配制成不同浓度的生理盐水混悬液,小鼠每日0.1 ml混悬液灌胃给药,单纯高脂喂养（HFD）组给予相同体积的生理盐水。体外实验,用细胞培养基溶解TXL后,制备TXL储存液。2.实验分组100只雄性apoE-/-小鼠（12周龄）,适应性普食喂养1周后,随机分为以下5组:对照（Control）组,单纯普食喂养16周;单纯高脂（HFD）组,单纯高脂喂养16周,小鼠每日0.1ml生理盐水灌胃;TXL低剂量（TXL-L）组,高脂喂养的基础上,给予小鼠TXL（0.38g/kg/d）0.1ml每日灌胃,喂养16周;TXL中剂量（TXL-M）组,高脂喂养的基础上,给予小鼠TXL（0.758g/kg/d）0.1ml每日灌胃,喂养16周;TXL高剂量（TXL-H）组,高脂喂养的基础上,给予小鼠TXL（1.5g/kg/d）0.1ml每日灌胃,喂养16周。3.血液标本的留取及检测检测各组小鼠血脂和血糖水平。4.组织病理学检测小鼠主动脉组织行大体油红O（Oil redO）染色,评价主动脉斑块负荷。主动脉根部连续切片后,油红O染色检测斑块内脂质含量,免疫组织化学染色检测斑块内巨噬细胞（MOMA-2）浸润和平滑肌（α-SMA）水平,天狼猩红（Sirus red）染色检测斑块内胶原含量,计算斑块易损指数。使用免疫组织化学染色的方法检测小鼠主动脉根部斑块内炎症因子TNF-α、IL-6、MMP-2的含量。5.分子生物学检测:对Control组、HFD组及TXL-H组小鼠主动脉组织行基因芯片检测,观察TXL对高脂饮食诱发AS而引起的基因表达的影响。6.细胞培养体外培养小鼠原代巨噬细胞,给予不同处理后检测相应指标。培养基配制:高糖 DMEM 培养基 450ml+FBS 50ml。7.体外实验分组及干预在原代巨噬细胞培养板中,加入不同浓度的TXL溶液预处理24小时,换液后加入氧化低密度脂蛋白（ox-LDL）（40μg/ml）刺激4小时,4小时后吸弃细胞培养基,使用预冷的PBS溶液清洗3次,用于后续细胞RNA提取。8.统计分析使用SPSS 16.0（SPSS Inc,Chicago,USA）软件行统计分析。计量资料以均数±标准误表示,分类资料以百分比（%）表示。正态分布连续变量采用t检验或单因素ANOVA分析。当进行多重比较时,采用Bonferroni对p值进行校正。非正态分布连续变量采用非参数检验。p<0.05为具有统计学意义。研究结果1.TXL降低主动脉斑块负荷及主动脉根部斑块面积HE染色结果显示,TXL可逆转高脂饮食引起的斑块面积增加（与HFD组相比,p<0.05）,并呈现剂量依赖性,TXL-H组较TXL-L组斑块面积降低更为显着。大体油红O染色结果显示,与Control组相比,HFD组小鼠主动脉斑块负荷显着增加（p<0.05）,TXL可降低高脂饮食引起的斑块负荷的增加（与HFD组相比,p<0.05）,且TXL-H组降低斑块负荷的作用尤为明显,与TXL-L组相比,具有显着差异（p<0.05）。2.TXL增加斑块稳定性TXL可显着减少高脂饮食引起的主动脉根部脂质沉积和巨噬细胞浸润,增加斑块内胶原及平滑肌细胞的含量（p<0.05）,并呈剂量依赖性。TXL可显着降低斑块易损指数。3.TXL减少斑块内炎症因子的表达TXL能显着逆转高脂饮食引起的斑块内炎症因子表达的上调（p<0.05）,而TXL不同剂量组之间,炎症因子的表达无显着差异。4.TXL可逆转高脂饮食诱发AS而引起的基因表达的变化。在HFD组与Control组共筛选出3284个差异表达的基因,与Control组相比,2215个基因在HFD组表达上调,1069个基因在HFD组表达下调。即高脂饮食可引起小鼠主动脉组织3284个基因的差异表达。为了明确高脂饮食后在小鼠主动脉组织中差异表达的基因,有哪些可被通心络所调控,将高脂饮食后差异表达的3284个基因,与在HFD组和TXL-H组差异表达的632个基因进行匹配分析,筛选出TXL调控的AS相关基因。匹配分析结果显示,48个基因在HFD组被上调（与Control组相比）,而在TXL-H组表达水平降低（与HFD组相比）;56个基因在HFD组被下调（与Control组相比）,而在TXL-H组表达水平升高（与HFD组相比）。将差异表达的基因进行生物信息学分析后发现,这些基因主要分布在细胞内;按照生物学过程进行分类,这些差异表达的基因主要影响了细胞的代谢过程;按照分子功能进行分类,差异表达的基因主要影响了细胞的结合功能。通过KEGG富集分析发现,差异表达的基因主要富集在炎症和代谢相关通路。研究结论1.TXL可显着减缓小鼠主动脉斑块进展,抑制斑块内炎症因子的表达,增加斑块稳定性。2.TXL可通过多靶点发挥抗AS作用,除已证实的降脂、抑制炎症和氧化应激反应等机制外,TXL通过调节神经内分泌、调节免疫反应以及调节机体代谢发挥心血管保护作用。研究背景冠状动脉粥样硬化性心脏病（CHD）的发病率和死亡率在我国呈逐年增加的趋势,由于经皮冠状动脉介入治疗（PCI）创伤小,手术成功率高等优点,目前已成为冠心病的重要治疗方法。自1977年Gruentzig A首次实施经皮冠状动脉成形术以来,PCI已迅速成为急性冠脉综合征（ACS）患者的一线治疗手段,极大地改善了冠心病患者的预后。PCI治疗可使大多数缺血性心脏病患者获益,对于急性心肌梗死（AMI）患者,及早行PCI开通梗死相关血管,可以尽可能地挽救濒死心肌,降低患者急性期的死亡风险并改善长期预后。但对于稳定性缺血性心脏病（SIHD）患者,是否应行PCI治疗,目前仍存在争议。ISCHEMIA实验报道,对于中度或重度冠脉狭窄的SIHD患者,在优化药物治疗的基础上进行PCI术,与单纯接受优化药物治疗相比,长期随访过程中患者心血管事件的发生率及主要终点无显着差异。这一结果提示PCI未能改善SIHD患者的长期预后,即部分SIHD患者并未从PCI治疗中获益。在可能抵消SIHD患者PCI获益的因素中,PCI术后非靶病变（NTLs）的快速进展引起了更多的关注。PCI术后NTLs快速进展的机制目前尚不明确。炎症反应可能在PCI术后NTLs快速进展的过程中起到重要作用。研究表明,对于稳定性冠心病患者,血清CRP水平在PCI术后显着升高,且术后72小时CRP的高表达与患者术后心血管事件的发生显着相关。PCI术后激活的炎症反应和氧化应激,是否在NTLs进展中发挥重要作用?明确这一问题,对于优化PCI治疗、减少急性心血管事件发生及改善患者预后,具有非常重要的临床意义。综上所述,我们提出以下假说:PCI术后炎症反应和氧化应激的激活是促进NTLs进展的重要因素。为验证假说并探讨PCI术后NTLs进展的可能机制,本研究拟采用新西兰大白兔腹主动脉动脉粥样硬化（AS）模型,分为支架植入组、假手术组和对照组,支架植入组于腹主动脉AS形成处植入支架,3个月后分别采用血管内超声和病理学方法评估支架植入术后NTLs进展情况,明确支架植入术与NTLs进展的关系。同时检测PCI或冠状动脉造影（CAG）后患者血清中炎症相关因子的动态变化,并在体外模拟PCI环境,进一步探讨支架植入引起NTLs进展的潜在机制。研究目的1.观察支架植入术后NTLs的进展情况。2.探讨炎症反应在支架植入术后NTLs进展中的作用及其机制。研究方法第一部分1.动物AS模型构建采用成年雄性新西兰大白兔,通过球囊拉伤联合高脂饮食的方法构建兔腹主动脉AS模型:新西兰兔耳缘静脉麻醉后,行右侧髂动脉至腹主动脉球囊拉伤。2%利多卡因局部麻醉,分离皮下组织,暴露右侧股动脉并穿刺,沿导丝输送3.5mm×18mm预扩球囊至腹主动脉,以8-12 atm压力充盈球囊,自腹主动脉至股动脉反复牵拉3次,以造成腹主动脉内皮损伤,撤出球囊及导丝,结扎右侧股动脉,缝合手术切口。给予40万单位青霉素肌注以预防感染。2.实验分组10周时,将实验动物随机分为以下3组:（1）支架组（n=10）:行腹主动脉血管造影检查及支架植入术。分别在术中及术后三个月行腹主动脉血管内超声检查。（2）假手术组（n=10）:行腹主动脉血管造影检查,不植入支架。分别在术中及术后三个月行腹主动脉血管内超声检查。（3）对照组（n=10）:不进行有创操作。假手术组和支架组新西兰兔在10周时,分别进行腹主动脉造影和腹主动脉血管造影检查加支架植入术。支架组在支架植入术后给予拜阿司匹林40 mg/天,直至实验结束。3.血管内超声（IVUS）检查假手术组和支架组新西兰兔分别在介入术中及术后三个月行IVUS检查,使用Boston Scientific公司的iLab血管内超声成像系统,获得并自动记录连续性血管内超声图像。IVUS图像数据由两名独立的观察者进行分析,取两次计算数据的平均值。4.留取标本所有动物在22周时行安乐死,于左心室抽取枸橼酸钠抗凝血约15ml,置于黄色分离胶促凝管中,3000rpm室温离心10分钟,-80℃冰箱中保存备用。对于支架组和假手术组,将距离支架或血管最狭窄部位10mm以远的腹主动脉近心端,长度为50mm的血管段定义为NTLs,用于组织病理学分析,以评估斑块进展。对于对照组,我们将NTLs定义为距离髂总动脉分叉处20mm以远的腹主动脉近心端,长度为50mm的血管段,用于对照组的组织病理学研究。5.NTLs斑块评价将处理后的血管组织块进行连续切片,每张切片厚度为5μm,连续切片300μm（60张切片）后丢弃700μm,继续切片300μm后再次丢弃700μm,以此循环。收集所有切片后,每间隔100μm（10张切片）挑选一张切片进行病理学染色,用以评估NTLs的斑块形态及斑块负荷。6.NTLs斑块成分分析油红O（Oil red O）染色检测斑块内脂质含量,免疫组织化学染色检测斑块内巨噬细胞浸润（RAM-11）和平滑肌（α-SMA）水平,天狼猩红（Sirus red）染色检测斑块内胶原含量。斑块易损指数=（巨噬细胞+脂质沉积）/（胶原+平滑肌细胞）7.NTLs斑块内炎症因子检测使用免疫组织化学染色的方法检测实验动物NTLs斑块内炎症因子TNF-α、IL-6、MCP-1 和 VCAM-1 的含量。8.实验动物血清炎症因子检测使用相应的ELISA试剂盒,分别检测三组实验动物在术前、血管造影术后1天和术后3个月血清炎症因子的水平。所检测的血清炎症因子与斑块内炎症因子相对应,分别为 TNF-α、IL-6、MCP-1 和 VCAM-1。9.蛋白组学分析支架植入对血清蛋白表达的影响为探讨支架植入引起持续血管炎症和全身炎症反应的潜在机制,在血管造影术后3个月,分别采集了支架组和假手术组实验动物静脉血,对血清进行了蛋白质组学分析。10.统计分析使用SPSS 16.0（SPSS Inc,Chicago,USA）软件行统计分析。计量资料以均数±标准误表示,分类资料以百分比（%）表示。正态分布连续变量采用t检验或单因素ANOVA分析。当进行多重比较时,采用Bonferroni对p值进行校正。非正态分布连续变量采用非参数检验。p<0.05为具有统计学意义。第二部分1.研究对象本研究共纳入研究对象147例（平均年龄65±10岁）,于山东大学齐鲁医院确诊为不稳定性心绞痛,并行冠状动脉造影检查。采用山东大学齐鲁医院联众病历信息查询检索系统,收集患者住院期间完整病历资料,包括:一般情况、既往病史、冠心病家族史、实验室检查及用药史。所有受试者均知情并已签署临床观察性研究知情同意书。2.血液标本的采集所有患者分别于术前、术后1天、术后1个月三个时间点,在山东大学齐鲁医院病房于无菌条件下采集外周静脉血5ml,留取血清标本,冻存于负80℃冰箱中以备检测。3.血脂及炎症相关因子水平的检测使用齐鲁医院全自动生化分析仪检测术前及术后一个月患者血脂水平。分别检测患者血清中以下细胞因子的水平,包括白介素-1β（IL-1β）,IL-1RA,IL-5,IL-6,IL-8,IL-10,IL-12p70,IL-13,IL-15,肿瘤坏死因子-α（TNF-α）,干扰素-γ（IFN-γ）,巨噬细胞炎症蛋白-1α（MIP-1α）,巨噬细胞炎症蛋白-1β（MIP-1β）,单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）,干扰素诱导蛋白-10（IP-10）,碱性成纤维细胞生长因子（Basic-FGF）和血小板衍化生长因子（PDGF-BB）,C反应蛋白（CRP）,血清淀粉样蛋白A1（SAA1）。IL-1β,IL-1RA,IL-5,IL-6,IL-8,IL-10,IL-12p70,IL-13,IL-15,TNF-α,IFN-γ,MIP-1α,MIP-1β,MCP-1),IFN-γIP-10,Basic-FGF,PDGF-BB的水平使用伯乐人多因子检测试剂盒（Bio-Rad,CA,USA,Cat No:M500KCAFoY）按照试剂盒说明书中的步骤操作。CRP,SAA1的水平,使用相应的ELISA试剂盒,按照试剂盒说明书中的步骤操作。4.细胞培养体外培养HUVEC及THP-1细胞,给予不同处理后检测相应指标。HUVEC培养基配制:基础内皮细胞培养基470m1+FBS 25ml+内皮细胞生长因子5ml;THP-1细胞培养基配制:RPIM 1640培养基450ml+FBS 50ml;5.细胞分组（1）CAG组:冠脉造影术后患者血清刺激内皮细胞;（2）PCI组:PCI术后患者血清刺激内皮细胞;6.单核细胞黏附实验为了验证斑块局部的炎症反应是否由循环中炎症风暴所引起,我们使用PCI或CAG术后1天患者的血清孵育HUVECs,在孵育24小时后,检测其对单核细胞黏附能力的影响。7.蛋白质印迹法（Western Blot）收集不同干预的内皮细胞并提取总蛋白,采用Western Blot方法检测各组中TNF-α、IL-6、ICAM-1、VCAM-1等指标在蛋白水平的变化。采用Photoshop软件分析条带的平均密度值和面积。8.统计分析使用SPSS 16.0（SPSS Inc,Chicago,USA）软件行统计分析。计量资料以均数±标准误表示,分类资料以百分比（%）表示。正态分布连续变量采用t检验或单因素ANOVA分析。当进行多重比较时,采用Bonferroni对p值进行校正。非正态分布连续变量采用非参数检验。p<0.05为具有统计学意义。研究结果1.支架植入促进NTLs斑块进展假手术组实验动物腹主动脉NTLs的斑块体积自96.03 mm3增长到140.44 mm3（增长比例46.25%）;斑块负荷自18.53%增长到26.47%（增长比例42.85%）。支架组实验动物腹主动脉NTLs的斑块体积自105.52 mm3增长到182.96 mm3（增长比例73.39%）,斑块负荷从19.04%增长到35.14%（增长比例84.56%）。术后3个月,支架组NTLs的斑块体积显着高于假手术组（182.96±9.91mm3 vs140.44±8.98mm3,p<0.05）,前者NTLs的斑块体积较后者增加30.28%。同时在术后3个月,支架组NTLs的斑块负荷显着高于假手术组（35.14±2.23%vs26.46±1.07%,p<0.05）前者NTLs的斑块负荷相对后者增加32.75%。因此,与假手术组相比,支架组NTLs斑块增加更为显着。病理学染色显示,与假手术组相比支架组的平均斑块面积和平均斑块负荷分别相对增加55.9%和27.3%。这一病理学结果提示支架植入与NTLs的快速进展有关,这与血管内超声的结果相吻合。2.支架植入增加NTLs斑块易损性术后3个月,与假手术组和对照组相比,支架组实验动物NTLs脂质沉积增多,巨噬细胞浸润增加,平滑肌含量减少,胶原含量减少,差异具有统计学意义。假手术组与对照组NTLs斑块内脂质沉积、巨噬细胞浸润、平滑肌水平及胶原含量均无显着差异,通过计算斑块易损指数,我们发现支架植入后显着增加NTLs斑块的易损性,增加斑块不稳定。3.支架植入促进实验动物NTLs斑块局部炎症反应免疫组织化学染色显示,术后3个月支架组NTLs斑块内炎症因子TNF-α、IL-6、MCP-1和VCAM-1的水平显着高于假手术组与对照组,差异具有统计学意义。假手术组与对照组NTLs内炎症因子的表达无显着差异。这些结果提示支架植入促进了 NTLs斑块内的炎症反应。4.支架植入引起实验动物持续全身炎症反应支架组实验动物血清TNF-α、IL-6、MCP-1和VCAM-1水平从术前至术后1天和术后3个月呈逐步增加趋势,在假手术组和对照组,血清中炎症因子的水平从术前到术后1天和术后3个月无显着变化;因此,在血管造影术后3个月,支架组血清TNF-α、IL-6、MCP-1和VCAM-1水平显着高于假手术组和对照组。这一结果提示支架植入术后,实验动物机体内处于持续高炎症反应状态。5.蛋白组学分析支架植入对血清蛋白水平的影响在血管造影术后3个月,我们分别采集了支架组和假手术组新西兰兔静脉血,进行蛋白质组学分析。与假手术组相比,支架组血清中多个急性时相反应蛋白（APPs）水平显着上调,包括血清淀粉样蛋白1（SAA1）SAA4,SAA,C-反应蛋白（CRP）,脂多糖结合蛋白（LBP）,α1-酸性糖蛋白（AAG）。这一结果提示,支架植入术后,机体处于持续的急性时相反应状态。6.差异表达蛋白生信分析我们将两组间所差异表达的蛋白进行生信分析发现,这些蛋白主要分布在胞外区域,即多为分泌蛋白,据此我们推测支架植入主要影响了细胞的分泌功能;通过KEGG富集分析发现,差异表达的蛋白多富集在免疫和炎症相关通路,包括补体-凝血级联反应,金黄色葡萄球菌感染,NF-κb,PPAR和Jak-STAT等信号通路。7.病人一般情况两组患者的一般情况、既往病史、冠心病家族史、实验室检查等基线资料无统计学差异。术前CAG组与PCI组患者血脂水平无显着差异。CAG组患者在冠脉造影术前与术后一个月,血清TC、TG、LDL-C、HDL-C水平无明显变化。然而,在PCI组患者血清中,TC和LDL-C的水平在PCI术后1个月相较于术前显着下降。8.PCI患者术后CRP及SAA1水平增加PCI组患者血清中CRP和SAA1水平在PCI术后1天显着升高,并持续至术后1个月。CAG组患者血清中CRP和SAA1水平在冠脉造影术后1天升高,幅度小于PCI组,且在术后1个月恢复到基线水平。9.PCI患者术后CRP高风险患者比例增加术前CAG组和PCI组CRP高水平患者所占的比例分别为18.87%和18.09%,术后1天,两组中这一比例均有所增加,分别为20.76%和41.49%,PCI组增加比例显着高于CAG组。在术后1个月,CAG组CRP高水平患者显着下降,降至基线水平以下;而PCI组CRP高水平患者的比例仍显着高于基线水平,并高于同时期CAG组。10.PCI患者术后炎症相关因子水平升高PCI组患者血清中炎症相关因子在PCI术后1天及1个月显着上升,尤其是IL-6,IL-8,IL-10,IL-13,TNF-α和IP-10,这些炎症相关因子的升高持续至术后1个月,未出现下降趋势。CAG组患者血清中17个炎症相关因子,从术前到术后1天和术后3个月无显着变化。11.PCI术后患者血清促进对内皮-单核细胞间黏附PCI术后血清孵育能显着促进内皮细胞与单核细胞之间的黏附,同时增加内皮细胞表面黏附分子ICAM-1和VCAM-1及炎症因子TNF-α、IL-6的蛋白表达。12.PCI术急性时相反应被激活我们使用PCI或CAG术后1天患者的血清孵育HUVECs,在孵育24小时后,检测急性时相反应蛋白CRP和SAA1蛋白表达及STAT3和NF-κB信号通路的激活情况。结果显示,与CAG患者血清组相比,PCI组血清孵育可以增加内皮细胞CRP和SAA1蛋白表达,同时激活STAT3和NF-κB信号通路。13.抑制STAT3或NF-κB信号通路对APPs及炎症因子表达的影响STAT3和NF-κB是启动急性时相反应的关键信号通路,使用STAT3通路抑制剂WP1066和NF-κB通路的抑制剂BAY11-7082预处理HUVECs 3小时,然后使用PCI或CAG术后1天患者的血清孵育HUVECs,在孵育24小时后,检测急性时相反应蛋白CRP和SAA1及炎症因子TNF-α、IL-6的表达,结果显示抑制STAT3或NF-κB信号通路后,可显着降低PCI组血清孵育所引起的急性时相反应蛋白CRP和SAA1以及炎症因子TNF-α和IL-6的表达。研究结论1.支架植入术可引起机体炎症反应的激活,加速兔腹主动脉NTLs斑块进展。2.支架植入术后,新西兰兔血清中CRP、SAA1等急性时相反应蛋白表达增加并持续长达数月。3.PCI术后患者体内存在持续炎症反应,多种炎症因子在PCI术后1天水平上调并持续至术后1个月。4.PCI术后NF-κB及STAT3信号通路的激活,在急性时相反应介导的NTLs快速进展过程中起到了重要作用。
王维铁[4]（2020）在《长链非编码RNA01278竞争性抑制miR-500b-5p调控ACTG2促进平滑肌细胞增殖在主动脉夹层形成中的作用机制研究》文中认为背景:主动脉夹层（aortic dissection,AD）是心血管疾病中较为凶险的一种疾病,其发病急进展快,一经发现需要立即给予医疗处理,否则会出现致命性风险。AD的主要发病原因是血液由血管的内膜破口进入血管中层,在血压的驱动下在血管夹层中向前流动从而撕裂血管。临床常见的症状为突发的前胸及后背部剧烈的疼痛。主动脉夹层常见的发病因素包括遗传性因素如马凡综合症,Ehlers-Danlos综合症,和非遗传性因素如主动脉中层囊性坏死、高血压、动脉粥样硬化、梅毒性大动脉炎、创伤性动脉瘤等,其中高血压被认为是最主要的诱发因素。目前关于主动脉夹层的具体发病机制尚无明确定论,主要认为和血管中层平滑肌细胞增殖和凋亡失衡有关。已有研究表明,主动脉夹层组织中血管平滑肌的增殖程度明显高于正常人的升主动脉组织,并通过一系列体内和体外实验验证编码平滑肌细胞收缩的标志蛋白增高/减低对主动脉血管平滑肌细胞增殖的影响。当前这一灾难性疾病尚缺乏早期有效的诊断措施,特别是血清学诊断标志物,目前尚无集特异性和敏感性一体的AD血清诊疗标志物。大部分AD患者仍是通过发病后行主动脉血管造影来明确诊断。但因临床以胸背部疼痛为首发症状的疾病较多,其中心肌梗死是首要怀疑对象。患者多是经过冠脉造影检查无明显异常后才会怀疑AD,进而行主动脉造影检查。其中部分患者在频繁的转运及检查过程中出现夹层破裂死亡。因此更加快速、有效、简便的诊疗方法亟待解决目前AD的诊疗现状。长链非编码RNA（lncRNA）是一类线性非编码RNA。现有研究表明lncRNA能够与微小RNA结合进而影响编码基因的表达,从而影响疾病的发展。在心血管疾病中,目前已经有许多报道lncRNA和心衰、缺血性心脏病、心脏瓣膜病发病过程相关,但是在AD的发病过程中的研究较少,尤其是lncRNA对AD血管中层平滑肌细胞收缩过程的影响尚无具体的机制研究报道。目的:本研究通过高通量芯片二代测序技术检测了AD患者升主动脉内膜破口组织和对照组非夹层患者升主动脉组织中lncRNA,miRNA和mRNA基因表达谱,通过现代高通量生物信息学分析二代测序结果,找到差异表达的lncRNA,miRNA和mRNA,并对差异表达的基因进行基因本体分析和信号通路分析。试图筛选出在AD发病过程中血管中层平滑肌细胞收缩的关键lncRNA-miRNA-mRNA信号通路。并通过细胞学实验验证,最终提出AD发病的关键机制以及未来早期诊断所需的血清学标志物和潜在药物治疗靶点。方法:1.升主动脉组织标本的搜集。将确诊的非遗传性主动脉夹层患者手术切除的位于破口周围的升主动脉组织（实验组）和冠状动脉旁路移植术患者手术中经打孔器取下的升主动脉组织（对照组）进行清洗,保存于-80℃液氮中。2.AD疾病中lncRNA,miRNA和mRNA基因表达谱检测。随机选取6例AD患者破口周围升主动脉组织和6例缺血性心脏病患者升主动脉组织,进行高通量二代芯片测序,按照p<0.05,差异表达倍数≥2的选择标准初步筛选出有意义的差异表达lncRNA,miRNA和mRNA。同时随机选取10例AD升主动脉组织和10例缺血性心脏病患者升主动脉组织进行实时定量PCR验证基因芯片的准确性。3.AD升主动脉组织中差异表达lncRNA,miRNA和mRNA的生物信息学分析。将AD组织中差异表达的mRNA和GEO数据库中主动脉夹层mRNA基因测序结果GSE52093进行融合后,通过基因本体分析,KEGG信号通路分析,筛选出目标mRNA,利用targetscan及DIANA tools进行lncRNA和miRNA预测,利用的韦恩分析确立最终lncRNA,miRNA,并讨论目标lncRNA,miRNA和mRNA与血管平滑肌增殖以及迁移能力关系,最终确立lncRNA-miRNA-mRNA发病通路4.linc01278在AD升主动脉平滑肌细胞增殖及迁移过程的作用机制研究。原位杂交实验检测linc01278在血管平滑肌细胞中的具体细胞定位。质粒过表达linc01278和RNA干扰linc01278后,检测:1)linc01278、miR-500b-5p、ACTG2表达量变化;2)增殖型血管平滑肌细胞诱导后,检测平滑肌收缩标记基因SMA,SM22α,MYH11,calponin的表达量;3)CCK-8实验检测转染后血管平滑肌细胞增殖状态。4)检测MMP2和MMP9以及划痕实验验证转染后血管平滑肌细胞迁移状态。5.双荧光素酶报告基因实验。通过targetscan及DIANA tools数据库对linc01278与miR-500b-5p结合位点以及miR-500b-5p和ACTG2结合位点的预测,通过双荧光素酶实验进一步验证miR-500b-5p与linc01278和ACTG2的结合位点。结果:1.成功获取人主动脉夹层升主动脉组织及缺血性心脏病患者升主动脉组织,并进行RNA提取,浓度、纯度的检测,符合进一步实验标准。2.高通量二代芯片测序检测出主动脉夹层破口周围升主动脉组织中差异表达lncRNA及mRNA。lncRNA基因表达芯片显示共有2084个差异表达的lncRNA,其中有730个差异上调表达的基因,1354个差异下调表达的基因;mRNA基因表达芯片显示共有2834个差异表达的mRNA,其中有1928个差异上调表达的基因,906个差异下调表达的基因。随机选取5个上调及5个下调差异表达lncRNA和5个上调及5个下调差异表达mRNA通过qRT-PCR在10例主动脉夹层组织和10例缺血性心脏病升主动脉组织中的表达量,qRT-PCR表达结果和基因芯片表达结果趋势相同,证明芯片结果准确可靠。3.构建了ceRNA调控网络,将mRNA芯片与GEO数据库的人主动脉夹层基因芯片GSE52093进行交叉融合分析。所得到的144个共同差异上调表达的基因和96个共同差异下调表达的基因。对全部差异表达基因进行信号通路分析,下调的差异基因富集在血管平滑肌收缩通路,上调的差异基因富集在细胞周期通路。对下调的全部差异基因进行蛋白质互作网络分析和cytohubba生物信息学计算出ACTG2,BDNF,DMD,CNN1,MYOCD为主动脉夹层发病的核心基因。将上述核心发病基因通过targetscan生物信息软件预测出与之有结合位点的miRNA,将预测的214个miRNA和我们的miRNA基因芯片进行韦恩分析,得到13个共同表达的miRNA。利用DIANA tools对13个miRNA进行预测与之有结合位点的lncRNA,将所预测的lncRNA和我们的lncRNA基因芯片进行融合分析,最终得到6个共同差异表达的lncRNA。从而构建出ceRNA调控网络。根据现代高通量生物信息学计算方法,我们最终预测出linc01278（下调表达）—miR-500b-5p—ACTG2（下调表达）调控通路在主动脉夹层患者升主动脉平滑肌增殖和迁移过程中发挥重要调控作用。4.linc01278调控主动脉夹层升主动脉平滑肌细胞表型转化功能的验证。利用RNA干扰技术敲低血管平滑肌细胞中的linc01278发现,随着linc01278表达量降低后,miR-500b-5p的表达反而增高,使得其对下游调控的靶mRNA ACTG2的抑制增加从而使其表达量下降,而ACTG2是血管平滑肌收缩通路中的重要因子,通过对血管平滑肌细胞增殖及表型转化基因标志物的检测,最终结果示:SMA,SM22α,MYH11,calponin同时呈现下降趋势,说明血管平滑肌增殖能力增强。上述现象可以通过miR-500b-5p inhibitor补救实现逆转,使得血管平滑肌增殖能力减弱。而通过质粒在linc01278过表达细胞实验中,出现和RNA干扰相反的结果,当linc01278表达量增加以后,血管平滑肌增殖能力减弱。上述现象可以通过miR-500b-5p mimics补救实现逆转。5.双荧光素酶报告实验验证linc01278,miR-500b-5p和ACTG2的可结合性。分别构建pGL6-miR-linc01278（WT）,pGL6-miR-ACTG2-3’UTR（WT）和miR-500b-5p mimics后,通过转染293T细胞并进行荧光量检测发现野生型的发光信号明显降低,说明结合位点结合抑制发光从而证明miR-500b-5p与linc01278和ACTG2之间的可结合性。结论:1.主动面夹层基因芯片结果显示主动脉夹层患者升主动脉组织中较非主动脉夹层升主动脉组织中有2084个差异表达的lncRNA和2834个差异表达的mRNA。2.通过对lncRNA,miRNA和mRNA基因表达谱中差异基因的高通量生物信息学分析发现,linc01278可能通过竞争性结合miR-500b-5p从而调控ACTG2的表达,进而影响血管平滑肌收缩通路造成血管平滑肌细胞异常增殖和表型转化。3.敲低linc01278后血管平滑肌细胞增殖和迁移能力增强;过表达linc01278后血管平滑肌细胞增殖和迁移能力减弱。4.双荧光素酶报告实验证实miR-500b-5p与linc01278和ACTG2之间的可结合性。综上,主动脉夹层升主动脉平滑肌组织中低表达linc01278通过减少对miR-500b-5p的竞争性吸附,从而抑制了ACTG2的表达,进而促进血管平滑肌细胞收缩,使得血管平滑肌细胞增殖能力和迁移能力增强。上述研究结果为非编码RNA在主动脉夹层发病机制中作用机制及分子通路提供新的理论基础。同时为未来早期诊断所需的血清学标志物以及潜在药物治疗靶点提供研究方向。
马旭莹[5]（2020）在《川崎病患儿血清中外泌体的提取及外泌体源性miRNAs差异性表达研究》文中认为目的:通过超速离心法分离出急性期川崎病患儿血清中的外泌体,进一步通过微阵列芯片技术筛选得到川崎病（Kawasaki disease,KD）急性期患儿血清中有差异表达的外泌体源性微小RNA（microRNA,miRNA）,分析得到与血管炎症相关的miRNAs,以探究川崎病的可能发病机制方法:1.选取12例于2019年03月至08月在苏州大学附属儿童医院就诊,并明确诊断为川崎病急性期的患儿为研究对象,且这些患儿都是在大剂量丙球及阿司匹林使用前,将他们随机分成3组,并选取了同期健康体检儿童12例,均留取清晨空腹血,通过超速离心法分离血清中外泌体,并通过透镜观察分离得到的外泌体形态,进一步从外泌体中获得miRNAs,采用芯片杂交技术筛选出川崎病急性期组与正常对照组中差异表达的外泌体源性miRNAs。2.再次选取同期就诊KD急性期6例患儿及健康儿童6例作为研究对象,利用实时定量 PCR（real-time quantitative PCR,RTqPCR）技术验证芯片结果。利用 TargetScan、miRDB、miRWalk三个数据库对差异表达的外泌体源性miRNAs进行靶基因预测,使用生物信息学分析软件对共同的靶基因进行分析,寻找与KD炎症性血管损伤相关的可能靶基因。结果:1.超速离心法所得的粒子在透射电镜下检测显示,粒子直径为100nm,且形态完整、球形、大小均一,证实分离所得粒子即为外泌体（exosomes）。2.KD患儿急性期外泌体源性miRNAs中,芯片筛选出了 33个有差异性表达miRNAs,其中有9个已被命名的miRNAs,6个表现为下调水平（hsa-miR-125a-5p、hsa-miR-130b-5p、hsa-miR-146a-5p、hsa-miR-150-5p、hsa-miR-151a-5p、hsa-miR-370-3p）,3 个表现为上调水平（hsa-miR-122-5p、hsa-miR-21-5p、hsa-miR-4484）（p 值<0.05,fc 值>1.5）。RTqPCR 结果显示hsa-miR-122a-5p、hsa-miR-21-5p 相对表达量显着性上调,hsa-miR-125a-5p、hsa-miR-150-5P显着下调,与芯片结果一致。3.将 hsa-miR-122a-5p、hsa-miR-21-5p、hsa-miR-125a-5p、has-miR-150-5p 利用生物分析软件得到各自的共同靶基因,对靶基因进一步分析及查阅相关文献,分别定位下游的与血管炎相关的可能靶基因,分别是:DDAH1/OLR1、TFDP2/PEG10/CBL、TNFAIP3/SMURF1、PRKCA。结论:1.利用超速离心法能够有效分离提取血清中外泌体。2.芯片技术与RTqPCR技术结合运用,发现KD患儿急性期血清中的外泌体源性的miRNAs是有差异性表达。川崎病血清中的外泌体可能是通过其携带的miRNAs参与了川崎病血管炎的发生发展。
张湘卓[6]（2020）在《基于DNA羟甲基化修饰调控mRNA表达探讨早发冠心病血瘀证相关易感基因》文中研究表明目的:根据早发冠心病（premature coronary heart disease,PCHD）血瘀证患者外周血DNA羟甲基化（DNA hydroxymethylation）状态和全基因组芯片m RNA表达,筛选两者的差异基因并取交集,探索早发冠心病血瘀证易感基因及疾病发生发展的作用机制。方法:（1）根据早发冠心病诊断标准和中医辨证标准从422例样本中筛选出早发冠心病血瘀证患者20例、早发冠心病非血瘀证患者20例、非早发冠心病血瘀证患者20例、健康人20例;从上述样本中每组选6例,每例取外周血3 m L,根据DNA羟甲基化免疫共沉淀芯片（h Me DIP-Chip）检测DNA羟甲基化状态,通过组间比较分析筛选出调控早发冠心病血瘀证的差异基因;（2）选取早发冠心病血瘀证组和健康对照组各6例,每例取外周血2 m L,根据全基因表达谱芯片检测基因组m RNA的表达,综合DNA羟甲基化和m RNA的表达水平取交集筛选出与早发冠心病血瘀证相关的差异基因,并进行GO功能和KEGG分析。结果:（1）hMe DIP-chip芯片结果显示:各组间比较差异羟甲基化基因共计4980个,主要分布在高Cp G密度启动子区,对比早发冠心病血瘀证组与健康对照组结果显示DNA羟甲基化修饰表达上调的基因224个、下调649个。（2）全基因表达谱芯片结果显示:与早发冠心病血瘀证相关的差异表达基因有405个,其中m RNA表达上调112个,下调293个。综合DNA羟甲基化和m RNA的表达水平取交集,两者存在共同差异基因11个,其中上调4个,下调7个。（3）经GO功能和KEGG分析,与这些差异基因相关的信号通路有20余条,如核苷酸剪切修复（Nucleotide excision repair）、内吞作用（Endocytosis）等。（4）早发冠心病血瘀证组富含亮氨酸重复序列免疫球蛋白样蛋白1（LRIG1）、β-2A微管蛋白基因（TUBB2A）DNA羟甲基化和m RNA表达程度均降低（P<0.05或P<0.01）。结论:（1）DNA羟甲基化差异基因表达下调的有694个、m RNA表达下调的有293个,两者存在相同的差异基因11个,其中7个低表达,说明这些共同差异基因的低表达可能是导致早发冠心病血瘀证发生发展的机制之一。（2）通过GO功能和KEGG分析,11个共同差异基因相关的相关通路有20余条,主要与血管内皮损伤、炎症、斑块及脂质代谢等有关,提示以上通路与早发冠心病血瘀证发生发展的机制相关联。（3）早发冠心病血瘀证组TUBB2A、LRIG1基因DNA羟甲基化和m RNA表达程度均降低（P<0.05或P<0.01）,且与EGFR互作用,可能是由于TUBB2A、LRIG1被抑制或突变导致低表达,从而减弱了对EGFR的负向调节使其高表达,干扰了表皮生长因子信号正常传递,影响心肌和血管平滑肌细胞重构的信号转导,导致早发冠心病血瘀证的发生发展,故LRIG1、TUBB2A基因DNA羟甲基化调控其m RNA低表达可能是早发冠心病血瘀证发生发展的危险因素之一。
卓扬[7]（2020）在《冠心病相关LncRNA关键基因的筛选及验证》文中指出第一章RP1-276N6.2、TARID基因遗传变异与中国汉族人群冠心病的关联研究目的:研究RP1-276N6.2基因区域的遗传变异rs611950、rs10499313、rs505000位点以及TARID基因区域的遗传变异rs1966248、rs2327429、rs2327433、rs12190287、rs6569912位点与冠心病发病风险的关系,并探索RP1-276N6.2和TARID基因表达水平与冠心病的潜在关联。方法:本研究采用病例对照研究的方法,严格按照纳入排除标准在医院收集冠心病患者及对照人群的血样、临床检测信息和流行病学资料。本研究共在中国重庆汉族人群中纳入949例冠心病病例和892例对照。采用Taq Man Assay基因分型法对位于RP1-276N6.2基因上的单核苷酸多态性rs611950、rs10499313、rs505000位点和位于TARID基因上的rs1966248、rs2327429、rs2327433、rs12190287、rs6569912位点进行基因分型。采用Haploview软件分析各SNPs之间的连锁关系,采用SHEsis软件进行各SNPs组合的单倍型分析及频率估计,采用SPSS22.0软件完成统计分析。采用GTEx数据库完成e QTL分析,采用R 3.6.0完成基因表达水平的相关分析与作图。结果:1.病例对照基本情况分析结果显示:冠心病病例组具有较高的吸烟率、空腹血糖和收缩压,而舒张压、总胆固醇、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白、饮酒史率、高血压病史率和糖尿病病史率较低,以上差异均具有统计学意义（P<0.05）。2.SNPs与冠心病发病风险的关联分析结果显示:按照年龄分层分析显示,在早发CAD组,rs611950位点的基因型和等位基因在病例组和对照组中的频率分布差异均具有统计学意义（P<0.05）,rs611950的T等位基因较C等位基因能明显增加早发CAD发病风险（OR=1.32,95%CI:1.05-1.66,P=0.02）,rs10499313位点的AG基因型较AA基因型明显增加早发CAD的发病风险（OR=2.11,95%CI:1.31-3.39,P<0.01）,rs505000位点的GG基因型和G等位基因在病例组中的分布频率明显低于对照组,差异具有统计学意义（P<0.05）,且rs505000的G等位基因较C等位基因明显降低早发CAD发病风险（OR=0.74,95%CI:0.59-0.93,P=0.01）,rs1966248的AA基因型在病例组中的分布频率高于对照组,差异具有统计学意义（P<0.05）;在迟发CAD组,rs505000位点CG基因型较CC基因型能明显增加迟发CAD发病风险（OR=1.39,95%CI:1.03-1.89,P=0.03）。按照性别分层分析发现,在男性CAD组中,rs2327433位点的基因型和等位基因在病例组与对照组中的频率分布差异具有统计学意义（P<0.05）,且G等位基因较A等位基因能明显增加男性CAD的发病风险（OR=1.38,95%CI:1.07-1.78,P=0.01）;在女性CAD组中,rs10499313位点的AG基因型在病例组中的分布频率明显高于对照组,差异具有统计学意义（P<0.05）。在心肌梗死组中的分析结果显示,rs505000的G等位基因较C等位基因能明显降低MI的发病风险（OR=0.78,95%CI:0.63-0.98,P=0.04）,rs2327429位点的CC基因型较TT基因型能明显降低MI的发病风险（OR=0.55,95%CI:0.31-0.97,P=0.04）。3.e QTL分析结果显示:RP1-276N6.2基因上的rs611950位点的基因型在骨骼肌、食管粘膜等组织中与RP1-276N6.2基因表达水平显着相关,还与临近的CAD易感基因SLC22A3的表达水平显着相关（P<1×10-5）;TARID基因上的rs2327429、rs6569912和rs12190287位点的基因型在冠状动脉组织中与TARID和下游临近的CAD保护基因TCF21基因表达水平显着相关（P<1×10-5）。4.基因表达水平相关分析:在血管组织中的分析结果显示,TARID基因与TCF21基因的表达水平线性相关（R=0.62,P=6.28×10-67）,再分别在颈动脉、冠状动脉和胫动脉组织中的分析结果显示,TARID与TCF21表达水平仍然显着相关,且在冠状动脉组织中的相关系数值最大（R=0.50,P=7.52×10-9）;且TARID基因在动脉粥样斑块中的表达水平明显低于正常组织,差异具有统计学意义（P=5.52×10-4）。结论:1.分层分析发现,rs611950、rs10499313、rs505000、rs1966248与早发CAD发病风险有关,rs505000的CG基因型能显着增加迟发CAD的发病风险;rs2327433、rs10499313分别与男性CAD、女性CAD发病风险有关;本研究还发现,rs505000的等位基因与MI有关,rs2327429的CC基因型能显着降低MI的发病风险。2.e QTL分析结果显示,RP1-276N6.2上的rs611950位点基因型、TARID上的rs2327429、rs6569912、rs12190287位点基因型在不同组织中既与宿主基因表达水平相关又与邻近冠心病易感基因表达水平显着相关。3.在冠状动脉组织中,TARID与TCF21表达水平显着相关,且TARID在动脉粥样斑块中的表达水平显着下调。第二章通过加权基因共表达网络分析（WGCNA）构建冠心病发生进程相关的关键Lnc RNA网络目的:采用加权基因共表达网络分析（WGCNA）为主的生物信息学分析工具,筛选可能与冠心病发生发展相关的关键lnc RNA基因,并分析其潜在的生物学功能,为冠心病的筛查和诊疗提供科学依据。方法:利用WGCNA算法对141例CAD病例与对照人群外周血单核细胞基因表达谱进行分析,将差异基因划分在不同模块,并结合疾病分组信息,选取与CAD高度相关的基因模块进行网络构建。通过GO功能注释和KEGG通路富集分析基因模块的分子功能以及参与的信号通路。在基因模块内构建ce RNA调控网络,根据基因显着性（GS）和模块身份（MM）筛选基因网络中的枢纽lnc RNA基因,绘制受试者工作特征曲线来判断候选lnc RNA的生物标志物特性。结果:对48例正常样本和93例冠心病样本的基因表达数据进行差异分析,绘制火山图和热图展示基因差异分析结果,选取5000个差异基因（包括前2500个lnc RNA和前2500个m RNA）的表达矩阵和疾病分组信息进行WGCNA分析,结果显示turquoise模块与冠心病有关,且相关系数最大（R=0.75,P=7.00×10-27）。通过GO分析发现turquoise模块内基因主要参与转录调控和免疫调控等生物过程,KEGG分析显示基因主要参与炎性反应和免疫反应相关信号通路。对turquoise模块构建ce RNA调控网络,利用Cytoscape对网络进行可视化处理,构建出lnc RNA-mi RNA-m RNA的网络图形,结合GS与MM相关分析,共发现10个lnc RNA既可能参与ce RNA网络调控也是turquoise模块内的枢纽基因,同时ROC分析结果显示这10个lnc RNAs可能具有冠心病诊断标志物的潜力（AUC>0.9,P<0.05）。结论:通过WGCNA分析,共筛选到10个关键lnc RNAs基因,包括DGCR5、LINC00161、LINC00222、LINC00315、LINC00461、LINC00504、PWRN1、DSCR10、LINC00092和TTTY14,这些lnc RNAs很可能通过ce RNA网络调控冠心病发生发展过程,且具有较好的冠心病诊断标志物潜力。
黄茂勋[8]（2020）在《Circ0022920通过竞争性结合miR-650调控TGFβR1表达在主动脉夹层发病机制中的作用研究》文中研究指明【背景】主动脉夹层（Aortic dissection,AD）是一种致命的大血管疾病,死亡率极高。AD的治疗主要包括外科手术,药物治疗和血管腔内修复治疗,尽管这些治疗目前已经取得了很大的进步,但是,AD仍然是严重威胁生命的疾病,临床确诊后需要尽快进行干预。目前AD的治疗仍然是外科医生的一个难题。为了建立更好的治疗方法,从分子层面阐明AD的调节机制至关重要。血管平滑肌细胞（Vascular Smooth Muscle Cell,VSMC）以合成或收缩表型存在。它们从胚胎组织中的增生和合成表型转变为成年血管中的静态和收缩表型。在健康的血管中,大多数VSMC呈现收缩表型,但是,由于病理损伤,收缩的VSMC可以转换回合成表型。VSMC的异常表型转换被认为是AD的标志性病理改变。环状RNA（circular RNA,circRNA）通过3’和5’端之间的共价键形成闭环,自2012年以来,circRNA成为学者们的研究热点,越来越多的证据证明circRNA广泛参与疾病的发病机理和进展。与长链非编码RNA（Long non-coding RNA,lncRNA）相似,circRNA通过充当miRNA海绵,竞争内源RNA（competing endogenous RNA,ceRNA）发挥其作用。既往有报道称,在AD患者中circRNA表达失调,circRNA101238作为海绵增强了MMP9表达,抑制了miR-320a的表达,这可能与主动脉夹层的发病有关。然而,该研究仍未阐明circRNA在主动脉夹层中的发病机制和进展中的特异性作用。【目的】本研究应用高通量芯片检测方法检测并筛选正常主动脉壁和主动脉夹层主动脉壁组织之间circRNA,miRNA以及mRNA差异表达谱,利用生物信息学方法分析circRNA,miRNA以及mRNA差异表达谱,构建主动脉夹层疾病显着相关的circRNA介导的ceRNA调控网络,并在分子水平、细胞水平以及组织水平进行验证,为主动脉夹层的早期生物标志物诊断以及分子靶向治疗提供实验基础。【方法】1.主动脉夹层中circRNA、miRNA以及mRNA表达谱筛查。选取6例正常主动脉壁组织和6例主动脉夹层主动脉壁组织,通过高通量芯片检测方法检测并筛选特异性circRNA,miRNA以及mRNA表达谱,并使用RT-qPCR验证芯片准确性。2.主动脉夹层中circRNA、miRNA以及mRNA表达谱的生物信息学分析。利用生物信息学相关方法分析circRNA,miRNA以及mRNA差异表达谱,构建与AD疾病显着相关的circRNA介导的ceRNA调控网络。3.Circ0022920通过竞争性结合miR-650调控TGFβR1表达在主动脉夹层发病机制中的作用研究。采用血管紧张素II（Ang II）诱导处理人主动脉平滑肌细胞（Human Aortic Smooth Muscle Cell,HASMC）构建主动脉夹层体外模型,沉默或过表达circ0022920或/和miR-650,以评估其生物学功能,通过CCK-8和EdU实验评估HASMC的增殖能力,Transwell和wound healing实验评估HASMC的迁移能力。此外,采用免疫印迹法（Western blotting,WB）分析HASMC的表型转换标志物（α-SMA,SM22α和OPN蛋白）的表达。此外,使用RNA pull-down,FISH和双荧光素酶报告基因分析验证了circ0022920和miR-650的直接调控作用。【结果】1.经高通量芯片检测方法检测共筛选得到881个明显差异表达的circRNA,其中285个明显上调,596个明显下调;185个明显差异表达的miRNA,其中170个明显上调,15个明显下调;以及2834个明显差异表达的mRNA,其中1928个明显上调,906个明显下调。RT-qPCR实验结果表明,所有验证样本组织的circRNA表达趋势均与本研究中的高通量芯片结果趋势一致,表示芯片结果准确性良好。2.CeRNA调控网络构建,共筛选得到了105个可能与主动脉夹层疾病密切相关的circRNA-miRNA-mRNA ceRNA调控轴,其中包含72个mRNA,25个circRNA,17个miRNA。在整个网络中,对于circRNA,我们发现circRNA404522、circRNA0022920、circRNA0075881、circRNA0062011、circRNA0000536连接度排名前5,可能是疾病发生过程中关键的circRNA,对于miRNA,miR-1285-3p、miR-637、miR-650、miR-485-5p和miR-509-5p连接度排名前5,而对于靶基因,我们发现TINAGL1、JPH4、PLXNA2、TGFβR1和THSD4在整个ceRNA网络中连接度排名前5,这些RNA分子可能与主动脉夹层疾病密切相关。通过这些生物信息分析,我们预测circRNA0022920介导的miR-650/TGFβR1调控轴在主动脉夹层疾病中发挥重要的调控作用。3.Circ0022920通过竞争性结合miR-650调控TGFβR1表达在主动脉夹层发病机制中的作用研究,在主动脉夹层组织中circ0022920与TGFβR1含量明显降低,miR-650含量显着性升高。Pearson相关性检测揭示了circ0022920与miR-650之间以及miR-650与TGFβR1之间呈负相关,circ0022920与TGFβR1之间呈正相关。Ang II诱导处理的HASMC中circ0022920表达下调和miR-650表达上调。过表达circ0022920后抑制了HASMC的增殖、迁移和表型转换,而过表达miR-650后发挥了相反的作用。过表达miR-650能逆转circ0022920过表达所引起的HASMC增殖、迁移抑制作用以及表型转换。RNA pull-down,FISH和双荧光素酶报告基因分析证实了circ0022920可以直接与miR-650结合。沉默miR-650后,TGFβR1的表达量升高;而过表达miR-650后,TGFβR1的表达量降低。沉默miR-650后,抑制HASMC的增殖、迁移和表型转换,而同时沉默TGFβR1后,这种抑制作用能被完全逆转。【结论】1.获得了主动脉夹层疾病中circRNA,miRNA以及mRNA的差异表达谱,共筛选得到881个明显差异表达的circRNA;185个明显差异表达的miRNA;以及2834个明显差异表达的mRNA。2.根据生物信息分析方法,共筛选得到了105个circRNA-miRNA-mRNA ceRNA调控轴,其中包含72个mRNA,25个circRNA,17个miRNA。这些RNA可能是主动脉夹层疾病分子调控机制中的关键基因。3.在主动脉夹层疾病中,circ0022920和TGFβR1表达上调,而miR-650表达下调。Circ0022920维持HASMC的收缩表型,而miR-650损害HASMC的收缩表型。Circ0022920直接靶向调控miR-650。Circ0022920通过miR-650/TGFβR1轴调节HASMC的表型转换并抑制主动脉夹层。综上所述,我们的研究发现有助于阐明circ0022920在主动脉夹层中的作用。更重要的是,我们的研究为circ0022920作为主动脉夹层诊断的生物标志物和治疗靶标提供坚实的实验基础。
余正洪[9]（2020）在《DVT患者外周血差异表达circRNA的筛选验证及互作网络分析》文中指出[目的]深静脉血栓形成（DVT）是骨科大手术后较常见的并发症,尤其是髋膝关节置换术后,由于患者腿部静脉血流瘀滞、内皮损伤以及凝血级联异常激活,没有抗凝治疗的情况下,DVT发病率明显提高。针对DVT分子生物学水平的调控机制,国内外进行了许多研究,发现一些微小RNA（miRNA）与DVT发生发展相关,但其调控网络需进一步发掘完善。随着对非编码RNA（ncRNA）深入研究,发现环状RNA（circRNA）在血栓性疾病领域具有较强的创新意义,为临床诊疗提供了新的研究方向。本项研究通过circRNA芯片技术检测DVT患者与对照组外周血中circRNA的表达,筛选出差异表达的circRNA。采用实时定量逆转录聚合酶链反应（qRT-PCR）选定circRNA对芯片结果进行验证。通过生物信息学（Bioin-formatics）手段,包含基因本体（GO）分析和基因与基因组百科全书（KEGG）通路分析预测差异表达circRNA的功能。为候选circRNA构建circRNA-miRNA-mRNA预测网络,丰富miRNA数据。为寻找特异性强、灵敏度高的分子标志物 以预测DVT发生、监测DVT进程、评估病情及预后提供一定基础。[方法]1.根据纳入排除标准,结合双下肢彩色多普勒血管超声诊断,收集了 2019年2月至2019年12月于昆明医科大学第一附属医院就诊的10例DVT患者作为DVT组（实验组）,其中6例男性,4例女性,平均年龄66.5±3.27岁;收集了同期于昆明医科大学第一附属医院就诊的10例无DVT患者作为对照组,其中5例男性,5例女性,平均年龄65.1 ±2.54岁。DVT包括胫前胫后静脉、腓静脉、腘静脉和股静脉的血栓。2.随机选取DVT组3例研究对象,对照组3例研究对象,采集外周静脉血,分别提取两组外周血样本的总RNA,去除核糖体RNA及线性RNA后,使用circRNA芯片技术,检测DVT组和对照组样本的circRNA表达情况。3.将两组样本实验结果归一化处理,进行统计分析,比较两组样本间的表达差异。对两组间差异表达的circRNA基因分层聚类分析及可视化处理。4.选定差异表达最显着的前5位circRNA对芯片检测结果进行验证。具体为:分别采集DVT组和对照组各余下的7例研究对象外周静脉血,提取总RNA,进行qRT-PCR实验,检测两组样本中circRNA表达量,验证circRNA芯片检测结果。5.选择完成验证的5位circRNA中差异最显着的circRNA,通过Arraystar基于miRanda和TargetScan数据库自制miRNA预测软件,以及miRNA靶标预测软件,构建该circRNA的circRNA/miRNA/mRNA作用网络,通过生物信息学分析其功能。6.使用SPSS 19.0软件统计数据,计量资料用均数（mean）±标准差（SD）表示,采用T检验评价结果的显着性,p<0.05表示两组的差异有统计学意义。[结果]1.用于筛查两组样本间circRNA表达差异的6个样本（即3个DVT组样本,3个对照组样本）的实验结果数据归一化强度近似相同分布,6个样本log2-ratio的分布相似。2.基因分层聚类分析显示,两组样本的circRNA表达有差异。3.与对照组相比,circRNA在DVT患者中有不同的表达模式。统计分析表明两组样本间circRNA的差异表达有统计学意义（fold change>2.0,p<0.05）。4.与对照组相比,DVT组样本中有303个circRNA表达失调,其中83个表达上调,220个表达下调。5.差异表达的circRNA大部分为外显子型circRNA,主要转录来源为chr1、chr2、chr12 和 chr10。6.qRT-PCR 实验结果显示,DVT 组样本中 hascirc000455、hascirc101515、hascirc101212 表达水平升高,hascirc000185、hascirc001982 表达水平降低。7.对差异表达circRNA进行生物信息学分析显示,与生物过程、细胞成分和分子功能密切相关的术语分别是蛋白转运、细胞质和ATP结合。最显着富集的途径为:胸腺激素信号通路、肿瘤内吞作用、蛋白多糖、Fc-r介导的吞噬作用、局灶性粘附激酶信号通路、胰岛素信号通路、p53信号通路、抗生素生物合成、上皮细胞细菌侵袭、AMPK信号通路。8.hascirc000455 的预测 miRNA 靶标为 hsamiR20b3p、hsamiR223p、hsamiR225p、hsamiR1385p 和 hsamiR559。9.qRT-PCR 检测结果显示,DVT组样本中 hsamiR20b3p、hsamiR223p、hsamiR559表达下调。10.miRNA靶标预测软件预测有652个靶点与hsa circRNA000455相互作用,其中313个靶基因与hsa-miR-138-5p相互作用,相互作用网络最大;229个靶基因与hsa-miR-22-3p相互作用,呈第二大相互作用网络。[结论]1.DVT患者外周血差异表达最显着的circRNA:circ000455、circ101515、circ101212表达水平升高,circ000185、circ001982表达水平降低。2.DVT 患者外周血中 circ000455 的预测靶向 miRNA:miR225P、miR1385p表达水平升高,miR20b3p、miR223p、miR559表达水平降低。3.生物信息学分析示:circRNA000455/miR-22-3p/NLRP3可能参与DVT发展。
牛江涛[10]（2020）在《术后颅内感染患者预后相关因素分析及感染脑脊液circRNA筛选》文中研究表明研究目的:临床研究部分通过收集神经外科术后颅内感染患者病例资料,回顾性分析神经外科术后中枢神经系统感染患者预后相关各临床影响因素,旨在指导临床治疗及改善感染患者预后。实验室研究部分通过检测颅内感染患者的脑脊液,研究感染脑脊液中显着性差异表达的circRNA指标,并利用生物信息学技术分析其可能作用机制;以期将其作为颅内感染的脑脊液实验室诊断的生物标志物,旨在早期明确诊断、早期治疗以改善感染患者预后。研究方法:临床研究部分,纳入了113例神经外科手术后确诊为中枢神经系统感染的患者,将病例中多个相关临床因素纳入单因素分析,其中变量的分析方法分别采用相应的统计学分析方法（t检验、秩和检验、卡方检验、Fisher’s精确检验）,而后将有显着性差异的影响因素再进行多因素分析（logistic回归分析）,最后分析出神经外科术后中枢神经系统感染患者预后相关的临床影响因素。实验室研究部分,纳入了33例神经外科手术后确诊为中枢神经系统感染的患者,并收集其感染状态及非感染状态的脑脊液;第一步,利用基因芯片技术,检测3例患者的术后颅内感染患者感染状态及非感染状态的脑脊液,筛选出感染脑脊液中显着性差异表达的circRNA指标,并数据分析,挑选出候选的供验证用14个circRNA指标;第二步,利用qRT-PCR技术,选用基因芯片实验所用的原样本,验证14个候选circRNA指标,并数据分析,挑选出供扩大样本验证用3个候选circRNA指标;第三步,利用qRT-PCR技术,选用收集的30例患者的脑脊液标本,验证3个候选circRNA指标,将其作为颅内感染的实验室诊断生物标志物;最后利用生物信息学技术分析其可能作用机制。结果:临床研究部分,纳入了年龄、原发病、感染相关手术时间（小时）、感染相关手术次数、是/否急诊手术、感染前引流管放置时间（天）、应用治疗抗生素时间（天）、治疗抗生素数目、脑脊液白细胞数（×106/L）、脑脊液红细胞数（×106/L）、脑脊液红/白比、脑脊液单核细胞百分比（%）、脑脊液多核细胞百分比（%）、细菌培养（被归类）、细菌培养数目、脑脊液生化糖（mmol/l）、脑脊液生化蛋白（mg/1）、脑脊液氯（mmol/1）、感染持续时间（天）等因素进行单因素分析;分析结果显示是/否急诊手术、感染相关手术次数、感染前引流管放置时间（天）、治疗抗生素数目、应用治疗抗生素时间（天）、脑脊液中白细胞数（106/L）、脑脊液生化糖（mmol/1）、脑脊液生化蛋白（mg/1）、细菌培养（被归类）、细菌培养数目、感染持续时间有显着性差异影响（P<0.05）;将单因素分析有意义的影响因素纳入Logistic分析,得出结论,感染前引流管放置时间（b:-0.113,OR:0.893,95%CI:0.805-0.991,P:0.033）、治疗抗生素数目（b:-1.470,OR:0.230,95%CI:0.072-0.738,P:0.013）、脑脊液中白细胞数（b:-0.016,OR:0.984,95%CI:0.970-0.998,P:0.027）均为治愈的危险因素;应用治疗抗生素时间（天）（b:0.176,OR:1.193,95%CI:1.063-1.339,P:0.003）为治愈的保护因素。实验室研究部分,第一步,利用基因芯片技术,发现了 214种在感染脑脊液中存在显着性差异表达的环状RNA,其中有72种环状RNA呈上调表达,142种呈下调表达;通过数据分析,选择差异倍数大的,同时结合P值符合显着性差异的要求,纳入验证实验的circRNA指标14个,上调circRNA是hsacircRNA402768,hsacircRNA402632,hsacircRNA061260,hsacircRNA048410,hsacircRNA048148,hsacircRNA402482;下调的circRNA 是hsacircRNA055243,hsacircRNA101900,hsacircRNA405481,hsacircRNA007059,hsacircRNA101366,hsacircRNA102213,hsacircRNA008636,hsacircRNA-009012。第二步,利用 qRT-PCR 技术,选用基因芯片实验所用的原样本,验证了 14个候选circRNA指标,选择原样本验证结果中表达差异倍数比较大,P值比较小的circRNA,作为有显着表达差异意义的候选的扩大验证circRNA指标,上调的circRNA选择的是hsacircRNA402632,在下调的 circRNA 中,选择的是 hsacircRNA008636 和hsacircRNA405481;共三个circRNA指标进行扩大样本的验证实验。第三步,利用qRT-PCR技术,进行扩大脑脊液标本的验证实验,验证的三种circRNA结果中,其中上调的circRNA指标1个为:hsacircRNA402632表达差异倍数2.065（P:0.0008）,hsacircRNA008636 表达下调,差异倍数为 0.416（P:0.0001）,hsacircRNA405481 表达下调,差异倍数为 0.452（P:0.0002）,这 3 种 circRNA的功能尚不清楚,进行了生物信息学分析,FoxO和AMPK信号通路是hsacircRNA008636最重要的通路,推测hsacircRNA008636可能与氧化应激和炎症反应有关,hsacircRNA008636在颅内感染的诊断中具有广阔的应用前景,关于hsacircRNA402632,胰岛素抵抗途径可被富集,而关于hsacircRNA405481,子宫内膜癌信号途径、Fc-epsilon-RI信号途径和TGF-beta信号途径可被富集,均具有诊断颅内感染的潜力。结论:临床研究部分得出结论,随着感染前引流管放置时间、治疗抗生素数目、脑脊液中白细胞数的数值上升,转归越容易出现恶化,随着应用治疗抗生素时间数值上升转归越容易出现治愈。实验室研究部分得出结论,表达上调的circRNA指标:hsacircRNA402632,表达下调 circRNA 指标:hsacircRNA008636、hsacircRNA405481,均有作为神经外科术后颅内感染患者脑脊液实验室诊断的生物标志物的潜力,并通过一些可能的作用机制在颅内感染中发挥作用。
二、基因表达芯片在心血管分子生物学研究中的应用（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、基因表达芯片在心血管分子生物学研究中的应用（论文提纲范文）
（1）构建心力衰竭基因表达调控网络并验证SRSF3在其中的作用机制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略词表 |
| 第一部分 心力衰竭差异表达基因的数据挖掘 |
| 前言 |
| 一、实验材料和仪器 |
| 二、实验方法 |
| 三、实验结果 |
| 四、讨论 |
| 五、结论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 基于生物信息学构建心力衰竭中mRNA可变剪接的调控网络 |
| 前言 |
| 一、实验材料和仪器 |
| 二、实验方法 |
| 三、实验结果 |
| 四、讨论 |
| 五、结论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 SRSF3在心力衰竭中的功能与机制探索 |
| 前言 |
| 一、实验材料和仪器 |
| 二、实验方法 |
| 三、实验结果 |
| 四、讨论 |
| 五、结论 |
| 参考文献 |
| 总结与展望 |
| 一、论文研究结论 |
| 二、本研究存在的不足 |
| 附录 |
| 综述 单细胞转录组测序在人心血管疾病中的应用 |
| 参考文献 |
| 在读期间发表论文 |
| 致谢 |
（2）基底刚度通过TRPV4/miR-6740/ET-1力学响应通路调控内皮细胞功能的研究（论文提纲范文）
| 缩略词表 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一章 基底刚度对内皮细胞功能的调控规律 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 实验试剂 |
| 1.1.2 仪器与耗材 |
| 1.1.3 溶液配制 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 人脐静脉内皮细胞的培养及传代 |
| 1.2.2 不同刚度的水凝胶基底培养人脐静脉内皮细胞 |
| 1.2.3 细胞免疫荧光 |
| 1.2.4 mRNA的提取和反转录 |
| 1.2.5 实时荧光qPCR |
| 1.2.6 免疫印迹(Western blot)实验 |
| 1.2.7 细胞上清液中化学物质的测定 |
| 1.3 结果 |
| 1.3.1 基底刚度对内皮细胞骨架生成和黏附作用的影响 |
| 1.3.2 基底刚度对内皮细胞血管活性功能基因mRNA表达的影响 |
| 1.3.3 基底刚度对内皮细胞表达eNOS和 ET-1 蛋白的影响 |
| 1.3.4 基底刚度对内皮细胞分泌血管活性物质的调控 |
| 1.4 讨论 |
| 1.5 小结 |
| 第二章 内皮细胞刚度响应miRNA的筛选及功能验证 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 实验试剂 |
| 2.1.2 仪器与耗材 |
| 2.1.3 溶液配制 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 内皮细胞培养 |
| 2.2.2 miRNA微阵列(芯片) |
| 2.2.3 miRNA的提取和反转录 |
| 2.2.4 miRNA的荧光定量PCR检测 |
| 2.2.5 质粒载体和siRNA合成 |
| 2.2.6 重组质粒的转化、扩增与抽提 |
| 2.2.7 内皮细胞的siRNA转染 |
| 2.2.8 双荧光素酶报告基因检测 |
| 2.2.9 mRNA的提取和逆转录 |
| 2.2.10 ET-1的荧光qPCR检测 |
| 2.2.11 酶联免疫吸附试验 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 miRNA芯片筛选 |
| 2.3.2 基因本体(GO)分析 |
| 2.3.3 Pathway分析 |
| 2.3.4 差异表达miRNA的生物学验证 |
| 2.3.5 miR-6740的调控靶位点预测 |
| 2.3.6 构建质粒的测序验证 |
| 2.3.7 双荧光素酶报告基因检测 |
| 2.3.8 miR-6740模拟物和抑制物转染对ET-1表达的影响 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 TRPV4 响应刚度变化并调控miR-6740和ET-1表达 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 实验试剂 |
| 3.1.2 仪器与耗材 |
| 3.1.3 溶液配制 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.2 TRPV4的荧光定量PCR检测 |
| 3.2.3 TRPV4的细胞免疫荧光检测 |
| 3.2.4 miRNA的提取和逆转录 |
| 3.2.5 miR-6740的荧光定量PCR检测 |
| 3.2.6 酶联免疫吸附试验 |
| 3.2.7 细胞钙离子成像 |
| 3.2.8 细胞膜片钳实验 |
| 3.2.9 统计作图 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 基底刚度对TRPV4表达水平的影响 |
| 3.3.2 TRPV4离子通道活性改变调控miR-6740表达水平 |
| 3.3.3 TRPV4离子通道活性改变调控ET-1的表达 |
| 3.3.4 刚度对内皮细胞TRPV4活性及钙离子内流的影响 |
| 3.3.5 基底刚度变化对内皮细胞TRPV4 通道活性的调节 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 血浆miR-6740与动脉粥样硬化的相关性 |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 实验试剂 |
| 4.1.2 仪器与耗材 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 细胞上清液外泌体抽提 |
| 4.2.2 动态光散射技术检测抽提物粒径 |
| 4.2.3 细胞流式检测外泌体表面标志物 |
| 4.2.4 临床血浆样本收集和制备 |
| 4.2.5 血浆miRNA的提取和逆转录 |
| 4.2.6 miR-6740的荧光定量PCR检测 |
| 4.2.7 统计作图 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 外泌体的鉴定 |
| 4.3.2 外泌体miR-6740含量 |
| 4.3.3 血浆miR-6740含量与动脉硬化的相关性 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 第五章 总结与展望 |
| 参考文献 |
| 作者在学期间取得的学术成果 |
| 附件 |
| 主要简历 |
| 致谢 |
（3）传统中药与介入治疗对动脉粥样硬化病变的作用及其机制研究（论文提纲范文）
| 论文Ⅰ 应用基因芯片技术对中药通心络多靶点抗动脉粥样硬化作用的机制研究 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 缩略语说明 |
| 前言 |
| 1. 材料与方法 |
| 2. 实验结果 |
| 3. 讨论 |
| 4. 创新性与限制性 |
| 5. 结论 |
| 附图表 |
| 参考文献 |
| 论文Ⅱ 支架植入对动脉粥样硬化非靶病变的作用及其机制研究 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 缩略语说明 |
| 前言 |
| 1. 材料与方法 |
| 2. 实验结果 |
| 3. 讨论 |
| 4. 创新性与限制性 |
| 5. 结论 |
| 附图表 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读博士学位期间发表的论文 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
| Paper Ⅰ |
| Paper Ⅱ |
（4）长链非编码RNA01278竞争性抑制miR-500b-5p调控ACTG2促进平滑肌细胞增殖在主动脉夹层形成中的作用机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 中英文缩略表 |
| 综述 长链非编码RNA在心血管疾病中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 第1章 绪论 |
| 第2章 主动脉夹层升主动脉组织特点及增殖型血管平滑肌细胞模型诱导 |
| 概述 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 主动脉夹层患者入组及对照体系建立 |
| 2.1.2 实验试剂 |
| 2.1.3 实验仪器 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 升主动脉组织HE染色法 |
| 2.2.2 升主动脉组织免疫组化 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 入组患者信息 |
| 2.3.2 血管形态学特点 |
| 2.3.3 人升主动脉血管平滑肌细胞增殖型细胞模型诱导 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第3章 主动脉夹层患者升主动脉血管平滑肌细胞长链非编码RNA和m RNA表达谱的研究 |
| 概述 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 实验试剂 |
| 3.1.2 实验仪器 |
| 3.1.3 lncRNA和 m RNA芯片信息 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 实验组和对照组组织RNA提取 |
| 3.2.2 lncRNA和 m RNA基因芯片检测 |
| 3.2.3 基因芯片实时定量PCR验证 |
| 3.2.4 统计学分析 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 升主动脉样本检测 |
| 3.3.2 RNA琼脂糖凝胶电泳 |
| 3.3.3 标记效率质控 |
| 3.3.4 lncRNA和 mRNA高通量基因芯片结果 |
| 3.3.5 lncRNA和 mRNA高通量基因芯片原始和矫正结果 |
| 3.3.6 差异表达lncRNA高通量基因芯片结果筛选 |
| 3.3.7 差异表达m RNA高通量基因芯片结果筛选 |
| 3.3.8 实时定量PCR验证lncRNA和 mRNA高通量基因芯片准确性 |
| 3.4 讨论 |
| 第4章 主动脉夹层患者升主动脉平滑肌组织差异表达lncRNA和 mRNA的现代高通量生物信息学分析 |
| 概述 |
| 4.1 生物信息学研究工具 |
| 4.2 研究方法 |
| 4.2.1 差异表达m RNA高通量基因芯片现代生物信息学分析 |
| 4.2.2 差异表达lncRNA和 miRNA ceRNA调控网络构建 |
| 4.2.3 韦恩分析 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 交叉融合分析主动脉夹层基因测序 |
| 4.3.2 共同表达差异基因富集分析 |
| 4.3.3 共表达差异基因蛋白互作网络 |
| 4.3.4 主动脉夹层核心发病基因预测 |
| 4.3.5 lncRNA及 miRNA预测以及韦恩分析 |
| 4.3.6 lncRNA及miRNA以及mRNA调控网络 |
| 4.4 讨论 |
| 第5章 linc01278 在主动脉夹层血管平滑肌细胞增殖及表型转化过程中的分子机制 |
| 概述 |
| 5.1 实验材料 |
| 5.1.1 实验试剂 |
| 5.1.2 实验仪器 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.2.1荧光原位杂交实验 |
| 5.2.2 linc01278 干扰实验 |
| 5.2.3 linc01278 过表达实验 |
| 5.2.4 细胞增殖实验 |
| 5.2.5 细胞迁移实验 |
| 5.3 结果 |
| 5.3.1 荧光原位杂交确认linc01278 位于细胞质中 |
| 5.3.2 敲低linc01278 后主动脉夹层血管平滑肌细胞发生表型转换 |
| 5.3.3 过表达linc01278 后主动脉夹层血管平滑肌细胞发生表型转换 |
| 5.4 讨论 |
| 第6章 miR-500b-5p与 linc01278和ACTG2 结合位点验证 |
| 概述 |
| 6.1 实验材料 |
| 6.1.1 实验试剂 |
| 6.1.2 实验仪器 |
| 6.1.3 荧光素酶报告基因质粒 |
| 6.2 实验方法 |
| 6.2.1 linc01278和ACTG2 结合位点序列合成 |
| 6.2.2 将位点序列插入荧光素酶报告基因质粒 |
| 6.2.3 将带有目的序列的pGL6-miR质粒转染293T细胞 |
| 6.2.4 萤光素酶报告基因检测 |
| 6.2.5 统计学分析 |
| 6.3 结果 |
| 6.3.1 linc01278与miR-500b-5p结合位点验证 |
| 6.3.2 ACTG2与miR-500b-5p的结合位点验证 |
| 6.4 讨论 |
| 第7章 结论 |
| 创新点与不足之处 |
| 参考文献 |
| 作者简介及在学期间所取得的科研成果 |
| 致谢 |
（5）川崎病患儿血清中外泌体的提取及外泌体源性miRNAs差异性表达研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 实验材料 |
| 实验方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 心血管疾病中外泌体的相关研究及进展 |
| 结语与展望 |
| 参考文献 |
| 中英文缩略字表 |
| 在读学位期间发表的论文 |
| 致谢 |
（6）基于DNA羟甲基化修饰调控mRNA表达探讨早发冠心病血瘀证相关易感基因（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略词表 |
| 前言 |
| 第一部分 早发冠心病血瘀证DNA羟甲基化差异基因筛选 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 主要仪器 |
| 1.2 主要耗材 |
| 1.3 主要试剂 |
| 2 研究对象 |
| 2.1 诊断标准 |
| 2.2 临床资料 |
| 3 研究方法 |
| 3.1 病例分组 |
| 3.2 量表填写 |
| 3.3 样本采集 |
| 3.4 基因组DNA提取和片段化 |
| 3.5 免疫共沉淀和DNA纯化 |
| 3.6 DNA标记和芯片杂交 |
| 3.7 数据采集和标准化 |
| 4 统计学分析 |
| 5 研究结果 |
| 5.1 一般资料 |
| 5.2 羟甲基化芯片质量检测 |
| 5.3 羟甲基化芯片数据采集与分析 |
| 5.4 差异羟甲基化基因启动子区域的DEP分析 |
| 5.5 差异羟甲基化基因DEP聚类分析 |
| 第二部分 mRNA表达谱芯片检测早发冠心病血瘀证差异基因 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 主要仪器 |
| 1.2 主要耗材 |
| 1.3 主要试剂 |
| 2 研究对象 |
| 2.1 诊断筛选标准 |
| 2.2 病例来源及分组 |
| 2.3 量表填写 |
| 2.4 样本采集 |
| 3 研究方法 |
| 3.1 RNA提取与质控 |
| 3.2 RNA逆转录 |
| 3.3 RNA标记和杂交 |
| 3.4 数据采集和标准化 |
| 4 统计学分析 |
| 5 研究结果 |
| 5.1 一般资料 |
| 5.2 全基因组芯片RNA质检 |
| 5.3 全基因组芯片数据采集与分析 |
| 5.4 全基因组差异基因聚类分析 |
| 第三部分 两种检测早发冠心病血瘀证差异基因及通路研究 |
| 1 两种检测中早发冠心病血瘀证差异基因分析 |
| 2 两种检测中差异基因GO功能分析 |
| 3 两种检测中差异基因pathway分析 |
| 4 早发冠心病血瘀证LRIG1、TUBB2A基因及相关通路 |
| 讨论 |
| 1 中医对冠心病血瘀证的认识 |
| 2 早发冠心病血瘀证的遗传基因相关性研究 |
| 3 早发冠心病血瘀证与DNA羟甲基化的相关性研究 |
| 4 早发冠心病血瘀证与mRNA差异表达的相关性研究 |
| 5 早发冠心病血瘀证与TUBB2A、LRIG1 基因的相关性研究 |
| 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 1:早发冠心病临床调查表 |
| 附录 2:基于表观遗传学探讨早发冠心病血瘀证易感基因的研究进展 |
| 参考文献 |
| 附录 3:攻读学位期间主要研究成果及获奖情况 |
（7）冠心病相关LncRNA关键基因的筛选及验证（论文提纲范文）
| 英汉缩略语名词对照 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 第一章 RP1-276N6.2、TARID基因遗传变异与中国汉族人群冠心病的关联研究 |
| 前言 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 第二章 通过加权基因共表达网络分析(WGCNA)构建冠心病发生进程相关的关键LncRNA网络 |
| 前言 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 文献综述:LncRNA在冠心病中作用的研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读硕士学位期间发表的学术论文 |
（8）Circ0022920通过竞争性结合miR-650调控TGFβR1表达在主动脉夹层发病机制中的作用研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 中英文缩略词表 |
| 第1章 绪论 |
| 第2章 主动脉夹层患者circ RNA、mi RNA以及m RNA表达谱研究 |
| 概述 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 组织样本总RNA提取以及标记效率质控结果 |
| 2.3.2 circRNA,miRNA和 m RNA基因芯片扫描结果 |
| 2.3.3 circRNA,miRNA和 m RNA基因芯片表达谱信息标准化处理及注释 |
| 2.3.4 基因芯片数据的质量测评 |
| 2.3.5 显着性差异表达的circRNA,miRNA和 m RNA筛选 |
| 2.3.6 RT-qPCR验证基因芯片结果的准确性 |
| 2.4 讨论 |
| 第3章 主动脉夹层患者circRNA、mi RNA以及mRNA表达谱生物信息学分析 |
| 概述 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 差异mRNA功能富集结果 |
| 3.3.2 miRNA靶基因预测分析及miRNA-circRNA关系对整理 |
| 3.3.3 CircRNA与 m RNA以及miRNA与 mRNA共表达分析 |
| 3.3.4 CircRNA及 miRNA功能富集分析 |
| 3.3.5 CeRNA调节关系整合及网络构建 |
| 3.4 讨论 |
| 第4章 Circ_0022920 通过竞争性结合miR-650 调控TGFβR1 表达在主动脉夹层发病机制中的作用研究 |
| 概述 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 主动脉壁组织病理学检测 |
| 4.3.2 Circ_0022920、mi R-650 与TGFβR1 在AD主动脉中表达失调 |
| 4.3.3 Circ_0022920 在 AD 中维持 HASMC 的收缩表型 |
| 4.3.4 过表达mi R-650 在AD中损害HASMC的收缩表型 |
| 4.3.5 Circ_0022920 在HASMC中直接与mi R-650 结合 |
| 4.3.6 Circ_0022920 直接靶向mi R-650 调节AD中HASMC的表型转换 |
| 4.3.7 mi R-650 通过负向调控TGFβR1 的表达介导HASMC的表型转换 |
| 4.4 讨论 |
| 第5章 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 circ RNA及其在大血管疾病中的研究进展 |
| 1 circ RNA的起源 |
| 2 circ RNA的分布与表达特点 |
| 3 circ RNA的生物学功能 |
| 4 circ RNA在大血管疾病研究进展 |
| 4.1 circ RNA与大动脉炎 |
| 4.2 circ RNA与主动脉瘤 |
| 4.3 circ RNA与主动脉夹层 |
| 5 小结和展望 |
| 参考文献 |
| 作者简介及在学期间所取得的科研成果 |
| 致谢 |
（9）DVT患者外周血差异表达circRNA的筛选验证及互作网络分析（论文提纲范文）
| 缩略词表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 非编码RNA调控深静脉血栓形成的研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间获得的学术成果 |
| 致谢 |
（10）术后颅内感染患者预后相关因素分析及感染脑脊液circRNA筛选（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略词说明 |
| 1 引言 |
| 1.1 研究背景 |
| 1.1.1 术后颅内感染临床现状及存在问题 |
| 1.1.2 感染脑脊液实验室诊断现状及存在问题 |
| 1.1.3 生物标志物CircRNA研究进展 |
| 1.2 本研究的目的、意义、方法 |
| 2 神经外科术后颅内感染患者预后相关临床因素分析 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 入组患者纳入标准及排除标准 |
| 2.1.2 诊断标准 |
| 2.1.3 病例资料收集 |
| 2.1.4 数据分析 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 患者相关临床因素特征 |
| 2.2.2 统计分析危险因素 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 结论 |
| 3 基因芯片筛选感染脑脊液circRNA |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 入组患者纳入标准、排除标准 |
| 3.1.2 纳入患者资料 |
| 3.1.3 标本采集方法与初步处理 |
| 3.1.4 研究方法 |
| 3.1.5 实验材料 |
| 3.2 筛查circRNA |
| 3.2.1 基因芯片筛查circRNA实验流程 |
| 3.2.2 筛查circRNA实验 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 RNA质控 |
| 3.3.2 基因芯片 |
| 3.3.3 实验芯片的质控 |
| 3.3.4 总体circRNA表达量的箱形图分析 |
| 3.3.5 CircRNA表达的分层聚类分析 |
| 3.3.6 差异性表达circRNA散点图 |
| 3.3.7 差异表达circRNA火山图 |
| 3.3.8 差异表达的环状RNA |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 结论 |
| 4 qRT-PCR验证感染脑脊液circRNA及生物信息学分析 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 研究对象 |
| 4.1.2 实验仪器和试剂 |
| 4.1.3 circRNA验证实验流程 |
| 4.2 原样本验证circRNA |
| 4.2.1 标本的RNA抽提 |
| 4.2.2 总RNA提纯及质控 |
| 4.2.3 以标本RNA合成cDNA |
| 4.2.4 以cDNA行qRT-PCR |
| 4.2.5 结果 |
| 4.3 扩大样本验证circRNA |
| 4.3.1 标本的RNA抽提 |
| 4.3.2 总RNA提纯及质控 |
| 4.3.3 以标本RNA合成cDNA |
| 4.3.4 以cDNA行qRT-PCR |
| 4.3.5 结果 |
| 4.4 生物信息学分析circRNA的作用机制 |
| 4.5 讨论 |
| 4.6 结论 |
| 5 全文结论 |
| 参考文献 |
| 文献综述: circRNA与疾病诊断标志物研究 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
四、基因表达芯片在心血管分子生物学研究中的应用（论文参考文献）
- [1]构建心力衰竭基因表达调控网络并验证SRSF3在其中的作用机制[D]. 涂丁元. 中国人民解放军海军军医大学, 2021(09)
- [2]基底刚度通过TRPV4/miR-6740/ET-1力学响应通路调控内皮细胞功能的研究[D]. 宋祥. 军事科学院, 2020(02)
- [3]传统中药与介入治疗对动脉粥样硬化病变的作用及其机制研究[D]. 马静. 山东大学, 2020(04)
- [4]长链非编码RNA01278竞争性抑制miR-500b-5p调控ACTG2促进平滑肌细胞增殖在主动脉夹层形成中的作用机制研究[D]. 王维铁. 吉林大学, 2020(08)
- [5]川崎病患儿血清中外泌体的提取及外泌体源性miRNAs差异性表达研究[D]. 马旭莹. 苏州大学, 2020(02)
- [6]基于DNA羟甲基化修饰调控mRNA表达探讨早发冠心病血瘀证相关易感基因[D]. 张湘卓. 湖南中医药大学, 2020
- [7]冠心病相关LncRNA关键基因的筛选及验证[D]. 卓扬. 重庆医科大学, 2020(12)
- [8]Circ0022920通过竞争性结合miR-650调控TGFβR1表达在主动脉夹层发病机制中的作用研究[D]. 黄茂勋. 吉林大学, 2020(08)
- [9]DVT患者外周血差异表达circRNA的筛选验证及互作网络分析[D]. 余正洪. 昆明医科大学, 2020(02)
- [10]术后颅内感染患者预后相关因素分析及感染脑脊液circRNA筛选[D]. 牛江涛. 郑州大学, 2020(02)
标签：主动脉夹层论文; 内皮细胞论文; 主动脉粥样硬化论文; 血清蛋白论文; 冠心病的治疗方法论文;