一、脊髓损伤的治疗与功能恢复（论文文献综述）
常宇鑫[1]（2021）在《AAV-NT3与运动对脊髓损伤后肢体痉挛的干预及新型基因载体AAV-CPP.16的初步构建》文中指出研究背景肢体痉挛是脊髓损伤（SCI）后的最常见的并发症之一,据报道,12%～37%的急性脊髓损伤患者患有肌肉痉挛,而这一比例在慢性脊髓损伤患者中高达65%～78%。尽管严重的痉挛极大地影响了患者的生活质量和脊髓损伤后的恢复,但目前临床上对痉挛的治疗方式仍局限于对症处理。因此,开发一种新的抗痉挛疗法和康复模式,对于脊髓损伤患者的功能恢复和生活质量的提高至关重要。神经营养因子3（NT3）不仅能够降低运动神经元的兴奋性,而且是感觉神经元和运动神经元生存所必需的神经营养因子。研究表明,来自周围肌肉传入信号的输入对于恢复运动功能和重建脊髓损伤段的神经回路至关重要,而这可能是因为周围的肌肉纺锤体合成了NT3。同时,NT3在肌肉中的过度表达会重新平衡兴奋性和抑制性的输入。然而其能否使脊髓损伤后大鼠的脊髓反射正常化尚未得到证实。此外,运动被认为是临床上最简单,最安全,最有效的治疗方法,它能通过平衡感觉的输入和运动的输出来改善运动功能,从而改善患者的生活质量。同时强化训练可使脊髓的本体感受反射正常化。单一的治疗方法可能可以改善某种特定的功能,却无法做到面面俱到,而基于个体化医疗的某些疗法的组合,将预计取得更好的疗效。以病毒为载体的基因治疗能够将治疗基因特异性地输送到病变部位,使其在局部或全身长期稳定的表达,因此目前被广泛应用于中枢系统疾病的诊疗中。其中,腺相关病毒由于其安全、高效的优势被认为是最有希望的基因治疗载体。在众多血清型的AAV载体中,AAV9型腺相关病毒被认为是AAV载体中治疗中枢系统疾病的“标准”载体,但是由于AAV9型腺相关病毒载体穿过血脑屏障的效率仍未能达到预期,导致其治疗中枢系统疾病的效果欠佳。提高病毒的使用剂量或者调整给药途径例如鞘内给药是人们解决上述问题的两种尝试,但是前者会导致体内其他外周器官过大的暴露而产生毒性反应,而后者增加了显着的并发症风险。于是人们将目光聚集到了另外一种可能性的方式——通过对AAV载体的衣壳结构蛋白进行改造,从而改变其转染效率。研究目的构建编码人NT3的重组腺相关病毒（Adeno-associated virus,AAV）,探究编码人NT3的重组腺相关病毒（AAV-NT3）与运动干预相结合的联合疗法对脊髓损伤后肌肉痉挛的保护作用,并探究这种联合疗法减轻痉挛的作用机制,为临床工作中脊髓损伤后肌肉痉挛的防治提供理论基础。此外,构建具有更高传递效率的重组AAV,并探究不同的给药途径其对大脑、脊髓等中枢神经系统的传递效率及对外周组织器官的毒性,为基因治疗在中枢神经系统疾病中的应用起到指导和借鉴意义。研究方法1.编码人NT3的腺相关病毒的构建与验证:将绿色荧光蛋白（f-GFP）、神经营养因子3（NT3）及辅助质粒插入到由人类CMV启动子驱动的AAV载体中,然后通过HEK293细胞包装生产重组AAV。使用Western Blot法检测病毒注射后大鼠后肢肌肉与脊髓背根神经节中NT3蛋白表达的变化。2.AAV-NT3与运动干预对大鼠脊髓损伤后肌肉痉挛的保护作用:通过游泳测试及大鼠后肢肌肉的H反射评价大鼠的痉挛频率,并通过BBB评分评价大鼠的后肢运动功能。3.AAV-NT3与运动干预对大鼠脊髓损伤后肌肉痉挛保护作用的机制研究:运用免疫荧光染色法探究脊髓运动神经元和中间神经元的可塑性变化,并运用Western Blot法检测重组氯化钾协同转运蛋白2（KCC2转运体）的表达。4.新型中枢靶向性基因载体AAV-CPP.16的构建:将多肽序列插入AAV载体的衣壳蛋白基因组进行改造,生产出多种不同的腺相关病毒基因载体,并通过小鼠尾静脉注射和血脑屏障3D体外模型进行筛选。5.新型中枢靶向性基因载体AAV-CPP.16的转导效率:通过静脉注射和侧脑室注射两种主流的中枢神经系统给药途径,探究AAV-CPP.16是否可以在脊髓中高效、稳定地表达,以及其对外周器官的暴露毒性。结果1.成功构建了NT3重组腺相关病毒,并将其成功转染至大鼠体内;相比于对照组与AAV-GFP组,后肢肌肉注射了AAV-NT3的大鼠,其后肢肌肉与脊髓背根神经节（DRG）中NT3的表达水平显着增加。2.游泳测试及H反射的RDD显示AAV-NT3的基因治疗、运动干预及联合治疗均能降低肌肉痉挛的发生频率,但是只有AAV-NT3和联合治疗可以增加后肢BBB评分。3.联合疗法可以明显增加脊髓运动神经元的数量和面积,但是单独的AAVNT3基因疗法不具有此作用;联合治疗可以显着增加脊髓胆碱能中间神经元的面积与GABA能中间神经元的数量;AAV-NT3的基因疗法与联合治疗组脊髓中KCC2的表达显着增加。4.相比于对照组wt AAV9,注射了AAV-CPP.16的小鼠大脑内RFP阳性细胞百分比显着提高,同时在血脑屏障3D体外模型中表达的荧光强度明显增加。5.经静脉及侧脑室给药后,相比于AAV9,AAV-CPP.16在脊髓中绿色荧光蛋白的表达量提高,并且有更高比例的运动神经元与GFP标记的细胞相重合。6.经静脉注射后,相比于AAV9,AAV-CPP.16在脊髓DRG及除肝脏和心脏外的外周组织器官中GFP阳性细胞的比例显着增高;经侧脑室注射后,AAV9与AAV-.CPP.16在外周组织器官中几乎不表达GFP蛋白。结论1.AAV-NT3的基因治疗、运动干预及联合治疗均能减轻损伤后的肌肉痉挛;与单纯的基因治疗或运动干预相比,联合治疗有一定的疗效趋势,但差异并不显着。2.AAV-NT3的基因疗法对运动神经元的作用效果有限,而单纯的运动干预无法改善后肢的运动功能。二者的联合治疗不仅可以通过改变脊髓运动神经元、中间神经元的兴奋性以及增加脊髓内KCC2的含量来减轻脊髓损伤后的肌肉痉挛,也可以显着改善后肢的运动功能。3.相比于wt AAV9,AAV-CPP.16在多种品系小鼠及食蟹猴体内均具有更高的血脑屏障穿透效率和大脑细胞转染效率,并且随着病毒剂量的提升,其效率也随之显着提升。4.经静脉内或侧脑室给药后,相对于AAV9,AAV-CPP.16将基因传递给成年小鼠脊髓及运动神经元的效率均显着提高。5.静脉注射AAV-CPP.16不会带来明显的DRG与肝脏毒性,但是会引起外周组织的大量暴露;而在侧脑室给药途径下,极高传递效率的AAV-CPP.16不会造成明显的DGR毒性,其对外周组织也几乎不具有暴露毒性。
吴子健[2]（2021）在《通腑逐瘀法指导下抵当汤加减调控AQP4表达治疗大鼠急性脊髓损伤的作用机制研究》文中认为目的 本次研究结合急性脊髓损伤（acute spinal cord injury,ASCI）的研究现状和热点,基于导师的临床经验,以通过抑制水通道蛋白4（aquaporin 4,AQP4）的表达从而减轻ASCI后脊髓水肿为切入点,旨在探讨通腑逐瘀法治则指导下抵当汤加减治疗ASCI的可能作用机制,以期为推广通腑逐瘀法治疗ASCI提供理论依据。方法 第一部分:10周龄SD大鼠30只,按随机数字表法随机分为假手术组（A组）、自制打击器2cm组（B1组）、自制打击器4cm组（B2组）、NYU组1.25cm组（C1组）、NYU组2.5cm组（C2组）,每组各6只。除Sham组外,其余各组采用改良Allen’s法造模。B1、B2组将9g打击杆分别从2cm、4cm处自由坠落撞击T10脊髓,C1、C2组使用NYU打击器分别从1.25cm、2.5cm处撞击T10脊髓。各组造模完成后分别于1、3、5、7d进行BBB评分和Reuter评分,7d后行灌注取材,石蜡包埋切片,尼氏染色,观察各组组织受损程度和神经元存活率。第二部分:10周龄SD大鼠60只按随机分配方法随机分为假手术组（Sham）、模型组（Model）、抵当汤组（DDD）、TGN-020组（TGN-020）和抵当汤联合TGN-020组（DDD+TGN-020）,每组各12只。Sham组仅打开椎板暴露脊髓但不损伤脊髓;其余各组均采用自制脊髓打击器从40mm高度对脊髓进行打击。Sham组和Model组术后不予任何治疗措施干预,DDD组于术后3d予以抵当汤加减每日灌胃,持续3d,根据大鼠与人用药剂量体表面积换算法,DDD组大鼠每日用药剂量为5.04g/kg,采用蒸馏水进行稀释一定比例配制后予以灌胃处理,每日早晚各1次。TGN-020组处理方法:腹腔注射给药,每日用药剂量为5mg/kg,给药时间为3d。DDD+TGN-020组处理方法:予TGN-020腹腔注射给药,随后给予DDD灌胃处理。干预结束后进行行为学评价（BBB评分、斜板实验及Reuter评分）观察大鼠神经功能恢复情况,取材后进行脊髓组织大体观察和含水率检测、HE染色观察组织受损程度,尼氏染色观察神经元形态,免疫荧光检测各组脊髓组织AQP4、GFAP共表达的阳性细胞个数,Western Blot法检测各组脊髓组织中AQP4、GFAP、CSPG、PCNA、NGF、BDNF、GAP-43蛋白的表达量,q PCR法检测各组脊髓组织中CSPG、PCNA基因的表达量,电镜下观察各组髓鞘和神经元组织形态,高尔基染色观察树突和树突棘形态。第三部分:8周龄SD大鼠40只随机分为空白血清组和含药血清组,含药血清组给予5.04g/kg DDD灌胃,持续3d,空白血清组予等剂量超纯水灌胃,持续3d,干预结束后提取血清备用。每次取胚胎大鼠8-12只,通过机械-酶消化法提取星形胶质细胞（Astrocytes,AS）,细胞采用10%的高糖培养基培养,观察细胞传代至第3代进行后续实验。首先,免疫荧光鉴定细胞中GFAP含量,随后进行实验分组:空白组（Control group,CG）、模型组（Model group,MG）、空白血清组（Blank serum group,BSG）、DDD含药血清组（DDD）、TGN-020干预组（TGN-020）、DDD联合TGN-020组（DDD+TGN-020）,除MG外,其余各组均以划痕法进行造模,造模完成后DDD予以含药血清干预,BSG予以等剂量空白血清干预,TGN-020予以100nm TGN-020干预,DDD+TGN-020先予TGN-020干预后再予DDD干预。MTT法检测DDD含药血清干预AS的安全干预浓度、最佳干预时间和干预浓度,MTT法检测各组对RAS活性的影响,免疫荧光染色法检测RAS中AQP4和GFAP共表达的细胞数,Western Blot法检测各组RAS中AQP4、GFAP和NGF、BDNF、GAP-43蛋白的表达量,镜下观察DDD含药血清对RAS迁移率的影响。统计学方法:实验所得数据均使用SPSS21.0软件进行统计学处理,计量资料以均值±标准误（`X±S）表示,所得数据均经过正态性分布检测,若符合正态分布,则采用单因素方差分析,方差齐则采用LSD法,方差不齐则采用Games-Howell法;若不符合正态分布,则采用非参检验。以P<0.05提示差异具有统计学意义。结果 第一部分:自制脊髓打击器与NYU打击器建立脊髓损伤模型研究1.各组脊髓外观形态比较A组T10节段处硬脊膜完整,脊髓组织呈均匀乳白色,形态饱满圆润;B1、B2、C1、C2组T10节段处硬脊膜均完整,颜色呈不同程度的鲜红色或暗红色,损伤处可见水肿、瘀血及瘢痕组织增生,相对于B1、C1组,B2、C2组水肿更严重、瘀血范围更广、颜色更深、瘢痕组织更多。2.行为学评分比较BBB评分结果显示,A组术后除因手术致运动量减少外,未出现双下肢功能异常的表现,评分为21分;其余各组均出现不同程度的运动功能障碍,具体表现为:B2与B1、C2与C1相比,BBB评分显着降低,差异具统计学意义（P<0.05）;B1与C1、B2与C2相比,BBB评分无显着差异（P>0.05）。Reuter评分结果显示,A组术后未发现感觉功能异常现象;其余各组术后均出现不同程度的感觉功能异常现象,具体表现为B2、C2组术后1d牵张反射消失,肌力、肌张力减弱或消失,疼痛回缩反射迟钝,背部感觉存在或消失;B1、C1组术后1d除肌力消失外,牵张反射、肌张力、疼痛回缩反射、背部感觉均存在,术后3d肌力开始恢复。B2与B1、C2与C1相比,Reuter评分显着降低,差异具统计学意义（P<0.05）。B1与C1、B2与C2相比,Reuter评分无显着差异（P>0.05）。3.尼氏染色尼氏染色结果显示,A组脊髓组织结构完整,灰白质边界清晰,神经元细胞形态规则、胞核大、核仁清晰可见、数量多,胞质内可见斑块样尼氏体。相比A组,其余各组结构破坏更严重,灰白质结构不清,组织空白间隙更大,损伤处可见细胞呈空泡样改变或细胞皱缩、体积减小,神经元数量减少,尼氏体模糊或消失。4.脊髓受损面积比结果表明,A组未见受损区域,比值为0,其余各组均高于A组,差异具有统计意义（P<0.05）;相对于B1和C1,B2和C2损伤面积比值明显升高,差异具有统计意义（P<0.05）;B1与B2、C1与C2损伤面积比值差异不具有统计意义（P>0.05）。5.各组脊髓前、后角神经元损伤程度比较通过分析前、后角神经元阳性细胞数结果显示,A组神经元数目多,尼氏体含量多,其余各组均少于A组,差异具有统计意义（P<0.05）;相对于B1和C1,B2和C2神经元阳性细胞数明显减少,差异具有统计意义（P<0.05）;B1与B2、C1与C2神经元阳性细胞数差异不具有统计意义（P>0.05）。第二部分:抵当汤加减调节AQP4表达对SCI大鼠脊髓水肿的作用研究1.各组脊髓组织的大体观察从大体观察上来看,Sham组脊髓组织颜色鲜白,组织完整,未见瘀血部位和水肿;Model组在打击损伤部位可见明显的瘀血区域,瘀血颜色深红,瘀血范围较大,并可见明显脊髓水肿;DDD组在打击损伤部位可见较小的瘀血区域,瘀血部位颜色淡红,可见轻度水肿;DDD组、TGN-020组以及DDD+TGN-020组大体观察相似,肉眼见无显着差异。2.各组脊髓组织含水率与Sham组相比,其余各组脊髓组织含水率均显着增高（P<0.05）;与Model组相比,DDD组、TGN-020组以及DDD+TGN-020组脊髓组织含水率均显着降低（P<0.05）;DDD组、TGN-020组以及DDD+TGN-020组组间比较,脊髓组织含水率没有显着差异（P>0.05）。3.行为学观察结果各组大鼠BBB评分、斜板实验结果以及Reuter评分显示,与Sham组相比,其余各组BBB评分和斜板实验得分均显着降低（P<0.05）,Reuter评分均显着升高（P<0.05）;与Model组相比,DDD组、TGN-020组以及DDD+TGN-020组BBB评分均显着升高（P<0.05）,Reuter评分均显着降低（P<0.05）;DDD组、TGN-020组以及DDD+TGN-020组组间比较无显着差异（P>0.05）。4.HE染色Sham组组织结构完整,神经元等细胞形态结构良好,未见瘢痕组织或空洞形成,未见瘀血区域或炎性物质渗出。Model组损伤部位可见组织结构离乱,大量瘢痕组织和脊髓空洞的形成,可见明显的瘀血区域,并伴有大量的炎性细胞浸润,神经元等细胞皱缩,数量减少。其余三组可见组织形态结构较完整,可见少量脊髓空洞的形成,瘀血区域范围较小,炎性细胞清润较少,神经元等细胞形态结构较完整。使用Image J软件对各组空洞面积进行定量分析,结果显示,与Sham组相比,Model组脊髓空洞面积显着增加（P<0.05）;与Model组相比,DDD组、TGN-020组、DDD+TGN-020组脊髓空洞面积显着降低（P<0.05）;DDD组、TGN-020组和DDD+TGN-020组脊髓空洞面积组间比较不具有显着差异（P>0.05）。5.尼氏染色观察各组神经元形态Sham组脊髓形态结构完整,灰质呈蝴蝶状,灰白质界限清晰,可见较多的神经元分布,神经元胞质内可见染色清晰的斑块状尼氏体,神经元胞体饱满,细胞核大,核仁明显。Model组脊髓组织破坏严重,结构不完整,灰、白质界限不清,可见大量的炎性细胞浸润,神经元皱缩、液化、坏死,形成较多的空泡,尼氏体较小或消失。相对Model组,DDD组、TGN-020组以及DDD+TGN-020组脊髓结构较完整,隐约可见灰白质界限,神经元仍可见,数量较多,空泡样改变减少,尼氏体数量较多、较饱满。但相对于Sham组,神经元仍存在固缩,胞浆减少,核变小,尼氏体减少等病理改变。6.免疫荧光检测各组AQP4、GFAP的阳性细胞表达量AQP4阳性细胞表达呈绿色,GFAP阳性细胞表达呈红色,DAPI染色呈深蓝色,AQP4+/GFAP+细胞表达呈黄色树枝状,各组染色背景干净,表达清晰,细胞核数量无显着差异（P>0.05）,具有可比性。Sham组少见或未见明显的AQP4+/GFAP+细胞,Model组可见较多的AQP4+/GFAP+细胞,且细胞亮度高,胞体肿胀程度严重。与模型组相比,DDD组、TGN-020组以及DDD+TGN-020组细胞数量较少,亮度较低,细胞肿胀程度减轻。对各组的AQP4+/GFAP+细胞进行计数和统计,与Sham组相比,其余各组AQP4与GFAP的阳性细胞占比均显着增高（P<0.05）;与Model组相比,DDD组、TGN-020组和DDD+TGN-020组AQP4与GFAP的阳性细胞占比显着降低（P<0.05）;DDD组、TGN-020组和DDD+TGN-020组间相比较,AQP4与GFAP的阳性细胞占比无显着差异（P>0.05）。7.Western Blot法检测各组AQP4、GFAP、PCNA、CSPG、NGF、BDNF、GAP-43的蛋白表达量各组蛋白条带背景清晰,无杂带现象,蛋白表达量趋势明显,具有可比性。与Sham组相比,各组脊髓组织中AQP4、GFAP、PCNA、CSPG蛋白的灰度值显着增高（P<0.05）,NGF、BDNF、GAP-43蛋白的灰度值显着降低（P<0.05）;与Model组相比,DDD组、TGN-020组和DDD+TGN-020组脊髓组织中AQP4、GFAP、PCNA、CSPG蛋白的灰度值显着降低（P<0.05）,NGF、BDNF、GAP-43蛋白的灰度值显着增高（P<0.05）;DDD组、TGN-020组和DDD+TGN-020组组间比较结果显示,各组脊髓组织中AQP4、GFAP、PCNA、CSPG、NGF、BDNF、GAP-43蛋白的灰度值差异不具有统计学意义（P>0.05）。8.各组脊髓组织中PCNA和CSPG基因表达量各组基因检测的扩增曲线变化平稳,溶解曲线为平滑的单峰形态,说明引物设计好,模板未见污染,实验结果具有可比性。各组目的基因相对表达量结果显示,与Sham组相比,各组脊髓组织中PCNA、CSPG基因的表达量显着增高（P<0.05）;与Model组相比,DDD组、TGN-020组和DDD+TGN-020组脊髓组织中PCNA、CSPG基因的表达量显着降低（P<0.05）;DDD组、TGN-020组和DDD+TGN-020组组间比较结果显示,各组脊髓组织中PCNA、CSPG基因的表达量差异不具有统计学意义（P>0.05）。9.透射电子显微镜观察髓鞘和神经元组织形态Sham组脊髓组织在透射电镜下可见髓鞘外形规则,厚薄均一,形似同心圆状,结构完整,未见破裂、缺失等改变,板层结构均匀致密,胞内线粒体丰富,胞浆饱满,清晰可见。Model组髓鞘结构不规则,部分髓鞘断裂缺失,厚薄不一,局部可见褶皱卷曲,板层结构松散、融合,线粒体肿胀,甚至部分溶解消失;DDD组、TGN-020组、DDD+TGN-020组可见髓鞘结构较完整,形态部分不规则但较Model组改善,部分髓鞘可见卷曲、厚薄不一,板层结构较均匀,虽有部分缺失,但松散程度相对Model组较轻,仍可见清晰的线粒体,但数量较Sham组少,胞体较小。10.电镜观察树突和树突棘形态各组脊髓经高尔基染色后结果显示:Sham组脊髓树突结构完整、形态规则、长度较长,树突上密布树突棘,树突棘分布整齐、均匀致密、数量较多;Model组脊髓树突形态不规则,部分断裂缺失,长度较短,较为纤细,树突棘数量少,稀疏分布,排列紊乱;与Model组相比,DDD组、TGN-020组、DDD+TGN-020组脊髓树突形态有所改善、树突较长、结构较完整、周经较粗,树突棘数量较多,排列更为规则、整齐。对各组脊髓树突长度及树突棘进行定量分析,结果显示,与Sham组相比,Model组树突长度明显降低（P<0.05）,树突棘数量明显减少（P<0.05）;与Model组相比,DDD组、TGN-020组、DDD+TGN-020组树突长度明显增加（P<0.05）,树突棘数量显着增多（P<0.05）;DDD组、TGN-020组、DDD+TGN-020组组间相比,差异不具有统计学意义（P>0.05）。第三部分:抵当汤加减含药血清对反应性星形胶质细胞的活化、迁移及神经生长相关细胞因子分泌的作用1.原代AS镜下观察原代细胞培养2d,镜下可见AS细胞呈不规则形状散在分布,部分细胞形似星形,细胞核大、呈椭圆形,细胞胞浆丰富,从胞体向四周发出长而有分支的突起;将原代细胞传代至第三代可见细胞生长状态良好,适宜进行后续实验。2.AS鉴定免疫荧光染色结果显示,GFAP染色呈阳性,阴性对照组未见任何阳性染色,提示GFAP呈特异性表达,所提取的细胞为AS。3.DDD含药血清对AS的安全干预浓度,以及干预RAS的最佳干预时间和最佳干预浓度DDD含药血清干预AS的安全浓度范围为:0-15%,DDD含药血清干预RAS最佳的干预浓度为10%,最佳干预时间为48h。4.DDD含药血清对RAS活性的影响MTT结果显示,与CG组相比,其余各组RAS活性均降低（P<0.05）;与MG相比,BSG组RAS活性无显着差异（P>0.05）,DDD、TGN-020和DDD+TGN-020组RAS活性均显着下降（P<0.05）;DDD、TGN-020和DDD+TGN-020组间比较无显着差异（P>0.05）。5.DDD含药血清对RAS迁移率的影响损伤24h后,各组RAS与对侧细胞完全分离,中间形成一条空白的划痕区域,划痕区未见或少见RAS;48h后部分细胞开始向对侧延伸突触,划痕区域出现部分肥大的RAS,细胞胞浆丰富,胞体呈球形,发亮,细胞加速分裂;72h后划痕区域缩小,部分RAS与对侧RAS突触交织,划痕开始愈合。在整个愈合过程中,24h各组划痕区域面积比无显着差异（P>0.05）;自48h开始,与MG组相比,BSG划痕区域面积比无显着差异,其余各组均明显较大（P<0.05）。DDD组、TGN-020组和DDD+TGN-020组组间比较无显着差异（P>0.05）。72h后,MG组与BSG组划痕区域面积比无显着差异（P>0.05）。与MG组相比,DDD组、TGN-020组和DDD+TGN-020组划痕区域面积比明显较大（P<0.05）,组间比较无显着差异（P>0.05）。以上划痕区域面积比的改变反映了RAS在损伤发生后向受损区域的迁移速率。6.各组对RAS中AQP4、GFAP荧光表达量的影响使用免疫荧光染色法对RAS中AQP4、GFAP和细胞核进行了标记。染色结果显示,AQP4+细胞呈绿色,GFAP+细胞呈红色,细胞核呈蓝色,荧光双标的细胞呈黄色的不规则树枝状。其中,CG组仅见12个零星分布的AQP4+/GFAP+细胞;MG组和BSG可见较多的AQP4+/GFAP+细胞,亮度较高,细胞肿胀程度严重;DDD组、TGN-020组、DDD+TGN-020组可见较少的AQP4+/GFAP+细胞,亮度较低,细胞肿胀程度较轻。对AQP4+/GFAP+细胞进行计数统计,结果表明,与CG相比,其他各组阳性细胞占比显着增多（P<0.05）;与MG相比,除BSG组无显着差异外（P>0.05）,DDD组、TGN-020组和DDD+TGN-020组阳性细胞占比显着减少（P<0.05）;DDD组、TGN-020组和DDD+TGN-020组阳性细胞占比组间相比无显着差异（P>0.05）。7.各组对RAS中AQP4、GFAP和NGF、BDNF、GAP-43蛋白表达量的影响结果显示,与CG组相比,其余各组AQP4和GFAP蛋白表达量均显着增高（P<0.05）,NGF、BDNF、GAP-43蛋白表达量均显着降低（P<0.05）;与MG组相比,除BSG组无明显差异外（P>0.05）,DDD组、TGN-020组和DDD+TGN-020组AQP4和GFAP蛋白表达量均显着降低（P<0.05）,NGF、BDNF、GAP-43蛋白表达量均显着增高（P<0.05）,3组组间比较无显着差异（P>0.05）。结论 1.自制简易脊髓打击器从20mm、40mm高处垂直撞击脊髓组织具有和NYU打击器从12.5mm、25mm处打击脊髓损伤程度相似的脊髓损伤动物模型,自制简易脊髓打击器安全性高,稳定性好,操作简便,价格低廉,可供科研工作者参考。2.通腑逐瘀法治则指导下抵当汤加减可有效消除SCI大鼠损伤处水肿,促进神经功能康复。其具体的作用机制为:通过抑制AQP4的表达可抑制反应性星形胶质细胞活化,减少胶质瘢痕形成,提高神经营养因子、神经生长因子及细胞膜生长相关蛋白的表达,促进神经功能康复。3.DDD含药血清能通过抑制AQP4的表达,有效减轻RAS水肿,减少RAS活化和减缓RAS迁移,促进RAS中神经营养因子的分泌。
刘晓云[3]（2021）在《3D打印技术构建干细胞仿生支架用于软骨及脊髓损伤修复的研究》文中研究表明3D打印技术以生物材料、细胞等生物活性分子为单元,能够精确、高效地构建复杂、个性化的仿生功能性支架。近些年来已经成为组织工程以及再生医学领域的研究热点。但是目前利用3D技术进行组织工程修复还存在一定局限性,例如生物材料缺乏良好的打印性、力学性能与天然组织器官不匹配以及诱导细胞发挥作用的生物功能有限等。针对目前软骨及脊髓损伤修复存在的难题,本博士论文利用3D打印技术通过构建个性化仿生三维支架来模拟不同组织的微环境,有效诱导干细胞的增殖与分化,从而在体内外环境下,研究其在软骨以及脊髓损伤修复中的潜在应用价值。本论文主要研究可分为三部分:1、为了构建生物功能、力学性能双重仿生支架用于关节软骨修复,通过3D打印技术构建聚己内酯（PCL）加固的具有微孔道结构的羟丁基壳聚糖-纳米短纤维（HBC-NF）复合水凝胶模拟关节软骨微环境以及力学强度,调控人间充质干细胞（hMSCs）存活和分化,从而实现对软骨组织损伤的修复。实验结果表明,HBC-NF具有良好的生物相容性,在体外培养环境下能够有效促进hMSCs的增殖。更重要的是,所制备的HBC-NF水凝胶内部拓扑结构可以促进细胞间的相互作用,增强软骨分化早期的“聚合作用”,从而显着提高hMSCs的软骨分化能力。与此同时,利用3D打印技术构建PCL网格骨架以及支架内部的微孔道,提高整个支架的力学性能以及物质交换能力。实验证明该复合支架具有与软骨相似的力学性能,同时能在体内很好地诱导软骨的形成,有望在未来实现对关节软骨的有效修复。2、脊髓损伤是一种严重的致残性损伤。利用生物3D打印技术,将生物材料与神经干细胞（NSCs）相结合,精确控制细胞的密度与分布,构建具有生物活性的支架,模仿天然脊髓的结构与功能,可以有效修复脊髓损伤。基于上一研究的发现,HBC具有良好的可打印性能,本研究利用HBC、透明质酸以及基质胶组合的新型生物墨水。该生物墨水可实现20 s快速成胶以及自动二次交联,从而实现“一步法”生物3D打印,构建NSCs脊髓仿生支架,从而解决目前NSCs生物3D打印中打印过程繁琐、细胞存活率低、细胞-支架相互作用弱等问题。实验表明,打印后的NSCs存活率高（>95%）,优化的支架微环境能够加强细胞-支架相互作用,诱导NSCs向神经元分化,形成神经网络。利用生物3D打印技术构建脊髓样支架,移植到全横断脊髓损伤大鼠模型中,在脊髓损伤处实现神经元再生,降低胶质瘢痕沉积,从而明显改善了大鼠的后肢运动能力。该工作有望用于脊髓损伤以及神经相关疾病的治疗和再生修复。3、在NSCs生物3D打印仿生支架的基础上,第三部分的研究进一步探究药物小分子对NSCs分化的作用,通过构建功能性神经支架,负载并缓释诱导小分子更好地促进NSCs的神经元分化。本章研究首次探讨了 N-乙酰氨基葡萄糖转移酶抑制剂OSMI-4小分子对NSCs分化的影响及其分子机制。实验结果表明,OSMI-4能够通过抑制NSCs的Notch通路,促进细胞向神经元分化。利用甲基丙烯酰化明胶与丙烯酰环糊精构建超分子水凝胶,制备可生物3D打印的生物墨水,该墨水具有良好可打印性,打印后的支架能够提高细胞-支架相互作用,有利于NSCs在支架内部的粘附以及增殖。更重要的是该水凝胶能够负载并缓释疏水性OSMI-4小分子,诱导NSCs向神经元分化。动物实验表明,该功能支架能够促进脊髓损伤处神经元再生以及轴突生长,从而明显改善脊髓损伤大鼠的后肢运动能力,为脊髓损伤治疗提供新的治疗策略。
王文丽[4]（2021）在《完全性胸段脊髓损伤后大脑静息态fMRI和EEG研究》文中指出第一部分 完全性胸段脊髓损伤后大脑MRI研究[目的]从大脑结构、功能、网络不同层面研究完全性胸段脊髓损伤后大脑改变,探究灰质体积（GMV）和皮层形态的改变,以及结构协方差网络（SCNs）的拓扑属性差异,研究GMV变化和临床变量之间的关系,通过局部一致性（ReHo）和低频振幅（ALFF）探讨静息状态下大脑功能网络的差异,以更全面地认识完全性胸段脊髓损伤后大脑重塑改变,为这类患者制定更准确和具体的康复训练策略提供理论基础。[方法]24例完全性胸段脊髓损伤患者和26例健康对照者,利用基于灰质的形态学测量法（VBM）和基于皮层的形态学测量法（SBM）分析大脑形态学变化,并采用基于GMV和皮层形态的SCNs图论网络分析方法来研究病程在1年内的完全性胸段脊髓损伤患者的SCNs的变化,采用偏相关分析来探讨GMV变化与临床变量之间的关系,通过比较完全性胸段脊髓损伤患者和健康对照者的ReHo和ALFF值,探究静息状态下神经元自发活动的差异。[结果]①与健康对照组相比,完全性胸段脊髓损伤患者左侧中额叶皮层、右上眶额叶皮层和左下眶额叶皮层GMV下降（FWE校正,体素水平p<0.05）。②SBM分析,患者组较健康对照组在眶额叶外侧和脑岛区域折叠系数降低,额上回区域沟深减少,中额叶前部、颞上回、额下回岛盖部、额下回三角部区域皮层厚度明显降低（P<0.001,团块水平FWE校正）。③基于灰质体积结构共变网络分析,患者组右侧前扣带皮层（ACC）和左下眶上额皮质（OFC）的中介中心性（BC）明显增高,双侧中OFCs节点度和节点效率明显增高。患者组右侧壳核BC明显低于健康对照组。④基于皮层厚度结构共变网络分析,患者组左侧三角部和左内嗅皮层的BC明显增高,而左侧中央前回的BC低于健康对照组;患者组双侧楔状叶的节点度和节点效率明显降低;右侧顶上皮层的节点度明显低于健康对照组。⑤偏相关分析仅显示患者组右侧中额叶皮层的GMV与自评抑郁量表（SDS）评分呈负相关（r=-0.503,p=0.017）。⑥与健康对照组相比,患者组右中央后回、右小脑、右梭状回的ReHo明显增高（p=0.001,cluster=10）。⑦双侧小脑ALFF增高（p=0.05,cluster=80）。[结论]①完全性胸段脊髓损伤后GMV减少主要涉及心理认知相关脑区,而非感觉运动脑区,心理认知脑区信息传递效率提高,神经心理治疗应被考虑到康复治疗的早期阶段,以防止不可逆的心理认知脑区的结构变化。②完全性胸段脊髓损伤后,初级运动皮层以及视觉相关的脑区的信息传递效率降低,而与运动控制相关的脑区信息传递效率增加,主要涉及到运动观察和运动模仿,为康复训练方案的选择提供参考。③完全性胸段脊髓损伤后大脑自发神经元活动发生了变化,主要涉及躯体感觉运动相关脑区。第二部分 完全性胸段脊髓损伤后大脑静息态EEG研究[目的]探讨完全性胸段脊髓损伤患者静息态脑电（EEG）,包括脑电波的活动特征及脑电波的相干性（Coherence）,探寻完全性胸段脊髓损伤后大脑神经电生理的变化。[方法]本研究按照入选标准招募了 27例完全性胸段脊髓损伤患者和26例健康对照者,利用功率谱和相干性分析完全性胸段脊髓损伤患者大脑自发脑电的频域特征。[结果]①与健康对照组比较,完全性胸段脊髓损伤患者的Delta、Theta、Alphal频段的功率谱显着高于健康对照组,其余频段的脑电波与健康对照组相比无显着差异。②患者组的注意指数（TBR）（p=0.484）显着高于健康对照组。③与健康对照组的脑电相干分析比较,闭眼状态下,患者组在Theta、Alpha1、Alpha2频段各电极对的相干系数低于健康对照组,睁眼状态下各脑电波的电极对相干系数无显着差异。[结论]完全性胸段脊髓损伤后静息态Delta、Theta、Alpha频段功率谱发生了改变,这些改变可能与患者的抑郁、情绪、认知相关,而这类患者的注意力障碍可能是被忽略的方面。完全性胸段脊髓损伤后大脑相干值的变化可能是损伤后出现工作记忆及注意力、任务执行能力下降的可能原因。第三部分 完全性胸段脊髓损伤康复治疗后的纵向fMRI及EEG研究[目的]经过3个月的康复训练后,采用功能磁共振成像（fMRI）及脑电（EEG）研究完全性胸段脊髓损伤患者大脑结构和功能发生的改变。[方法]本研究共招募8例完全性胸段脊髓损伤工伤患者。利用VBM、SBM方法,以及基于GMV和皮层形态的SCNs图论网络分析研究完全性胸段脊髓损伤患者经过3个月的康复训练后大脑的结构和网络的变化;通过ReHo和ALFF分析,探究康复训练后完全性胸段脊髓损伤患者静息状态下神经元的自发活动变化。通过静息状态下EEG功率谱和相干值的分析研究康复训练后的神经电生理改变。[结果]①经过康复训练后患者的体空间GMV较训练前显着增加,中央后回、中央前回、扣带回、海马旁回的皮层厚度较康复训练前增加;②拓扑结构网络分析发现全局属性在康复训练前后无显着性差异,基于GMV的结构共变网络分析发现训练后颞下回的节点度增加和杏仁核、梭状回的BC增高,而基于SBM的结构共变网络分析发现眶额叶、颞上回的节点度增加;③静息态核磁共振中ReHo和ALFF较训练前减低。④脑电分析发现3个月的康复训练后,部分完全性胸段脊髓损伤患者的Delta、Theta、Alpha、Beta频段的功率较3个月前有变化,主要在额区、顶区、枕区;大部分脑区之间相干性增高。[结论]完全性胸段脊髓损伤后进行3个月的康复训练后,大脑结构及功能都发生了变化,这种变化除了涉及感觉运动功能相关的脑区,还涉及到与情绪行为、认知、视觉等非运动感觉区域的脑区,这些结果提示我们在以后的康复训练中在关注感觉运动功能恢复的同时,情绪行为及认知方面也需要被关注。
李芳[5]（2021）在《ADSCs通过调控神经细胞TGF-β1/Smad/PLOD2信号通路修复脊髓损伤的机制研究》文中指出研究背景脊髓损伤（Spinal Cord Injury,SCI）是指由于外界直接或间接因素导致的中枢神经系统疾病,受累神经细胞的结构和功能受损,最终导致损伤部位以下运动功能和感觉的缺失,严重影响患者生活质量,降低患者生命预期,给家庭和社会带来沉重的负担。由于神经细胞的再生能力较低,损伤后微环境改变等不良因素,脊髓损伤治疗预后较差,使脊髓损伤的治疗成为了世界性的医学难题。传统的脊髓损伤治疗方法手术减压、药物对症治疗及术后康复治疗,不能促进神经细胞和轴突的再生,没有从根本上恢复神经功能,因此需要联用新的有效治疗方法共同作用。随着近几年分子生物学和细胞生物学研究的巨大进步,细胞移植作为脊髓损伤的一种新型治疗手段受到了广泛关注和研究,间充质干细胞（mesenchymal stromal cells,MSCs）由于其低免疫原性,体外容易培养,能分泌大量生物活性分子,成为研究的热点。体内外实验表明,脂肪来源的间充质干细胞（adipose tissue-derived stromal cells,ADSCs）移植在治疗脊髓损伤中具有良好的应用前景。在脊髓损伤动物模型中,与骨髓间充质干细胞相比,脂肪来源的间充质干细胞体内移植到脊髓损伤部位时具有更高的存活率。也有研究表明,ADSCs可以通过分泌细胞因子和生长因子,促进轴突再生,减少炎症细胞的浸润和空洞形成,从而促进脊髓损伤的恢复。尽管已有研究证明ADSCs在治疗脊髓损伤中的作用,但ADSCs促进脊髓损伤修复的具体机制尚不完全清楚。Torres-Espin等研究发现,大鼠脊髓损伤后MSCs体内移植可促进前胶原赖氨酸-2-酮戊二酸 5-双加氧酶 2（procollagen-lysine,2-oxoglutarate 5-dioxygenase 2,PLOD2）表达,PLOD2可能通过促进胶原纤维的交联和细胞外基质重塑起到组织修复的作用。越来越多的研究表明,在肿瘤的侵袭和迁移过程中,HIF-1α、TGF-β1 和 microRNA-26a/b 等分子通过 PI3K-AKT、TGF-β/Smad 信号通路,调控PLOD2的表达。但是PLOD2在治疗脊髓损伤中发挥的作用,目前还未见文献报道。ADSCs可以通过分泌多种细胞因子促进脊髓损伤的修复,TGF-β1作为ADSCs分泌的重要因子,具有抗炎、修复和神经保护功能。ADSCs能否通过分泌TGF-β1,上调PLOD2的表达,进而促进脊髓损伤的恢复,成为本研究的重点。本研究分为三个部分,第一部分:ADSCs体外共培养对损伤神经细胞的修复作用,第二部分:ADSCs通过调控神经细胞TGF-β1/Smad3/PLOD2信号通路促进损伤神经细胞的修复,第三部分:ADSCs通过激活神经细胞TGF-β1/Smad3/PLOD2信号通路促进脊髓损伤大鼠功能恢复。第一部分ADSCs体外共培养对损伤神经细胞的修复作用研究目的1.从人脂肪组织中分离培养间充质干细胞,通过成脂成骨分化能力和细胞表面标志的表达对其进行鉴定。2.培养PC12细胞和大鼠皮质神经元原代细胞,体外建立神经细胞机械损伤模型。3.体外建立ADSCs和损伤神经细胞共培养体系,通过相关检测,明确ADSCs对损伤神经细胞的修复作用,以及PLOD2在ADSCs治疗神经损伤中的表达变化。研究方法1.ADSCs的分离培养及鉴定间充质干细胞从健康志愿者脂肪组织培养获得。P3-P5代的细胞用于后续实验。ADSCs经成脂成骨诱导分化后,Oil Red O染色,观察成脂诱导分化情况,Alizarin Red S和Von Kossa染色,观察成骨诱导分化情况。流式细胞仪检测细胞表面抗原的表达情况。2.神经细胞机械损伤模型制备（mechanical injury,MI）150ng/mLNGF诱导PC12细胞向神经细胞分化,MAP2染色鉴定。取Wistar新生鼠大脑皮质,分离培养原代神经细胞,NeuN染色鉴定。使用10ul枪尖于6孔板内“井”字划割,造成神经元机械性损伤。3.ADSCs共培养对损伤神经细胞的影响ADSCs接种Transwell上室,每孔接种3×105细胞,接种24h后与机械损伤的PC12细胞或大鼠皮质神经元共培养3天,EdU实验检测ADSCs对神经细胞的促增殖情况。微板试剂盒检测细胞培养上清中LDH表达变化,qRT-PCR和western blot检测PLOD2和神经相关分子MAP2、NSE、GAP43和GFAP的表达。研究结果1.ADSCs的分离培养及鉴定镜下观察从脂肪组织中分离出的细胞,呈典型的成纤维样梭形细胞;经成脂和成骨诱导培养基诱导分化后,Oil Red O染色成阳性,表明ADSCs具有成脂分化的能力,Alizarin Red S和Von Kossa染色成阳性,表明ADSCs具有成骨分化的能力;流式细胞仪检测其表面抗原的表达,结果显示ADSCs高表达CD13、CD44、CD73、CD90 和 CD105,低表达 HLA-DR、CD34 和 CD45。2.神经细胞的培养及鉴定PC12细胞经150ng/mL NGF诱导分化5-7天后,有神经突起长出,细胞形态类似于神经细胞,MAP2染色结果阳性。大鼠皮质神经元体外培养6-8天,细胞体较小,从胞体延伸出轴突和树突,轴突细长,NeuN染色结果阳性。3.ADSCs共培养促进损伤神经细胞的修复ADSCs与损伤神经细胞共培养三天,结果显示神经细胞伤口愈合率显着升高;EdU结果显示,ADSCs共培养能促进大鼠皮质神经元的增殖;LDH检测结果显示,ADSCs共培养可以抑制神经细胞LDH的释放;qRT-PCR和western blot结果显示,ADSCs共培养可以促进PLOD2和神经细胞相关分子MAP2、NSE和GAP43的表达,降低GFAP表达。研究结论1.我们成功地从脂肪组织中分离出间充质干细胞。2.ADSCs共培养可以提高损伤神经细胞伤口愈合率,促进大鼠皮质神经元的增殖。ADSCs共培养可以促进损伤神经细胞神经相关分子MAP2、NSE和GAP43的表达,降低GFAP表达。提示ADSCs可能通过提高神经元的存活率,促进神经细胞生长和轴突再生,减少胶质瘢痕的形成而促进损伤神经细胞的恢复。3.神经细胞机械损伤以后,PLOD2表达降低,ADSCs共培养可以促进损伤神经细胞PLOD2的表达。第二部分ADSCs通过调控神经细胞TGF-β1/Smad3/PLOD2信号通路促进损伤神经细胞的修复研究目的1.通过米诺地尔抑制神经细胞PLOD2的表达,检测抑制PLOD2表达对ADSCs神经修复作用的影响。2.ELISA检测共培养体系中TGF-β1的表达情况,同时使用外源性TGF-β1作用于损伤的神经细胞,明确TGF-β1的神经修复作用。3.SB431542 抑制 TGF-β1/Smad 信号通路,LY294002 抑制 PI3K/AKT 信号通路,明确PLOD2具体的信号调控通路。研究方法1.米诺地尔抑制神经细胞PLOD2的表达,检测PLOD2下调对ADSCs神经修复作用的影响不同浓度米诺地尔（0.25mM,0.5mM,1.0mM）作用于PC12细胞,筛选米诺地尔抑制PLOD2表达的最佳作用浓度。在ADSCs与神经细胞共培养体系中加入米诺地尔,免疫细胞化学技术、EdU实验和LDH释放实验检测抑制PLOD2基因表达对ADSCs神经保护作用的影响,qRT-PCR和western blot检测PLOD2以及神经相关分子MAP2、NSE、GAP43和GFAP的表达变化。2.TGF-β1对受损神经细胞的修复作用ELISA检测损伤神经细胞及ADSCs共培养上清中TGF-β1的表达。外源性TGF-β1（浓度分别为 0.31,0.62,1.25,2.5,5.0,10,20 ng/mL）作用于划痕损伤的 PC12 细胞,qRT-PCR 和 western blot 检测 PLOD2、P-AKT、AKT、P-Smad3和Smad2/3的表达变化。3.抑制TGF-β1/Smad、PI3K/AKT信号通路,对PLOD2表达的调控ADSCs与损伤神经细胞共培养体系中加入SB431542,抑制TGF-β1/Smad信号通路。PC12细胞经NGF诱导分化后,加入LY294002抑制PI3K/AKT信号通路。ELISA检测上清中TGF-β1的表达变化,qRT-PCR和western blot检测PLOD2、TGF-β1、P-Smad3、Smad2/3、P-AKT、AKT 和神经相关分子 MAP2、NSE、GAP43、GFAP的表达变化。研究结果1.抑制PLOD2的基因表达,体外实验结果显示ADSCs的神经细胞修复作用减弱根据qRT-PCR及western blot结果,我们最终确定米诺地尔实验浓度为0.5mM。在共培养体系中,MAP2的免疫荧光染色结果显示,抑制PLOD2表达,ADSCs的神经修复作用减弱。EdU结果显示,米诺地尔可以降低ADSCs对大鼠皮质神经元增殖的刺激作用。LDH释放实验表明,米诺地尔可增加共培养体系中LDH含量。qRT-PCR和western blot实验进一步证实,米诺地尔可以抑制神经细胞PLOD2、MAP2、NSE和GAP43的表达,促进GFAP表达。2.TGF-β1在修复神经细胞损伤中的作用ELISA检测结果显示,ADSCs共培养可以提高损伤神经细胞培养上清中TGF-β1含量。qRT-PCR和western blot检测结果显示,外源性TGF-β1作用于划痕损伤的PC12细胞,低浓度TGF-β1（0.31-2.5 ng/mL）促进PLOD2的表达,当TGF-β1浓度达到5 ng/mL时这一作用减弱,当TGF-β1浓度为10和20 ng/mL时则抑制PLOD2表达。Western blot检测结果显示,低浓度TGF-β1抑制P-AKT的表达,促进P-Smad3的表达,而高浓度TGF-β1则相反。3.TGF-β1/Smad信号通路在ADSCs促进损伤神经细胞修复中的作用共培养体系中加入SB431542可以降低共培养上清中TGF-β1的含量,抑制神经细胞TGF-β1、P-Smad3和PLOD2的表达,降低神经相关分子MAP2、NSE、GAP43的表达,提高GFAP表达水平。加入LY294002抑制P-AKT表达后,PLOD2表达下降。上述结果进一步证实了 AKT信号通路可以调控PLOD2的表达,但是当低浓度TGF-β1存在时,PLOD2主要受TGF-β1/Smad信号通路调控。研究结论1.米诺地尔抑制神经细胞PLOD2基因表达后,ADSCs的神经细胞修复作用减弱,提示PLOD2在ADSCs修复神经细胞损伤中发挥重要作用。2.ADSCs共培养可以增加细胞培养上清中TGF-β1的含量,低浓度TGF-β1抑制P-AKT的表达,促进P-Smad3和PLOD2的表达,而高浓度TGF-β1则相反。3.体外实验显示SB431542抑制TGF-β1/Smad信号通路后,降低ADSCs神经修复作用及PLOD2表达。ADSCs通过分泌低剂量TGF-β1,激活Smad3信号通路促进PLOD2表达,发挥神经修复作用。第三部分ADSCs通过激活神经细胞TGF-β1/Smad3/PLOD2信号通路促进脊髓损伤大鼠功能恢复研究目的1.建立脊髓损伤动物模型,体内实验验证ADSCs输注对脊髓损伤动物模型的治疗作用。2.大鼠体内输注SB431542,验证ADSCs通过激活神经细胞TGF-β1/Smad/PLOD2信号通路促进脊髓损伤功能恢复的作用。研究方法1.大鼠脊髓损伤模型制备大鼠腹腔麻醉后,以大鼠T8-T10棘突为中心取后正中切口切开,剥离并咬除棘突、椎板暴露脊髓,血管夹夹击脊髓30s,建立脊髓损伤模型。2.实验分组脊髓损伤模型制备成功3天后,大鼠分别给予PBS、ADSCs和SB431542原位注射。实验具体分为5组:假手术组,PBS对照组,ADSCs治疗组,ADSCs治疗+SB431542 组,SB431542 组。3.ADSCs输注对脊髓损伤的治疗作用在治疗后 3、7、14、21、28 天根据 BBB（Basso,Beattie,and Bresnahan）量化评分标准对所有动物运动功能进行评定。大鼠心脏取血,离心收集血清,ELISA检测血清中TGF-β1的含量。移植后3天随机取各组动物,取出脊髓组织,4%多聚甲醛固定,制作石蜡和冰冻切片,进行HE染色,尼氏染色,免疫组织化学染色检测脊髓组织中MAP2的表达。取出治疗3天后的脊髓组织,提取总RNA和总蛋白。qRT-PCR和western blot检测神经细胞相关分子（MAP2、NSE、GAP43和 GFAP）和 PLOD2、TGF-β1、P-Smad3 和 Smad2/3 的表达变化。研究结果1.ADSCs移植可以促进脊髓损伤大鼠功能恢复ADSCs移植可以促进大鼠运动功能的恢复,减少脊髓病变体积及空泡的形成,增加尼氏小体数量,促进脊髓神经细胞神经相关分子MAP2、NSE和GAP43表达,抑制GFAP表达。2.ADSCs通过激活神经细胞TGF-β1/Smad3/PLOD2信号通路促进脊髓损伤大鼠功能恢复ADSCs移植可以显着提高大鼠血清中TGF-β1的含量,促进脊髓神经细胞PLOD2、TGF-β1、P-Smad3的基因和蛋白表达。抑制剂SB431542输注明显抑制ADSCs对大鼠运动功能的恢复作用,脊髓组织结构损伤加重,神经细胞PLOD2、TGF-β1、P-Smad3 和神经相关分子（MAP2、NSE、GAP43）表达降低,GFAP表达增加,ADSCs的神经修复作用减弱。研究结论1.脊髓损伤动物实验研究结果显示,ADSCs移植可以促进脊髓损伤大鼠运动功能的恢复,同时也能促进神经元的存活,促进损伤结构的恢复。2.体内实验表明,ADSCs的治疗作用会被SB431542抑制。体内实验进一步证实ADSCs通过激活TGF-β1/Smad3信号通路促进神经细胞PLOD2表达,从而促进脊髓损伤的修复。
赵浩森[6]（2021）在《白藜芦醇/骨髓间充质干细胞联合治疗大鼠脊髓损伤的作用与机制研究》文中认为脊髓损伤是一种严重的中枢神经系统创伤,因为其高致残性,多数患者在脊髓损伤后丧失运动及自理能力,常常给患者家庭及社会带来严重的负担。脊髓损伤后随着脊髓微环境变化而引发一系列病理生理变化所致使的继发性损伤脊髓损伤常常引起“瀑布”样效应,造成灾难性后果,给脊髓损伤的治疗带来困难和障碍。干细胞因为其多种生理学特性,例如可增殖性、多向分化性、自我更新性等,是近年来脊髓损伤治疗的研究热点,其中骨髓间充质干细胞因其容易获得性及免疫学特性和伦理合理性更是被广泛用于研究。然而脊髓损伤后局部微环境中的病理生理反应例如炎症、凋亡、氧化应激等,常常造成干细胞移植存活率的下降,最终导致神经保护功能的减退,造成脊髓损伤治疗效果不佳。白藜芦醇因为“法国悖论”的发现,其卓越的抗炎、抗衰老、抗氧化应激等功效被广泛地研究,其中白藜芦醇被证实能够上调Sirt-1信号通路与其所产生的的相关功效有关联。NF-κB是激活炎症的重要信号通路中的一员,而Sirt-1作为NF-κB上游通路,Sirt-1与脊髓损伤后炎症变化及白藜芦醇能否对炎症环境的骨髓间充质干细胞起到保护作用及其作用机制尚无相关研究,白藜芦醇能否与骨髓间充质干细胞联合治疗提升脊髓损伤治疗效果也无相关研究。因此本研究将通过以下三部分进行研究验证白藜芦醇与骨髓间充质干细胞联合治疗大鼠脊髓损伤的作用与机制:1.大鼠脊髓损伤后Sirt-1表达的变化及其与脊髓损伤后炎症反应变化之间的关系2.体外培养原代大鼠骨髓间充质干细胞,制作炎症模型,探究证实白藜芦醇对大鼠骨髓间充质细胞炎症模型中的作用及作用机制3.通过大鼠脊髓损伤模型来验证评估白藜芦醇/骨髓间充质干细胞联合治疗脊髓损伤的作用及机制。目的:通过探究脊髓损伤后Sirt-1信号通路与炎症的变化、骨髓间充质干细胞在炎症环境中反应机制、白藜芦醇对骨髓间充质干细胞炎症模型的作用及作用机理、脊髓损伤后白藜芦醇和骨髓间充质干细胞联合移植治疗的作用及作用机制等问题进行了探究分析,为指导白藜芦醇与骨髓间充质干细胞移植在脊髓损伤临床中的应用提供理论基础与实验学依据,为脊髓损伤的治疗提供新方法和新思路。研究方法:第一部分:将6-8周龄重约200-220 g雌性健康SD大鼠随机分为Sham组（假手术组）和脊髓损伤组,其中脊髓损伤组按照脊髓损伤后时间设定,细分为脊髓损伤后1 d、3 d、5 d、7 d、14 d,5个亚组,参照Allen’s法制作大鼠脊髓损伤打击模型,其中Sham组仅咬除相应椎体椎板,不进行打击操作。运用Western Blot方法检测各组脊髓组织之间Sirt-1蛋白表达变化。运用Elisa法检测各组脊髓组织中炎症因子IL-1β和IL-6表达的变化。运用免疫荧光染色法检测Sham组和脊髓损伤3d组中Sirt-1和TNF-α在脊髓组织中表达的变化。第二部分:利用大鼠乳鼠体外培养骨髓间充质干细胞并于光学显微镜下观察细胞生长形态。运用流式细胞术对原代细胞表面CD34/CD45/CD29/CD90抗原表达情况进行检验验证。运用MTT检测验证TNF-α（20 ng/m L）诱导骨髓间充质干细胞炎症模型中细胞存活率随时间变化的变化趋势,选取适宜诱导时常。运用MTT检测检验TNF-α（20 ng/m L）诱导骨髓间充质干细胞炎症模型中,不同浓度白藜芦醇干预对细胞存活率的影响,选取适宜白藜芦醇浓度。将骨髓间充质干细胞随机分为三组:Control组、TNF-α组、TNF-α+白藜芦醇组,运用Elisa法检测各组细胞上清液中炎症因子IL-1β和IL-6表达的变化。运用Western Blot检验三组中Sirt-1和NF-κB蛋白表达的变化。运用Western Blot检验三组中凋亡标志性蛋白Cleaved Caspase-3和Caspase-9表达的变化。再将骨髓间充质干细胞随机分为二组:TNF-α+白藜芦醇组、TNF-α+白藜芦醇+EX527组,运用Real-Time PCR检验两组中Sirt-1和NF-κB基因表达的变化。运用Elisa法检验两组中IL-1β和IL-6表达的变化。运用流式细胞术（Annexin V-FITC-PI）检验两组组中细胞凋亡的变化。第三部分:将6-8周龄重约200-220 g雌性健康SD大鼠随机分为Sham组、脊髓损伤组、脊髓损伤+骨髓间充质干细胞移植组、脊髓损伤+骨髓间充质干细胞+白藜芦醇移植组共四组,参照Allen’s法制作大鼠脊髓损伤打击模型,其中Sham组仅咬除相应椎体椎板,不进行打击操作。运用BBB评分检测四组大鼠随时间变化运动功能变化情况。运用Nissl染色检测各组脊髓前角神经元数量的变化。运用Western Blot检测各组脊髓组织中Sirt-1/NF-κB及炎症因子IL-1β/IL-6蛋白表达的变化和凋亡相关蛋白Cleaved Caspase-3/Caspase-9表达的变化。运用荧光显微镜检测脊髓损伤+骨髓间充质干细胞移植组、脊髓损伤+骨髓间充质干细胞+白藜芦醇移植组脊髓组织中的PKH26和Neu N阳性细胞比率的差异。运用Elisa法检测四组各组脊髓组织中BDNF含量的变化。结果:第一部分:Western Blot检测结果显示随着脊髓损伤后时间变化,Sirt-1的表达也随之变化,脊髓损伤后1天其表达即比假手术组明显增高,约3天时Sirt-1的表达达到最高,随之出现逐渐下降并趋于稳定。Elisa检测结果显炎症因子（IL-1β、IL-6）表达也随着脊髓损伤后时间变化而变化,脊髓损伤后1天其表达即比假手术组明显增高,约3天时炎症因子的表达达到最高,随之出现逐渐下降并趋于稳定。Sham组和SCI 3 d组免疫荧光双染结果可见,损伤后脊髓组织中Sirt-1和TNF-α表达均上调。第二部分:光学显微镜下观察原代提取培养的大鼠骨髓间充质干细胞体外培养增殖3天形态呈长梭形或多角形,呈现纤维细胞样集落生长趋势。流式细胞术检测结果证实所培养细胞具有CD34（-）CD45（-）CD29（+）CD90（+）的表面抗原特性,证实培养的原代骨髓间充质干细胞具有干细胞表型。MTT检测结果可见,随着炎症诱导时间延长,骨髓间充质干细胞细胞存活率呈现逐渐下降趋势,炎症环境可影响骨髓间充质干细胞的存活。其中在12 h与Control组存在统计学意义,时间继续增加,细胞存活率降低趋势逐渐变缓。不同浓度白藜芦醇干预骨髓间充质干细胞炎症模型,细胞生存率变化不同。细胞生存率在1μmmol/L诱导组比炎症组明显提高。Elisa检验结果可见,炎症刺激后,BMSC的炎症因子的表达比Control组明显提升;而白藜芦醇干预组和炎症模型组相比,炎症因子均显着下降。Western Blot检验结果可见,炎症刺激后骨髓间充质干细胞的Sirt-1和NF-κB的表达比Control组提升;而TNF-α+白藜芦醇组和TNF-α组相比,Sirt-1表达显着提升,而相应的NF-κB表达显着下降;炎症刺激后,骨髓间充质干细胞凋亡标志性蛋白Cleaved Caspase-3/Caspase-9的表达比Control组提升;而TNF-α+白藜芦醇组和TNF-α组相比,凋亡蛋白的表达显着下降。Real-Time PCR结果可见,TNF-α+白藜芦醇+EX527组与TNF-α+白藜芦醇组相比,Sirt-1表达明显降低,而相应的,NF-κB表达明显增高。Elisa检验结果可见,TNF-α+白藜芦醇+EX527组与TNF-α+白藜芦醇组相比,炎症因子的表达明显增加。流式细胞术（Annexin V-FITC-PI）检验结果可见,TNF-α+白藜芦醇+EX527组与TNF-α+白藜芦醇组相比,细胞凋亡明显增加。第三部分:BBB评分结果证实,脊髓损伤后,大鼠出现明显运动功能障碍;移植和骨髓间充质干细胞+白藜芦醇联合移植治疗,均表现出对大鼠运动功能的恢复促进作用;其中骨髓间充质干细胞+白藜芦醇联合移植组BBB评分高于单纯骨髓间充质干细胞移植组。Nissl染色检测结果证实,脊髓损伤后,大鼠脊髓前角神经元数量比假手术组明显下降;骨髓间充质干细胞移植和骨髓间充质干细胞+白藜芦醇联合移植治疗,均提升了脊髓前角神经元数量;其中骨髓间充质干细胞+白藜芦醇联合移植组前角神经元计数平均值高于单纯骨髓间充质干细胞移植组,但两组之间并无明显统计学差异。Western Blot检测结果证实,脊髓损伤后,Sirt-1、NF-κB和炎症因子表达均比Sham组明显增高;骨髓间充质干细胞移植组中与SCI组相比,相应的指标变化无明显统计学差异;而白藜芦醇+骨髓间充质干细胞联合移植与SCI组和骨髓间充质干细胞移植组相比,Sirt-1表达明显增高,相应的NF-κB和炎症因子均明显降低。与此同时,脊髓损伤后,凋亡蛋白Cleaved Caspase-3/Caspase-9表达均比Sham组明显增高;骨髓间充质干细胞移植组中与SCI组相比,相应的指标变化无明显统计学差异;而白藜芦醇+骨髓间充质干细胞联合移植与SCI组和骨髓间充质干细胞移植组相比,凋亡蛋白表达明显降低。荧光显微镜检测结果证实,脊髓损伤后,白藜芦醇+骨髓间充质干细胞联合移植与骨髓间充质干细胞移植组相比,PKH26阳性比率和Neu N阳性比率明显增高。Elisa检测结果证实,脊髓损伤后骨髓间充质干细胞移植组和白藜芦醇+骨髓间充质干细胞联合移植组均能显着上调BDNF的表达,而白藜芦醇+骨髓间充质干细胞联合移植与骨髓间充质干细胞移植组相比BDNF表达的均值稍高,但两者间并无明显统计学差异。结论:第一部分:脊髓损伤后Sirt-1的表达随时间变化,和炎症因子表达的变化趋势呈现一致性。而且脊髓损伤后Sirt-1和炎症因子表达变化相关,Sirt-1可能参与脊髓损伤后炎症反应。第二部分:炎症环境可影响骨髓间充质干细胞的存活。适当浓度的白藜芦醇可增加骨髓间充质干细胞在炎症环境中的细胞存活率,起保护作用。白藜芦醇可通过上调Sirt-1的表达,抑制NF-κB,抑制炎症反应,减少骨髓间充质干细胞炎症环境中的细胞凋亡,实现对骨髓间充质干细胞在炎症环境中的保护作用。第三部分:脊髓损伤后白藜芦醇和骨髓间充质干细胞联合移植对大鼠脊髓损伤后运动功能恢复作用优于单纯骨髓间充质干细胞移植。白藜芦醇和骨髓间充质干细胞联合移植可以通过上调Sirt-1表达,抑制NF-κB表达和炎症反应,从而抑制脊髓组织细胞凋亡;而骨髓间充质干细胞移植并无明显此作用。白藜芦醇和骨髓间充质干细胞联合移植能增加骨髓间充质干细胞移植后的存活,能增加脊髓中神经元数量。骨髓间充质干细胞移植或白藜芦醇和骨髓间充质干细胞联合移植均能显着增加BDNF表达量。
岳倩文[7]（2021）在《烙灸对脊髓损伤大鼠内源性神经干细胞相关因子影响》文中指出目的通过脊髓损伤模型研究烙灸对脊髓损伤大鼠运动及感觉功能,损伤局部微环境及内源性神经干细胞相关因子的影响。方法采用自制Allen’s打击器制备SCI模型。实验大鼠分为假手术组（A组）、单纯损伤组（B组）、西药地塞米松组（C组）、烙灸治疗组（D组）,每组10只分别在第7d、14d、28d、42d、56d采用BBB评分、Reuter评分法判断损伤后大鼠肢体功能恢复情况。各组剩余大鼠分别在第7d、14d、28d取损伤段脊髓组织,用于电镜观察脊髓损伤后超微结构,Western blot蛋白检测及实时荧光定量PCR检测。结果（1）BBB评分、Reuter评分表明D组大鼠烙灸后肢运动状态,肢体感觉优于B组、C组大鼠（P<0.05）,疗效明显。（2）电镜观察脊髓超微结构变化,结果显示B组、C组及D组在脊髓损伤后均出现神经元细胞出现肿胀,髓鞘板层崩解,轴索分离,但经过28天烙灸治疗后,D组神经元细胞出现周围出现大量突触小泡,髓鞘结构变得清晰,呈洋葱样排列,而C组治疗神经元细胞恢复状况差于D组。（3）Western blot检测结果显示,术后7天,A组APC蛋白,B组GFAP蛋白含量高于其他组;术后14天,B组APC蛋白表达量下降,C、D组APC蛋白表达量上升,各组Nestin蛋白均有所增加;术后28天,GFAP蛋白中C组与D组蛋白含量表达低,C组与D组差异有统计学意义（P<0.05）。Nestin蛋白表达中,D组蛋白表达高于B组,差异有统计学意义（P<0.05）。实时荧光定量PCR结果显示,D组APC（Nestin）蛋白浓度高于B组和C组（P<0.05）,经过28天治疗D组GFAP蛋白浓度低于C组（P<0.05）。结论烙灸能促进脊髓损伤大鼠后肢运动和感觉功能的恢复。在烙灸干预下可以激活内源性神经干细胞并促进其增殖分化,抑制星形胶质细胞过度增加,从而修复大鼠受损神经细胞功能。
田婷,李晓光[8]（2021）在《脊髓损伤再生修复中的问题与挑战》文中提出背景:脊髓损伤导致严重的感觉、运动功能障碍,反射异常以及自主神经功能紊乱。目前脊髓损伤尚无有效的临床治疗措施。近年来,研究人员开发出多种新型治疗方案,为临床治疗脊髓损伤开辟了新途径。目的:探讨脊髓损伤病理生理学过程,总结脊髓损伤再生修复研究进展,分析临床转化现状与挑战,展望脊髓损伤治疗未来发展趋势。方法:检索PubMed数据库2003至2020年发表的相关文章,检索词为"spinal cord injury,neuroplasticity,functional recovery,therapeutic strategy,combinatory therapies, clinical translation"。初检文章398篇,经过筛选、整理,最终纳入116篇文章进行分析、总结。结果与结论:脊髓损伤的病理生理过程包括原发性损伤和继发性损伤。针对脊髓损伤的病理生理过程,脊髓损伤的潜在治疗策略包括:①增强神经保护:减少继发性损伤;②促进再生修复:激活神经元内在再生能力、改善微环境、细胞移植、神经调控与康复训练、脑机接口、联合治疗。脊髓损伤的病理过程十分复杂,单一治疗措施不足以促进人类脊髓损伤后神经再生和功能恢复。联合治疗通过解决脊髓损伤的多个病理过程,已经证明比单一治疗更为有效。未来临床试验应该加强多学科交流与合作,以确定最佳组合方案,促进脊髓损伤患者功能恢复。
杨拓[9]（2020）在《星形胶质细胞重编程技术治疗脊髓损伤的研究》文中研究表明研究背景:脊髓损伤（spinal cord injury,SCI）的修复仍是医学界的一大难题。一方面,损伤会造成病灶区域大量神经元死亡,形成大范围的神经元缺失,导致神经支配环路中断。由于成年哺乳动物的脊髓缺乏自发神经元再生的能力,因此如何补充新生神经元成为了治疗脊髓损伤的一个重大课题。另一方面,病灶周围还会形成由星形胶质细胞组成的致密胶质瘢痕,在一定程度上阻碍轴突的再生。然而胶质瘢痕实际上具有既保护又抑制的双重作用,这使得如何在不破坏其保护作用的前提下尽量降低其阻碍作用,成为了治疗脊髓损伤的另一个难题。而体内细胞重编程技术则有望在一定程度上解决这两个难题。目前,细胞重编程技术在中枢神经系统疾病与损伤中已经有一定研究基础,可以实现在生物体内将胶质细胞重编程成为神经元。如果将其应用于脊髓损伤,将部分组成胶质瘢痕的星形胶质细胞重编程成为神经元,则有望实现同时补充缺失的神经元以及降低胶质瘢痕密度的目的。但是目前细胞重编程技术在脊髓损伤领域的研究还比较少,现有的研究主要集中在探索诱导重编程的手段以及挖掘重编程的分子机制等方面,关于重编程对脊髓损伤的治疗作用及治疗机制尚不十分清楚。细胞重编程技术能否影响胶质瘢痕的密度,能否促进轴突的再生,能否改善运动功能恢复以及是否存在一些不足之处,这些问题都还有待进一步深入研究。研究目的:探究星形胶质细胞重编程在治疗脊髓损伤中的作用,并着重研究以下几个问题:1.探究腺相关病毒（adeno-associated virus,AAV）是否可以介导脊髓损伤后的星形胶质细胞重编程。2.验证星形胶质细胞重编程是否可以在病灶区域补充新生神经元。3.探究星形胶质细胞重编程是否可以降低胶质瘢痕的密度以及降低的程度。4.验证星形胶质细胞重编程是否可以促进轴突的再生。5.探究星形胶质细胞重编程是否可以改善运动功能恢复。6.探索星形胶质细胞重编程在脊髓损伤中应用有何不足之处,寻找改进的方案以进一步提升其治疗效果。研究方法:1.构建小鼠T10节段脊髓挤压伤模型。2.构建搭载有转录因子Sry-related HMG-box2（Sox2）的AAV载体,并在损伤后1周的时间点将病毒注射到胶质瘢痕区域。3.在病毒注射后1周及10周分别验证该病毒载体的表达情况和特异性。4.通过神经元特异性标记物的免疫组化染色验证重编程的神经元。5.通过星形胶质细胞特异性标记物胶质纤维酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein,GFAP）的免疫组化染色评估胶质瘢痕的密度以及重编程对胶质瘢痕的影响。6.通过大脑皮质运动区以及损伤节段以上脊髓区域的生物素化葡聚糖胺（biotinylated dextran amine,BDA）注射顺行示踪皮质脊髓束及脊髓固有束,以验证星形胶质细胞重编程是否促进轴突再生。7.通过行为学测试评价实验小鼠在星形胶质细胞重编程后的功能改善情况。8.将星形胶质细胞重编程与康复疗法相结合,验证康复疗法能否弥补单纯应用重编程疗法的不足,并进一步改善运动功能恢复。研究结果:1.该AAV载体具有良好的表达特异性,其主要在星形胶质细胞上表达,而几乎不在神经元上表达。2.部分星形胶质细胞被成功重编程成为神经元,从而达到了在瘢痕区域补充神经元的目的。3.星形胶质细胞重编程显着降低了胶质瘢痕的密度,并且和以往研究中彻底的胶质瘢痕消融手段相比,它在一定程度上保留了胶质瘢痕的结构完整性。4.通过在病灶区域补充新生神经元以及适当降低胶质瘢痕密度而不破坏其完整性这两种治疗机制,星形胶质细胞重编程促进了皮质脊髓束和脊髓固有束的再生。5.单独使用星形胶质细胞重编程疗法治疗脊髓损伤仅能轻微地改善功能恢复,而没有统计学差异。6.康复训练可以有效减缓肌肉萎缩并促进运动依赖性功能重塑,是星形胶质胞重编程的理想补充疗法。二者相结合可以显着改善实验小鼠运动功能恢复,且效果明显优于二者的单独使用。研究结论:1.在脊髓损伤的背景下,携带有Sox2基因的腺相关病毒载体可以实现在生物体内特异性地将胶质瘢痕中的部分成瘢痕星形胶质细胞重编程成为神经元,从而补充脊髓再生所需的中继神经元。2.星形胶质细胞重编程不仅可以补充新生神经元,还可以显着降低胶质瘢痕的密度但不破坏其结构完整性,并在以上两种作用下显着地促进轴突的再生。3.在脊髓损伤后2周的时间点对胶质瘢痕进行抑制,但是不破坏其基本结构的完整性,这可能是一种可行的胶质瘢痕干预方式。4.单纯应用细胞重编程治疗脊髓损伤可能难以达到理想的功能恢复效果。将其与康复疗法联合应用则可以显着改善脊髓损伤小鼠的后肢运功功能恢复,且其效果明显优于这两种疗法各自单独应用。
张琴[10]（2020）在《温针灸对脊髓损伤大鼠Shh/Gli-1信号通路影响的实验研究》文中提出目的:本实验通过对脊髓损伤模型大鼠施予艾条温针灸,观察艾条温针灸干预对脊髓损伤模型大鼠行为学,脊髓损伤处不同时间段Shh（sonic hedgehog,简称Shh）和Gli-1（glima-associated oncogene homolog-1,简称Gli-1）的mRNA（messenger ribonucleic acid,简称mRNA）与蛋白表达情况,探索温针灸对脊髓损伤修复的作用与Shh/Gli-1信号通路之间的关系,以探讨温针灸治疗脊髓损伤的作用机制,为临床温针灸治疗脊髓损伤提供实验理论依据。方法:本实验采用随机分组,平行对照的设计方法展开研究。参照改良Allen’s的重物打击法制备平第10胸椎（T10）脊髓损伤大鼠模型54只,然后,将造模成功的54只大鼠按照信封随机法分为四个大组,分别为急性期艾条温针灸治疗组、恢复期艾条温针灸治疗组、持续艾条温针灸治疗组和模型对照组,其中,持续治疗组和模型对照组又各有两个亚组,即持续艾条温针灸治疗7天组、持续艾条温针灸治疗14天组和模型对照7天组、模型对照14天组,另设置1组正常空白对照组,共7组,每组均为9只,总共63只大鼠。各治疗组按照不同时间段的划分予以温针灸治疗,同时在造模后24小时、第7天、第14天利用BBB（Basso,Beattie&Bresnahan,简称BBB）评分法分别进行大鼠双后肢的运动功能评分。造模后第7天对模型对照7天组及持续治疗7天组进行脊髓损伤处脊髓样本取材,余组脊髓损伤处脊髓样本取材在第14天治疗结束且完成BBB评分后进行。取材成功后利用实时荧光定量PCR（polymerase chain reaction,简称PCR）法检测各组大鼠Shh mRNA与Gli-1 mRNA的表达,利用Western blot法检测各组大鼠Shh与Gli-1蛋白的表达。所有实验数据采用SPSS22.0统计软件进行统计分析,当P≥0.05表示无统计学意义,P<0.05表示其差异有统计学意义,P<0.01表示具有极显着性统计学意义。结果:1.各组大鼠行为学指标观察各组于术后3个时间点BBB评分结果显示:术后第1天各组大鼠BBB评分均为0分,造模较成功;第7天,已经介入温针灸治疗的大鼠BBB评分显着高于模型对照组（P<0.05）;第14天,所有治疗组大鼠的BBB评分都明显高于模型对照组（P<0.05）,各治疗组间比较,恢复期治疗组评分低于其他两个治疗组,且有统计学上的差异（P<0.05）,持续治疗组BBB评分稍高于急性期治疗组,但无明显差异（P>0.05）。2.各组大鼠Shh和Gli-1的mRNA表达情况观察各组大鼠Shh与Gli-1的mRNA表达结果显示:与正常对照组相比较,模型对照组和温针灸治疗组Shh、Gli-1 mRNA表达均有增多,其差异具有统计学意义（P<0.05）;第7天、第14天这两个时间段,持续治疗组Shh、Gli-1 mRNA的表达均高于模型对照组,且P<0.05;模型7天组Shh、Gli-1 mRNA的表达与模型14天组比较无明显差异（P>0.05）;恢复期治疗组Shh mRNA表达较模型14天组虽有小幅上升,但其差异不具有统计学意义（P>0.05）,急性期治疗组Shh mRNA表达较模型14天组有显着增多,P<0.05。各治疗组Gli-1 mRNA表达均高于模型14天组,差异具有统计学意义（P<0.05）;同时间段各治疗组之间比较,急性期治疗组Shh、Gli-1 mRNA表达高于恢复期治疗组,但低于持续治疗14天组,其差异具有统计学意义（P<0.05）。3.各组大鼠Shh和Gli-1的蛋白表达情况观察各组大鼠Shh与Gli-1的蛋白表达结果显示:模型7天组大鼠Shh、Gli-1蛋白表达与正常对照组大鼠比较,其差异无统计学意义（P>0.05）;模型14天组大鼠Shh、Gli-1蛋白表达较正常组有较明显的增多（P<0.05）;各治疗组的Shh、Gli-1蛋白表达均比正常对照组明显提高,差异显着（P<0.05）;持续治疗7天组大鼠Shh蛋白表达和同时间段的模型对照组相比明显增多（P<0.05）,与此同时,持续治疗7天组Gli-1蛋白表达虽较模型7天组稍多,但差异无统计学意义（P>0.05）;持续治疗14天组大鼠Shh、Gli-1蛋白表达和同时间段的模型对照组相比,明显增多（P<0.05）;与模型14天组比较,急性期治疗组大鼠Shh、Gli-1蛋白表达明显增多,其差异有统计学意义（P<0.05）,恢复期治疗组Shh、Gli-1蛋白表达亦稍高于模型组,但其差异不具有统计学意义（P>0.05）;同时间段各治疗组间比较,急性期治疗组Shh蛋白表达明显高于恢复期治疗组,具有统计学意义（P<0.05）,但稍低于持续治疗14天组,其差异无统计学意义（P>0.05）;持续治疗14天组大鼠Shh蛋白表达明显高于持续治疗7天组,其差异有统计学意义（P<0.05）。与此同时,虽然持续治疗14天组大鼠Gli-1蛋白表达高于恢复期治疗组,且差异具有统计学意义（P<0.05）;但是急性期治疗组大鼠Gli-1蛋白表达虽高于恢复期治疗组,低于持续治疗14天组,但均无统计学意义上的差异（P>0.05）。结论:1.温针灸干预可以有效改善脊髓损伤模型大鼠的行为学指标,温针灸有促进脊髓损伤后肢体运动神经功能恢复的治疗作用。2.在大鼠脊髓损伤后,其自身可激活Shh、Gli-1的表达以达到机体自身的缓慢修复。3.温针灸可以促进Shh/Gli-1信号通路中Shh、Gli-1的表达,进而有效促进神经干细胞的增殖分化,这可能是其治疗脊髓损伤的一个重要作用机制。4.脊髓损伤后温针灸的越早介入和持续介入能更有助于增加Shh、Gli-1的mRNA和蛋白表达,更有利于脊髓损伤运动神经功能恢复。
二、脊髓损伤的治疗与功能恢复（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、脊髓损伤的治疗与功能恢复（论文提纲范文）
（1）AAV-NT3与运动对脊髓损伤后肢体痉挛的干预及新型基因载体AAV-CPP.16的初步构建（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 脊髓损伤后肌肉痉挛神经机制的研究进展 |
| 1.1.1 脊髓损伤后肌肉痉挛概述 |
| 1.1.2 脊髓损伤后肌肉痉挛的发生机制 |
| 1.2 以构建新型腺相关病毒为代表的基因疗法 |
| 1.2.1 基因疗法概述 |
| 1.2.2 腺相关病毒作为基因疗法关键工具的研究进展 |
| 1.3 神经营养因子3 的研究现状 |
| 1.3.1 概述 |
| 1.3.2 神经营养因子3 在脊髓损伤后肌肉痉挛中的作用 |
| 1.4 运动干预与脊髓损伤可塑性 |
| 1.4.1 概述 |
| 1.4.2 运动干预疗法在脊髓损伤后肌肉痉挛中的作用 |
| 1.5 选题依据及研究意义 |
| 第2章 编码人神经营养因子3 的腺相关病毒的构建及其在大鼠后肢肌肉及背根神经节中的表达 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验动物与细胞系 |
| 2.1.2 实验试剂 |
| 2.1.3 实验仪器与耗材 |
| 2.1.4 实验试剂的配制 |
| 2.2 实验方法与步骤 |
| 2.2.1 重组腺相关病毒载体的制备 |
| 2.2.2 重组腺相关病毒的注射 |
| 2.2.3 Western blot法检测NT3 蛋白的表达变化 |
| 2.2.4 大鼠脊髓组织NT3 的半定量分析 |
| 2.2.5 统计学处理 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 大鼠后肢肌肉中人神经营养因子3 的表达 |
| 2.3.2 大鼠脊髓背根神经节中神经营养因子3 的表达 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第3章 编码人神经营养因子3 的腺相关病毒与运动干预对大鼠脊髓损伤后肌肉痉挛的保护作用 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 实验动物 |
| 3.1.2 实验试剂 |
| 3.1.3 实验仪器与耗材 |
| 3.2 实验方法与步骤 |
| 3.2.1 实验设计 |
| 3.2.2 脊髓挫伤模型的建立 |
| 3.2.3 运动训练 |
| 3.2.4 游泳测试 |
| 3.2.5 BBB评分 |
| 3.2.6 H反射的RDD记录 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 AAV-NT3、运动干预及二者的联合治疗对大鼠脊髓损伤后游泳测试时痉挛行为发生频率的影响 |
| 3.3.2 单独或联合治疗对后肢运动功能的影响 |
| 3.3.3 单独或联合治疗对H反射RDD的影响 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第4章 编码人神经营养因子3 的腺相关病毒与运动干预对大鼠脊髓损伤后肌肉痉挛保护作用的机制研究 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 实验动物 |
| 4.1.2 实验试剂 |
| 4.1.3 实验仪器与耗材 |
| 4.2 实验方法与步骤 |
| 4.2.1 脊髓切片的灌注、固定和免疫荧光染色 |
| 4.2.2 免疫荧光定量 |
| 4.2.3 蛋白质印迹 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 单独或联合治疗后脊髓运动神经元及突触素(SYN)的变化 |
| 4.3.2 单独或联合治疗后 Ch AT 兴奋性中间神经元可塑性变化 |
| 4.3.3 单独或联合治疗后GABA抑制性中间神经元可塑性变化 |
| 4.3.4 单独或联合治疗后脊髓KCC2 蛋白表达的变化 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 第5章 新型中枢靶向性基因载体AAV-CPP.16 的构建 |
| 5.1 实验材料 |
| 5.1.1 实验动物与细胞系 |
| 5.1.2 实验试剂 |
| 5.1.3 实验仪器 |
| 5.1.4 实验试剂的配置 |
| 5.2 实验方法与步骤 |
| 5.2.1 生产病毒载体所需的质粒构建 |
| 5.2.2 重组腺相关病毒载体的制备 |
| 5.2.3 中枢靶向性基因载体AAV-CPP.16的构建模式 |
| 5.2.4 新一代血脑屏障3D体外模型构建、鉴定与AAV筛选 |
| 5.2.5 小鼠尾静脉注射进行AAV体内筛选 |
| 5.3 实验结果 |
| 5.3.1 小鼠体内筛选高效率转导的新型中枢靶向性病毒载体 |
| 5.3.2 血脑屏障3D体外模型验证AAV-CPP.16 穿透BBB的 能力 |
| 5.3.3 探索适宜的用于小鼠体内AAV-CPP.16 的病毒载量 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 小结 |
| 第6章 新型中枢靶向性基因载体AAV-CPP.16的转导效率 |
| 6.1 实验材料 |
| 6.2 实验方法与步骤 |
| 6.2.1 小鼠尾静脉注射 |
| 6.2.2 小鼠侧脑室病毒注射 |
| 6.2.3 脊髓和外周组织器官切片的灌注、固定和免疫荧光染色 |
| 6.3 实验结果 |
| 6.3.1 IV注射AAV-CPP.16 靶向脊髓的转导效率 |
| 6.3.2 IV注射AAV-CPP.16 靶向脊髓运动神经元的转导效率 |
| 6.3.3 IV注射AAV-CPP.16 靶向脊髓背根神经节的转导效率 |
| 6.3.4 IV注射AAV-CPP.16 外周毒性研究 |
| 6.3.5 ICV注射AAV-CPP.16 在小鼠大脑中的转导效率 |
| 6.3.6 ICV注射AAV-CPP.16 靶向脊髓的转导效率 |
| 6.3.7 ICV注射AAV-CPP.16 靶向脊髓运动神经元的转导效率 |
| 6.3.8 ICV注射AAV-CPP.16 靶向脊髓背根神经节的转导效率 |
| 6.3.9 ICV注射AAV-CPP.16 外周毒性研究 |
| 6.4 讨论 |
| 6.5 小结 |
| 第7章 结论 |
| 7.1 研究工作总结 |
| 7.2 本研究的创新性 |
| 7.3 工作局限及未来方向 |
| 参考文献 |
| 作者简介及在学期间所取得的科研成果 |
| 致谢 |
（2）通腑逐瘀法指导下抵当汤加减调控AQP4表达治疗大鼠急性脊髓损伤的作用机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 前言 |
| 第一部分 自制脊髓打击器与NYU打击器建立脊髓损伤模型研究 |
| 1.目的 |
| 2.材料和方法 |
| 3.结果 |
| 4.讨论 |
| 5.小结 |
| 6.不足和展望 |
| 第二部分 抵当汤加减调节AQP4 表达对SCI大鼠脊髓水肿的作用研究 |
| 1.目的 |
| 2.材料 |
| 3.方法 |
| 4.实验结果 |
| 5.讨论 |
| 6.小结 |
| 7.不足与展望 |
| 第三部分 抵当汤加减含药血清对反应性星形胶质细胞的活化、迁移及神经生长相关细胞因子分泌的作用 |
| 1.目的 |
| 2.材料 |
| 3.实验方法 |
| 4.实验结果 |
| 5.讨论 |
| 6.小结 |
| 7.不足和展望 |
| 本研究的创新点 |
| 参考文献 |
| 附件 |
| 附件1 自制简易打击器与NYU打击器 |
| 附件2 脊髓打击损伤模型 |
| 附录3 BBB评分 |
| 附录4 Reuter评分 |
| 附录5 综述 水通道蛋白在急性脊髓损伤中的作用机制 |
| References |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（3）3D打印技术构建干细胞仿生支架用于软骨及脊髓损伤修复的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 关节软骨损伤及治疗 |
| 1.1.1 关节软骨及其损伤 |
| 1.1.2 关节软骨损伤修复 |
| 1.2 脊髓损伤及治疗 |
| 1.2.1 脊髓结构与损伤 |
| 1.2.2 脊髓损伤修复治疗 |
| 1.3 生物3D打印技术 |
| 1.3.1 3D打印技术在再生医学领域的发展以及分类 |
| 1.3.2 3D打印技术在关节软骨修复中的应用 |
| 1.3.3 3D打印技术在脊髓修复中的应用 |
| 1.4 本论文的研究意义与内容 |
| 1.4.1 本论文的研究意义 |
| 1.4.2 本论文的主要研究内容 |
| 第2章 3D打印构建具有微孔道结构的纤维水凝胶支架促进间充质干细胞软骨分化 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验部分 |
| 2.2.1 实验试剂与仪器设备 |
| 2.2.2 hMSCs的分离、培养以及鉴定 |
| 2.2.3 HBC制备与表征 |
| 2.2.4 PLGA静电纺丝以及NF的制备与表征 |
| 2.2.5 水凝胶的制备与表征 |
| 2.2.6 HBC-NF水凝胶细胞毒性测定 |
| 2.2.7 hMSCs在水凝胶中的增殖 |
| 2.2.8 hMSCs在水凝胶中的软骨分化诱导及表征 |
| 2.2.9 3D打印具有微孔道结构的PCL-HBC-NF支架及其表征 |
| 2.2.10 体内软骨形成检测 |
| 2.2.11 统计学分析 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 hMSC的鉴定 |
| 2.3.2 PLGA短纤维的制备与表征 |
| 2.3.3 HBC水凝胶的制备与表征 |
| 2.3.4 HBC-NF水凝胶的表征 |
| 2.3.5 hMSCs细胞毒性与增殖 |
| 2.3.6 体外软骨分化 |
| 2.3.7 具有微孔道结构的PCL-水凝胶的制备与表征 |
| 2.3.8 hMSCs的体内软骨分化 |
| 2.4 实验讨论 |
| 2.5 本章小结 |
| 第3章 生物3D打印神经干细胞支架用于脊髓损伤修复 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验部分 |
| 3.2.1 实验试剂与仪器设备 |
| 3.2.2 HBC/HA/MA生物墨水的制备 |
| 3.2.3 HBC/HA/MA水凝胶的表征 |
| 3.2.4 NSCs提取 |
| 3.2.5 NSCs的生物3D打印 |
| 3.2.6 生物3D打印支架内NSCs的存活与增殖 |
| 3.2.7 生物3D打印支架内NSCs分化 |
| 3.2.8 支架移植入SD大鼠脊髓损伤模型 |
| 3.2.9 SD大鼠行为学表征 |
| 3.2.10 大鼠脊髓切片免疫荧光染色 |
| 3.2.11 统计学分析 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 HBC、HA-SH以及HA-VS的表征 |
| 3.3.2 HBC/HA/MA生物墨水的表征 |
| 3.3.3 生物3D打印NSCs负载的HBC/HA/MA支架 |
| 3.3.4 生物打印支架中NSCs的分化行为 |
| 3.3.5 SCI大鼠移植支架后运动功能恢复情况 |
| 3.3.6 组织学分析脊髓损伤修复情况 |
| 3.3.7 外源NSCs在体内的存活与分化 |
| 3.4 实验讨论 |
| 3.5 本章小结 |
| 第4章 缓释OSMI-4小分子的神经干细胞生物打印支架用于脊髓损伤修复 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验部分 |
| 4.2.1 实验试剂与仪器设备 |
| 4.2.2 材料制备 |
| 4.2.3 SM水凝胶的表征 |
| 4.2.4 NSCs的提取以及培养 |
| 4.2.5 SM水凝胶的细胞毒性测定 |
| 4.2.6 NSCs在水凝胶中的粘附以及增殖 |
| 4.2.7 OSMI-4诱导NSCs神经元分化 |
| 4.2.8 SM水凝胶中OSMI-4缓释 |
| 4.2.9 NSCs的生物3D打印 |
| 4.2.10 生物3D打印支架内NSCs的存活与增殖 |
| 4.2.11 生物3D打印支架内NSCs的分化 |
| 4.2.12 OSMI-4诱导NSCs神经元分化细胞通路检测 |
| 4.2.13 支架移植入SD大鼠脊髓损伤模型 |
| 4.2.14 BBB评分 |
| 4.2.15 大鼠脊髓切片免疫荧光染色 |
| 4.2.16 统计学分析 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 GelMA以及Ac-β-CD结构表征 |
| 4.3.2 SM水凝胶表征 |
| 4.3.3 NSCs细胞毒性、粘附与增殖 |
| 4.3.4 OSMI-4对NSCs分化的影响 |
| 4.3.5 生物3D打印NSCs负载的SM支架 |
| 4.3.6 SM-OSMI-4打印支架诱导NSCs神经元分化 |
| 4.3.7 OSNI-4调节NSCs分化的作用机理 |
| 4.3.8 生物打印支架对大鼠脊髓损伤的修复 |
| 4.4 实验讨论 |
| 4.5 本章小结 |
| 第5章 结论与展望 |
| 5.1 结论 |
| 5.2 创新点 |
| 5.3 展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 在读期间发表的学术论文以及所取得的奖励 |
（4）完全性胸段脊髓损伤后大脑静息态fMRI和EEG研究（论文提纲范文）
| 缩略词表 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 研究背景 |
| 参考文献 |
| 第一部分 完全性胸段脊髓损伤后大脑MRI研究 |
| 前言 |
| 资料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 完全性脊髓损伤后大脑静息态EEG研究 |
| 前言 |
| 资料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 完全性脊髓损伤康复治疗后的纵向fMRI及EEG研究 |
| 前言 |
| 资料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 综述 MRI和EEG技术在脊髓损伤后大脑重塑研究中的应用进展 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间获得的学术成果 |
| 致谢 |
（5）ADSCs通过调控神经细胞TGF-β1/Smad/PLOD2信号通路修复脊髓损伤的机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 第一部分 ADSCs体外共培养对损伤神经细胞的修复作用 |
| 前言 |
| 一、材料与方法 |
| 二、实验结果 |
| 三、讨论 |
| 四、结论 |
| 附图 |
| 参考文献 |
| 第二部分 ADSCs通过调控神经细胞TGF-β1/Smad3/PLOD2信号通路促进损伤神经细胞的修复 |
| 前言 |
| 一、材料与方法 |
| 二、实验结果 |
| 三、讨论 |
| 四、结论 |
| 附图 |
| 参考文献 |
| 第三部分 ADSCs通过激活神经细胞TGF-β1/Smad3/PLOD2信号通路促进脊髓损伤大鼠功能恢复 |
| 前言 |
| 一、材料与方法 |
| 二、实验结果 |
| 三、讨论 |
| 四、结论 |
| 五、总论 |
| 附图 |
| 参考文献 |
| 文献综述 间充质干细胞治疗脊髓损伤的研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文目录 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
| 外文论文一 |
| 外文论文二 |
（6）白藜芦醇/骨髓间充质干细胞联合治疗大鼠脊髓损伤的作用与机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略语 |
| 第一部分:大鼠脊髓损伤后Sirt-1 表达变化与炎症的关系探究 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 主要试剂与仪器设备 |
| 2.1.1 主要试剂 |
| 2.1.2 主要仪器设备 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 研究对象和实验分组 |
| 2.2.2 大鼠脊髓损伤模型的建立 |
| 2.2.3 样品取材 |
| 2.2.4 组织灌流 |
| 2.2.5 Western Blot检测 |
| 2.2.6 Elisa检测 |
| 2.2.7 免疫荧光染色 |
| 2.2.8 统计学分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 脊髓损伤后不同时间点Sirt-1 表达的变化 |
| 3.2 脊髓损伤后不同时间点炎症因子表达的变化 |
| 3.3 脊髓损伤后Sirt-1 和炎症因子表达变化呈相关性 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第二部分:白藜芦醇对大鼠骨髓间充质细胞炎症环境中的作用及作用机制 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 主要试剂 |
| 2.2 主要仪器设备 |
| 2.3 大鼠骨髓间充质干细胞培养及细胞操作 |
| 2.3.1 细胞培养环境及细胞培养液的制备配方 |
| 2.3.2 大鼠骨髓间充质干细胞原代培养方法 |
| 2.3.3 细胞换液 |
| 2.3.4 细胞传代 |
| 2.3.5 细胞冻存 |
| 2.3.6 细胞复苏 |
| 2.4 流式细胞术抗体标记检测 |
| 2.5 MTT检测 |
| 2.5.1 MTT检测TNF-α不同处理时长细胞生存率 |
| 2.5.2 MTT检测不同白藜芦醇浓度对TNF-α诱导炎症模型细胞生存率作用 |
| 2.6 细胞分组及处理 |
| 2.7 Elisa检测 |
| 2.8 Western Blot检测 |
| 2.8.1 Western Blot样品收集及制备 |
| 2.8.2 Western Blot检测 |
| 2.9 Real-Time PCR检测 |
| 2.9.1 RNA提取 |
| 2.9.2 cDNA合成 |
| 2.9.3 Real-Time PCR反应 |
| 2.10 流式细胞术凋亡检测 |
| 2.11 统计学分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 原代培养大鼠骨髓间充质干细胞光学显微镜下形态观察 |
| 3.2 原代培养的大鼠骨髓间充质干细胞表面抗原分子检测 |
| 3.3 骨髓间充质干细胞在炎症模型中细胞存活率与时间变化的关系 |
| 3.4 骨髓间充质干细胞在炎症模型中不同浓度白藜芦醇干预对细胞生存率的影响 |
| 3.5 白藜芦醇干预对大鼠骨髓间充质干细胞炎症刺激环境中炎症因子表达的变化 |
| 3.6 白藜芦醇对大鼠骨髓间充质干细胞在炎症刺激环境Sirt-1/NF-κB表达的干预 |
| 3.7 白藜芦醇对大鼠骨髓间充质干细胞在炎症刺激环境中凋亡蛋白表达的干预 |
| 3.8 白藜芦醇对大鼠骨髓间充质干细胞在炎症刺激环境中作用与Sirt-1 的关系 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第三部分:白藜芦醇/骨髓间充质干细胞联合治疗脊髓损伤的作用及机制 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 主要试剂与仪器设备 |
| 2.1.1 主要试剂 |
| 2.1.2 主要仪器设备 |
| 2.2 研究对象和实验分组 |
| 2.3 大鼠脊髓损伤模型的建立 |
| 2.4 骨髓间充质干细胞显微注射移植 |
| 2.5 BBB评分 |
| 2.6 样品取材及组织灌流 |
| 2.7 Nissl染色 |
| 2.8 Western Blot检测 |
| 2.9 骨髓间充质干细胞荧光探针标记 |
| 2.10 免疫荧光染色 |
| 2.11 Elisa法检测 |
| 2.12 统计学分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 不同处理组大鼠脊髓损伤后运动功能的变化 |
| 3.2 不同处理组大鼠脊髓运动神经元的数量变化 |
| 3.3 不同处理组大鼠脊髓组织Sirt-1/NF-κB和炎症因子表达的变化 |
| 3.4 不同处理组大鼠脊髓组织凋亡相关蛋白表达的变化 |
| 3.5 白藜芦醇和骨髓间充质干细胞联合移植对骨髓间充质干细胞和神经元的作用 |
| 3.6 不同处理组大鼠脊髓组织BDNF表达的变化 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 本研究创新性自我评价 |
| 参考文献 |
| 综述 白藜芦醇在脊髓损伤后的应用与机制 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（7）烙灸对脊髓损伤大鼠内源性神经干细胞相关因子影响（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词表 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 1.实验材料 |
| 1.1 实验动物及分组 |
| 1.2 主要仪器与设备 |
| 1.3 主要试剂 |
| 2.方法 |
| 2.1 动物模型制备 |
| 2.2 治疗方法 |
| 2.3 大鼠运动及感觉功能评分 |
| 2.4 组织取材 |
| 2.5 Western blot(WB) |
| 2.6 实时荧光定量PCR(Real time-PCR) |
| 2.7 TEM(透射电镜) |
| 2.8 统计学处理 |
| 结果 |
| 1.大鼠一般情况 |
| 2.BBB运动功能评分结果 |
| 3.Reuter感觉功能评分结果 |
| 4.电镜观察结果 |
| 5.Western blot结果 |
| 6.实时荧光定量PCR结果 |
| 讨论 |
| 1.医学界对脊髓损伤研究进展 |
| 2.烙灸的研究进展 |
| 3.烙灸对脊髓损伤大鼠结构和功能影响 |
| 3.1 烙灸对脊髓损伤大鼠肢体运动及感觉功能影响 |
| 3.2 烙灸对脊髓损伤大鼠结构的影响 |
| 4.烙灸对脊髓损伤大鼠内源性神经干细胞增殖分化影响 |
| 4.1 烙灸对脊髓损伤大鼠APC蛋白表达 |
| 4.2 烙灸对脊髓损伤大鼠GFAP蛋白表达 |
| 4.3 烙灸对脊髓损伤大鼠Nestin蛋白表达 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 文献综述 神经干细胞在脊髓损伤修复机制中的实验研究进展 |
| 综述参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
| 个人简历 |
（8）脊髓损伤再生修复中的问题与挑战（论文提纲范文）
| 文章快速阅读： |
| 文题释义： |
| 0引言Introduction |
| 1 资料和方法Data and methods |
| 1.1 资料来源以 |
| 1.2 纳入标准 |
| 1.3 排除标准 |
| 1.4 数据提取 |
| 2 结果Results |
| 2.1 脊髓损伤病理生理学 |
| 2.2 脊髓损伤治疗策略 |
| 2.2.1 增强神经保护，减少继发性损伤 |
| 2.2.2 促进再生修复 |
| 2.3 临床转化现状与挑战 |
| 3 讨论Discussion |
（9）星形胶质细胞重编程技术治疗脊髓损伤的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 中英文缩略词表 |
| 第1章 绪论 |
| 第2章 文献综述 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 胶质瘢痕的形成和成瘢痕星形胶质细胞的转化过程 |
| 2.2.1 损伤后数小时——星形胶质细胞的激活 |
| 2.2.2 损伤后数天——胶质瘢痕的形成 |
| 2.2.3 损伤后数周——胶质瘢痕的成熟 |
| 2.3 其他细胞组分对胶质瘢痕及脊髓损伤修复的影响 |
| 2.3.1 小胶质细胞 |
| 2.3.2 巨噬细胞 |
| 2.3.3 硫酸软骨素蛋白多糖 |
| 2.3.4 NG2-OPC细胞 |
| 2.4 胶质瘢痕在脊髓损伤中的双重角色 |
| 2.4.1 胶质瘢痕作为物理屏障阻碍轴突的再生 |
| 2.4.2 成瘢痕星形胶质细胞能分泌抑制性分子但却不一定是它们的首要来源 |
| 2.4.3 活化星形胶质细胞的细胞毒性亚型 |
| 2.4.4 活化星形胶质细胞与胶质瘢痕共同平衡早期炎症反应 |
| 2.4.5 胶质瘢痕是限制和压缩纤维组织和巨噬细胞的限制性边界 |
| 2.4.6 成瘢痕星形胶质细胞在一定条件下可作为支持轴突再生的桥梁 |
| 2.5 对于以胶质瘢痕为靶点的治疗策略的一些推测和建议 |
| 2.6 以胶质瘢痕为靶点的新兴治疗策略 |
| 2.6.1 通过环境调控干预星形胶质细胞命运 |
| 2.6.2 星形胶质细胞表型重构 |
| 2.6.3 包含有胶质瘢痕干预手段的联合疗法 |
| 2.6.4 星形胶质细胞重编程疗法 |
| 2.7 细胞重编程技术在中枢神经系统疾病以及损伤中的应用 |
| 2.8 细胞重编程技术在脊髓损伤领域的研究现状 |
| 2.9 文献综述小结 |
| 第3章 材料与方法 |
| 3.1 主要实验仪器 |
| 3.2 实验动物 |
| 3.3 实验试剂及抗体 |
| 3.4 腺相关病毒载体的制备 |
| 3.5 脊髓损伤模型 |
| 3.6 实验动物的筛选和分组 |
| 3.7 病毒载体的注射 |
| 3.8 脊髓固有束示踪 |
| 3.9 皮质脊髓束示踪 |
| 3.10 组织处理及免疫组化 |
| 3.11 GFAP免疫荧光反应的定量统计 |
| 3.12 小鼠跑轮康复训练 |
| 3.13 行为学测定 |
| 3.13.1 BMS评分 |
| 3.13.2 不规则跑轮测试 |
| 3.13.3 机械痛阈值测量 |
| 3.13.4 斜板试验 |
| 3.13.5 后肢划水测试 |
| 3.14 统计学分析 |
| 第4章 结果 |
| 4.1 Sox2-AAV在目标成瘢痕星形胶质细胞中特异性表达 |
| 4.2 成瘢痕星形胶质细胞被高效地重编程为神经元 |
| 4.3 星形胶质细胞重编程可显着降低胶质瘢痕的密度但不破坏其完整性 |
| 4.4 星形胶质细胞重编程促进轴突在瘢痕区域的再生 |
| 4.5 单独应用星形胶质细胞重编程难以显着改善功能恢复 |
| 4.6 星形胶质细胞重编程结合康复疗法显着改善脊髓损伤小鼠的后肢运动功能恢复 |
| 第5章 讨论 |
| 5.1 损伤模型及模型动物的选择 |
| 5.2 诱导重编程方法的选择 |
| 5.3 胶质瘢痕的干预手段和干预程度 |
| 5.4 注射病毒载体以及干预胶质瘢痕的时间点选择 |
| 5.5 BMS小鼠后肢运动功能评分体系 |
| 5.6 星形胶质细胞重编程与康复训练的联合疗法可以弥补单独应用重编程的不足和限制 |
| 第6章 结论 |
| 创新点 |
| 参考文献 |
| 作者简介及在学期间所取得的科研成果 |
| 致谢 |
（10）温针灸对脊髓损伤大鼠Shh/Gli-1信号通路影响的实验研究（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 外文缩略语表 |
| 引言 |
| 历史回顾 |
| 文献综述 针灸治疗脊髓损伤的临床实验研究及Shh信号通路与神经干细胞关系研究进展 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 主要实验试剂 |
| 1.3 主要实验仪器 |
| 1.4 其他实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 制备脊髓损伤大鼠模型 |
| 2.2 分组 |
| 2.3 各组处理方法 |
| 2.4 采集脊髓样本 |
| 2.5 检测指标及方法 |
| 3 统计方法 |
| 4 实验结果 |
| 4.1 各组大鼠行为学观察 |
| 4.2 各组大鼠实时荧光定量PCR结果 |
| 4.3 各组大鼠Shh和Gli-1的蛋白表达情况 |
| 5 讨论 |
| 5.1 疾病选择的依据 |
| 5.2 动物模型选择的依据 |
| 5.3 治疗方法选择的依据 |
| 5.4 指标选择的依据 |
| 5.5 实验指标结果分析及评价 |
| 5.6 存在的问题和启示 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附件 BBB评分 |
| 个人简介 |
四、脊髓损伤的治疗与功能恢复（论文参考文献）
- [1]AAV-NT3与运动对脊髓损伤后肢体痉挛的干预及新型基因载体AAV-CPP.16的初步构建[D]. 常宇鑫. 吉林大学, 2021(01)
- [2]通腑逐瘀法指导下抵当汤加减调控AQP4表达治疗大鼠急性脊髓损伤的作用机制研究[D]. 吴子健. 湖北中医药大学, 2021(01)
- [3]3D打印技术构建干细胞仿生支架用于软骨及脊髓损伤修复的研究[D]. 刘晓云. 中国科学技术大学, 2021(09)
- [4]完全性胸段脊髓损伤后大脑静息态fMRI和EEG研究[D]. 王文丽. 昆明医科大学, 2021(02)
- [5]ADSCs通过调控神经细胞TGF-β1/Smad/PLOD2信号通路修复脊髓损伤的机制研究[D]. 李芳. 山东大学, 2021(11)
- [6]白藜芦醇/骨髓间充质干细胞联合治疗大鼠脊髓损伤的作用与机制研究[D]. 赵浩森. 中国医科大学, 2021(02)
- [7]烙灸对脊髓损伤大鼠内源性神经干细胞相关因子影响[D]. 岳倩文. 宁夏医科大学, 2021(02)
- [8]脊髓损伤再生修复中的问题与挑战[J]. 田婷,李晓光. 中国组织工程研究, 2021(19)
- [9]星形胶质细胞重编程技术治疗脊髓损伤的研究[D]. 杨拓. 吉林大学, 2020(04)
- [10]温针灸对脊髓损伤大鼠Shh/Gli-1信号通路影响的实验研究[D]. 张琴. 江西中医药大学, 2020(05)