一、禽流感病毒番鸭分离株对不同禽类致病性的研究（论文文献综述）
张醒海[1]（2021）在《候鸟禽流感病毒遗传变异规律分析及在哺乳动物间传播机制研究》文中认为流感病毒是目前最受关注的人畜共患病原体之一,广泛分布在自然环境、家禽及候鸟等自然宿主中,可感染包括人类在内的多种哺乳动物,对国家生物安全、产业经济有着重要影响。该病毒对人类健康的危害主要表现为引起季节性流感、流感大流行和人感染动物流感等。候鸟是H3N8、H9N2和H5N8等众多亚型禽流感病毒的储存库,且这些病毒持续在我国候鸟中流行传播。近年来它们又出现新的生物表型或基因特性,如水禽不仅呈现无症状携带流感病毒,也出现了感染甚至致死的现象;部分候鸟来源的病毒,可发生水禽-陆禽的传播;出现禽源H9N2、H5N8感染人的现象。这些亚型病毒在中国候鸟中的流行、进化及引发公共卫生风险等问题亟待解决。本研究以监测中国东部候鸟禽流感病毒流行动态为切入点,研究内容包括发现候鸟禽流感病毒的亚洲-北美地区跨洲际传播的证据,揭示候鸟禽流感病毒在自然宿主中的遗传变异规律,提供禽流感病毒家禽-野禽间跨物种感染的证据,评估候鸟源禽流感病毒在哺乳动物间的传播能力以及识别决定禽流感病毒跨物种感染人的分子特征。第一部分:中国东部地区候鸟禽流感流行病学调查。在全球候鸟迁徙背景下,选取途经我国东部的东亚-澳大利亚候鸟迁徙路线上重要候鸟停歇与聚集地（湖南东洞庭湖、环渤海湾湿地、内蒙古图牧吉、上海崇明东滩）开展了2016-2019年为期四年的主动预警监测,分离跨洲际传播或新型重配候鸟源禽流感病毒株,并测定其全基因序列。监测过程中本研究共采集了来自96种不同鸟类的35604份样本,分离得到88株病毒,候鸟禽流感病毒携带率约为0.247%。亚型多样性分析表明分离毒株涵盖12种HA和9种NA组成的23种不同亚型。其中低致病性禽流感病毒H3、H6、H9亚型为优势流行毒株。病原学及血清学数据证明H9N2禽流感病毒在候鸟内广泛流行,H9N2禽流感病毒可以感染包括纵纹腹小鸮、红隼、苍鹰和雉鸡多种野生鸟类,在小型多宿主生态系统中H9N2可以发生有效的种间传播。自2020年10月底以来,H5N8病毒中国中东部候鸟中引发疫情。本研究证实了H5N8对大天鹅、尤鼻天鹅等候鸟的感染,确定2020 HPAIV H5N8为2.3.4.4b谱系。抗原性分析发现,由于抗原漂移,当前家禽H5疫苗株对2020年HPAIV H5N8病毒保护力下降,病毒传入家禽并大面积流行的风险极大,需要及时更新家禽候选疫苗株,并进一步加强监测和实施预防措施。第二部分:候鸟禽流感病毒遗传进化分析。本研究进而对禽流感病毒各基因片段在天然宿主中的进化速率及基因片段溯源分析:基于不同时间点分离的病毒之间遗传差异和时间分布,采用贝叶斯MCMC方法,估算各个基因片段进化变异的总体速率并推断其最近共同祖先（t MRCA）的年代。重点关注亚洲和北美洲之间候鸟禽流感病毒的洲际联系:利用病原基因组序列信息构建系统发育树,结合候鸟迁徙数据,分析病毒基因片段转移的方向性,通过各基因片段的地理溯源来确定亚洲和北美洲之间候鸟禽流感病毒的洲际联系,确定可能的病毒引入途径,解析候鸟在大陆之间和大陆内部的禽流感病毒流通过程中发挥的作用。系统发育分析揭示部分亚型AIVs基因片段存在洲际间的沟通与传播。遗传变异分析发现中国东部候鸟AIVs基因片段遗传多样性丰富、不同亚型及不同鸟种间出现基因节段流通与传播。H3N8亚型禽流感病毒在候鸟中广泛流行,且基因型十分丰富,分离到的8株H3N8禽流感病毒可以分为7个基因型。H13、H3N8亚型内部基因节段存在洲际间的沟通与传播。系统发生及基因型分析研究发现H9N2禽流感病毒存在由家禽向野禽溢出的现象。对2020 HPAIV H5N8进行各基因节段溯源,结合系统发生地理学及候鸟迁徙路线证明了2020年中国候鸟中流行的H5N8禽流感病毒为新型重配毒株,随候鸟迁徙由哈萨克斯坦及俄罗斯引入我国,明确了新型重排H5N8流感病毒各基因片段的进化地位和起源,揭示了H5N8禽流感病毒株在欧亚大陆内的洲内传播及非洲-欧亚大陆的洲际间传播的现象。第三部分:候鸟禽流感病毒公共卫生风险评估。在遗传变异分析的基础上,我们开展候鸟禽流感病毒新型重配病毒受体结合特性及其在非天然宿主中的致病与传播能力评估。针对首次出现感染人的2020 HPAIV H5N8高致病性禽流感病毒,采用哺乳动物模型评估其在不同宿主上的致病性及传播能力,评估其公共卫生风险;针对由家禽溢出到野鸟的H9N2亚型禽流感病毒,我们结合病毒基因组变异分析,受体结合偏好性与哺乳动物致病性及传播能力分析,系统评估其公共卫生风险;针对在候鸟中广泛流行的多个基因型的H3N8亚型禽流感病毒,我们评估其受体结合能力,利用小鼠、豚鼠、雪貂等动物模型检测其在哺乳动物致病性及传播能力,分析研判H3N8亚型人群间传播的潜在风险。生物学特性评估发现H5N8禽流感病毒在人际间传播的风险仍然很低,此判断基于H5N8禽流感病毒偏好与禽类受体结合,而且在豚鼠中不具备传播能力的研究数据。尽管近来首次出现2020 HPAIV H5N8禽流感病毒感染人的状况,本研究证实H5N8禽流感病毒尚不具备在人际间流行的潜力,提示其产生的公共卫生威胁有限。由家禽溢出到候鸟的H9N2毒株结合人样受体后,可以在豚鼠及雪貂模型间通过直接接触及呼吸道飞沫途径进行高效传播,这些结果强调了H9N2亚型禽流感病毒存在能够引发人际间流行的潜在的公共卫生风险。受体结合检测证实H3N8毒株普遍具有结合人样受体的能力,在豚鼠模型中具备高效的接触传播及呼吸道飞沫传播能力。候鸟H3N8亚型禽流感病毒具有感染人类并在人群中传播的潜在风险。第四部分:候鸟源H3N8禽流感病毒在哺乳间传播的分子机制研究。在候鸟源H3N8禽流感病毒的哺乳间传播评估过程中,本研究发现T222毒株不能在雪貂模型中通过呼吸道飞沫传播,而T222豚鼠适应1代毒株可以经呼吸道飞沫传播。因此,我们选择传播能力差异明显但遗传背景相似的以上两株H3N8亚型禽流感病毒毒株,结合反向遗传学技术,构建了PB1-S524G突变质粒并拯救r T222-S524G突变体。采用体外聚合酶活性检测,我们证实PB1-S524G突变增强了病毒聚合酶活性。进一步利用小鼠、豚鼠和雪貂等动物模型,发掘决定H3N8亚型哺乳动物间传播的关键分子标记。本研究证实PB1-S524G突变可以赋予H3N8在雪貂间经呼吸道飞沫传播的能力。PB1-S524G突变增强了病毒体内外复制能力,提高病毒在小鼠及雪貂上呼吸道的病毒复制滴度,加剧了由病毒导致的雪貂肺脏的病理损伤。研究结果表明PB1-S524G是影响候鸟H3N8禽流感病毒在哺乳动物宿主上致病及传播能力的关键分子标记。以上研究结果提示我们应持续加强对候鸟禽流感病毒的监测及对公共卫生安全的威胁进行评估,进一步加强候鸟禽流感病毒跨物种传播的分子机制的研究,为禽流感防控提供理论依据。
李梅珍[2]（2020）在《分离株FAdV-4致病性和诱导细胞产生免疫因子特性的初步研究》文中指出Ⅰ群禽腺病毒（Fowl adenovirus group I,FAdV-I）是禽类重要的病原体,分为A、B、C、D和E五个亚群,其中C亚群中的4型腺病毒（FAdV-4）是临床中发病率和死亡率最高的血清型。本研究从临床中分离和鉴定FAdV-4并对其致病性、细胞免疫机制和主要结构蛋白进行分析。第一,分离FAdV-4毒株并鉴定病毒的致病性。采集临床中疑似腺病毒鸡的病变肝脏,接种SPF鸡胚,收集病死鸡胚的尿囊液和肾脏并提取病毒的DNA,用禽腺病毒特异性引物进行PCR扩增,产物进一步进行序列测定和比对分析。结果显示,该分离株为Ⅰ群C亚群4型禽腺病毒,命名为AH-FAdV-4。测定该毒株的TCID50为1′106.52 TCID50/m L。接种15日龄SPF鸡和15日龄番鸭,结果发现接种的SPF鸡在3 d内均死亡且剖检见典型的心包积液病变,而鸭未见死亡,剖检未见典型病变。结果说明本次分离到的AH-FAdV-4为强毒株,对雏鸡的致死率极高但对鸭无明显致病性。第二,对AH-FAdV-4诱发机体的产生干扰素进行研究。分离和培养16日龄SPF鸡胚原代肾细胞,用1 MOI（multiplicity of infection,感染复数）病毒量感染原代肾细胞,5 d后抽提细胞的RNA并进行反转录,应用实时荧光PCR（RT-PCR）方法检测信号通路调控分子（STING和NF-κB）、细胞因子（IFN-β、IFN-γ、IL-1β）、相关膜受体（MDA5、NLRP3）、部分抗原提呈分子（Ii、MHC Ia、MHC IIβ）和信号蛋白（MAVS）基因的表达,结果发现,AH-FAdV-4可以激活STING、NF-κB通路,能提高IFN-β、IFN-γ基因的转录水平,这表明感染后的细胞通过调节SRING和NF-κB信号通路途径促进干扰素的表达,以抵抗病毒入侵;同时,使用抑制剂二硫氨基甲酸肽吡咯烷（PDTC）来抑制NF-κB的活化,发现病毒感染细胞后,抑制NF-κB的表达可以降低抗原递呈分子Ii、MHC Ia、MHC IIβ和NLRP3的表达。这说明病毒通过调控NF-κB,来调控抗原提呈分子的表达进而间接调控T细胞介导的细胞免疫应答。第三,对病毒主要结构蛋白Fiber2进行细胞定位的分析和蛋白的表达。构建含有AH-FAdV-4-Fiber2基因的真核重组质粒pm Cherry-C1-Fiber2、pm Cherry-N1-Fiber2,转染293T细胞利用激光共聚焦显微镜观察其在细胞内定位,结果表明Fiber2主要定位于细胞核。构建Fiber2基因的原核重组表达质粒p ET-32a-Fiber2并进行蛋白的表达和纯化,经SDS-PAGE和Western Blot鉴定结果表明获得较纯的Fiber2的蛋白,这为AH-FAdV-4亚单位疫苗的制备奠定了基础。
李玥[3]（2019）在《H9N2亚型禽流感病毒株遗传演化分析及HA和NA基因核酸标准品的研制》文中研究指明禽流感（Avian influenza,AI）是由禽流感病毒（Avian influenza virus,AIV）引起禽类的一种从轻度的呼吸道症状到全身严重性败血症等多种症状的传染病。由于致病力的不同,禽流感分为高致病性（High pathogenic avian influenza,HPAI）和低致病性（Low pathogenic avian influenza,LPAI）,这些致病性导致禽类死亡症状不同。根据病毒表面血凝素（HA）和神经氨酸酶（NA）的不同,禽流感可分为多种亚型,目前共有18种HA亚型和11种NA亚型。禽流感病毒不仅感染鸡、鹌鹑、鸭及野禽等禽类,而且还感染猪、马等哺乳动物以及人类。由于H9N2亚型禽流感病毒致病率低,禽类感染后症状表现不明显或者无症状,从而导致H9N2在禽类中大面积流行,给养殖业带来了很大的经济损失,因此对H9N2亚型禽流感病毒的防控至关重要。本研究通过对GenBank上获得国内各地区H9N2亚型禽流感病毒基因序列,分别绘制HA、NA基因进化树,了解H9N2亚型禽流感病毒疫情分布情况。将吉林地区18株H9N2亚型禽流感病毒分离株和2株参考毒株的HA和NA基因进行扩增和序列测定,并对HA、NA基因进行进化分析,掌握吉林地区H9N2亚型禽流感病毒分离株在国内的流行趋势,分析分离毒株亲缘关系和进化关系。针对国内H9N2亚型病毒分离株HA基因的五个分支中的5株典型毒株分别设计了特异性引物和探针,建立了不同的荧光PCR检测方法。然后对H9N2亚型流感病毒的HA和NA基因采用体外转录的方法获得HA-cRNA和NA-cRNA,以cRNA为模板制备了应用于H9N2亚型禽流感病毒HA基因和NA基因检测的标准品,为H9N2亚型禽流感病毒的检测提供了标准物质。1、从GenBank上获得国内各地区流行的H9N2亚型禽流感病毒的HA、NA基因序列,其中1619株HA基因,1104株NA基因,按照时间、地区、宿主等信息进行筛选,分别绘制进化树。结果表明,国内流感毒株共分为北美谱系和欧亚谱系,HA基因共分为五个分支,NA基因分为四个分支。HA、NA基因的各个分支覆盖了我国绝大部分地区,各分支之间没有明显的地域分布差异。病毒株多来源于广东、山东和一些沿海地区,且宿主以鸡源为主。对吉林地区18株H9N2亚型流感病毒分离株和2株参考毒株分别进行HA和NA基因扩增和序列测定,同时对HA、NA基因进行进化分析,通过进化比较分析可以看出,所有分离株分布于HA基因第一至三个分支和NA基因第一、二分支,其中HA基因第五分支属于北美谱系,该谱系以TY66为代表毒株且毒株较少共11株,分离株多来自于野鸟和水禽。其他分支均属于欧亚谱系,其中第四分支只有6株,以HKG1为代表毒株,毒株多来自沿海地区,水禽居多。第三分支毒株共87株,发现时间较早,本试验分离株与代表毒株BJ94亲缘关系较近。第一、二分支共1515株,以Y280为代表毒株,大部分的分离株集中在这两个分支上。NA基因的第四分支是以TY66为代表毒株的北美谱系,该分支共有8个毒株,其它三个分支均为欧亚谱系;第三分支以HKG1为代表毒株,该分支毒株只有6株,毒株也以水禽居多;第二分支有213株,且分离时间较早;第一分支共有887株,近些年的分离株大多集中于该分支。2、为了区分各分支中分离株,建立了特异性荧光PCR的方法,本研究针对5个分支代表毒株的HA基因序列分别设计一对特异性引物和探针,以标准阳性质粒为模板,构建荧光PCR标准曲线,建立荧光PCR检测方法。实验结果显示,将稀释后的质粒,进行荧光PCR扩增,可以分别扩增到102 copies/μL和101 copies/μL,其它毒株均未被扩出,证明该方法具有很好的敏感性及特异性。稳定性实验表明,对重组质粒108 copies/μL106 c opies/μL的浓度进行三次扩增,能呈现较好的梯度曲线,稳定性较好。3、为了提高对H9N2亚型流感病毒检测结果的准确性,本试验针对2株试验毒株的HA、NA基因进行全长的扩增,构建了含有T7启动子的重组质粒,测序成功后,通过体外转录可以快速获得大量的HA-cRNA和NA-cRNA片段。测得产物浓度分别为346 ng/μL、301 ng/μL,经连续倍比稀释后,以此为模板进行Real-time RT-PCR检测,绘制标准曲线图,测定值基本在一条直线上,扩增曲线良好,可用作核酸检测的标准物质。随后对标准物质进行均匀性、稳定性和不确定度分析,经计算结果显示,满足标准样品对均匀性的要求,检测组在稳定性监测期内是稳定的。由于H9N2亚型禽流感在世界范围内广泛流行,为了减少其暴发的可能性,我们应及时掌握该亚型在国内的流行趋势,加强监控和防范措施,保障健康养殖和食品安全。
姚明[4]（2019）在《鸭易感病毒检测方法的建立与应用研究》文中进行了进一步梳理我国是养鸭大国,我国鸭的存量占世界总存量的63.76%。然而随着我国养鸭业的发展,由于饲养密度过大、缺乏有效管理,人类和动物之间的流动性增强以及环境污染等原因,近年来鸭的病毒感染情况越来越严重,对养鸭业造成了巨大经济损失。其中危害较为严重的病毒有禽流感病毒（AIV）、新城疫病毒（NDV）、鹅细小病毒（GPV）、鸭肝炎病毒1型（DHAV-1）、鸭坦布苏病毒（DTMUV）、禽腺病毒4型（FAdV-4）、鸭瘟病毒（DEV）等。本研究对以上常见的病毒从病原学、流行病学、临床症状及病理变化等方面进行了介绍,并对临床上这些病毒常见的检测方法及其优缺点进行了比较;同时本研究开发了基于核酸检测技术PCR检测方法,并将该技术应用于鸭病毒的检测,对临床上鸭病的检测与防控具有重要意义。试验一、七种鸭病毒单重PCR检测方法的建立本实验针对临床上鸭易感的7种病毒病,在GenBank下载各自的毒株序列进行比对,在其保守基因的保守区设计7对特异性引物,然后对单重PCR方法进行特异性、敏感性和重复性试验验证。结果显示本方法特异性强,重复性好。FAdV和DHAV的检测限为 1×103copies/μL,DEV、DTMUV、NDV和GPV 的检测限为 1×102 copies/μL,AIV的检测限为1×101 copies/μL,敏感性较高。试验二、七种鸭病毒的多重PCR检测方法的建立在单重PCR的基础上,通过优化不同的引物组合及引物的浓度、退火温度、镁离子浓度、酶和dNTP浓度等条件,我们又建立了多重PCR方法同时检测这7种鸭病毒。结果显示,最优的Mg2+浓度为4 mM,最优的Taq酶浓度为0.05 U/μL,最优的dNTP浓度为0.32mM,最优的退火温度为57℃。特异性试验显示,这7对引物对其他病原无特异性扩增;多重方法的敏感性达到1×104 copies/μL,基本满足临床检测要求;本方法的重复性良好;同时建立了共感染模型,对临床样品的检出率为18%,结果与单重PCR的结果一致。试验三、三种鸭病毒的多重Real-time PCR检测方法的建立本实验在传统PCR的基础上开发了多重Real-time PCR方法同时检测3种鸭病毒。结果表明,该多重Real-time PCR方法具有高度的特异性;AIV和NDV的检测限为1×103 copies/μL,DTMUV的检测限为1×102 copies/μL;批内差的变异系数（CV）小于2%,批间差CV值小于5%,说明该方法重复性较好。
陆勤勤[5]（2019）在《2018年我国部分地区H9N2禽流感流行病学调查及HA基因遗传进化分析》文中研究指明H9N2亚型禽流感是一种低致病性禽流感,具有流行时间长、传播范围广、感染宿主种类多等特点。自我国在1992年首次分离到该病毒以来,在数十年间已经传播至我国大部分地区。H9N2亚型禽流感病毒主要危害各种禽类,我国家禽养殖数量庞大,该病毒在我国的流行对家禽养殖业造成了严重的经济损失。H9N2也被证实具有感染人类的能力,这对人类的身体健康和公共卫生安全也造成很大威胁。值得注意的是,H5N1、H7N9等亚型禽流感病毒形成或与H9N2的传播密切相关,有研究表明H7N9有6个基因片段来自H9N2,因此H9N2在重0组过程中作为基因供体对新亚型毒株的出现起着关键作用。本文对我国部分地区H9N2亚型禽流感进行流行病学调查,并对相关毒株进行进化树构建,对H9亚型HA基因进行遗传亲缘关系鉴定,为更好防控禽流感的发生提供应用基础研究。试验一 2018年我国部分地区H9N2亚型禽流感流行病学调查2018年上半年（3-5月）和下半年（10-12月）分别进行了两次流行病学调查。上半年在我国11个省份67个场点,随机采集4792份咽喉/泄殖腔拭子样品,检测出H9N2亚型阳性样品1208份,样品总阳性率为25.21%（1208/4792）,场点总阳性率为80.60%（54/67）。另外,检测出鸡阳性样品1090份,鸭阳性样品86份,鹅阳性样品2份,鸽阳性样品30份,各宿主样品阳性率分别为29.18%（1090/3736）、12.23%（86/703）、1.53%（2/131）、13.51%（30/222）。2018年下半年,检测出H9N2亚型阳性样品995份,样品总阳性率为24.14%（995/4122）,在68个场点中51个为阳性,场点总阳性率为75.00%（51/68）。另外,检测出鸡阳性样品813份,鸭阳性样品100份,鹅阳性样品6份,鸽阳性样品76份,各宿主样品阳性率分别为 25.89%（813/3140）、16.23%（100/616）、10.34%（6/58）、25.50%（76/298）。通过淘宝网从13省（直辖市）购买的220只家禽中,未检测出禽流感病毒。试验二2008-2018年H9N2亚型禽流感流行病学统计分析本文对2008至2018年间的H9N2亚型禽流感的流行病学结果进行统计,在十年间采集上海、江苏、湖北、广东、黑龙江、云南、西藏等多个地区的来自各大养殖场、市场、屠宰场以及散养农户家禽的咽肛拭子样品和血清样品以及环境样品,共计采样22次,样品总数为122611份。结果显示:①从2008上半年至2018下半年,H9N2亚型禽流感检测的总体样品阳性率从0.47%增加至24.14%,总体样品阳性率增加了 51.36倍,表明2008年至2018年间H9N2的感染情况总体呈上升趋势,相应的,省份阳性率从2008年的25%到2018年的90%,增加了 3.6倍,此外,总场点阳性率也从2008年的3.33%增加到2018年的75%,增加了 22.52倍,可以说近十年来H9N2亚型禽流感在我国的增殖和扩散速度十分迅猛;②我们通过分析场点阳性率的分布,发现所有场点几乎都呈现H9N2亚型禽流感阳性,覆盖范围十分广泛,其中值得注意的是不论是活禽批发市场还是活禽零售市场,其阳性率均显着高于其他场点,并且近年来有逐渐升高的趋势,批发市场与零售市场相比,2016年之前零售市场的样品阳性率较高,2016年之后批发市场的阳性率开始显着升高;③本研究通过分析H9N2亚型禽流感病毒在各宿主体内的阳性率分布情况,发现鸡在所有宿主中阳性率常年处于较高水平,此外,水禽和鸽子的感染率在2017年之后出现了幅度较大的增高趋势,并在2018年下半年达到历史最高值。试验三 2008-2018年H9亚型HA基因遗传进化分析本次研究共计获得6771条H9亚型HA基因序列,利用MEGA软件对序列进行比对和遗传进化分析,结果显示2008-2018年间检测出h9.4.2.6分支129条,h9.4.2.5分支6610条,h9.4.2.4分支9条,h9.4.1.2分支20条,以及h9.3.3.2分支3条。在h9.4.2.5分支中,鸡、鸭、鹅、鸽、野鸟均出现阳性,其中以鸡的阳性率最高,占总数的88.31%（5837/6610）,说明h9.4.2.5分支可能对鸡有亲嗜性。随着时间的推移,H9N2病毒也在不断地进化,进化树的发展趋势表明2013-2018年分离的毒株与2008-2012年分离的毒株相比产生了较大的差异,这意味着,近年来流行分支虽没有改变,但其内部毒株之间仍然不断发生着重组和变异,随着遗传距离的加大,未来很可能出现新的分支取代 h9.4.2.5。
李祥[6]（2019）在《2013-2018年黑龙江兴凯湖地区野鸟禽流感病毒监测与进化分析》文中认为野鸟是禽流感病毒（Avian Influence Virus,AIV）的自然宿主,在野鸟中可以监测到几乎所有亚型（H1-H16,N1-N9）的禽流感病毒。候鸟,特别是迁徙水禽,在迁徙过程中能够携带并跨国境甚至跨大陆传播禽流感病毒,并且其与迁徙路径上的家禽接触后能够获得家禽源禽流感病毒基因,这加速了禽流感病毒的传播扩散与重排、丰富了禽流感病毒的遗传多样性。在兴凯湖地区开展野鸟禽流感病毒监测研究,能够深入了解候鸟中禽流感病毒基因库的“丰度”,并探究候鸟携带禽流感病毒传播的规律,对于做好禽流感病毒的防控有着十分重要的意义。本研究于2013年9月至2018年10月在黑龙江兴凯湖地区进行野鸟禽流感病毒的监测研究,一方面调查了解了兴凯湖地区野鸟携带禽流感病毒的亚型分布情况;另一方面对禽流感分离株进行了遗传进化分析。2013年9月至2018年10月,在春季和秋季候鸟迁徙时间段内,在黑龙江兴凯湖地区共采集野生水禽样品3767份,其中新鲜粪便样品3309份,咽肛拭子438份,脏器20份。通过SPF鸡胚进行AIV的分离,对收获的尿囊液用血凝试验初步检测AIV,最后用RT-PCR进行病毒鉴定和亚型测定,检测结果显示有29份样品呈AIV阳性,AIV总体分离率为0.77%。亚型鉴定结果显示,共分离1株H3N3、1株H3N5、1株H3N8、2株 H4N6、1 株 H5N2、11 株 H5N6、1 株 H6N6、1 株 H5N8、1 株 H10N7 和 9 株H16N3。病毒分离结果显示,秋季禽流感病毒的分离率高于春季;咽肛拭子样品中AIV阳性率远远高于粪便样品和脏器样品。23株分离株的HA裂解位点分析结果表明,11株H5N6分离株和1株H5N8分离株符合高致病性禽流感的典型分子特征:另外,3株H16N3分离株HA蛋白发生了G228S的氨基酸突变,这增强了病毒结合α-2,6受体（哺乳动物）的能力,提示它们有感染人的潜质。NA关键氨基酸位点比较分析结果表明,11株H5N6分离株出现了颈部氨基酸的缺失,这增强了对小鼠的致病性。外部基因的遗传进化结果显示,兴凯湖地区野生水禽中禽流感病毒不同亚型之间有着一定的基因重排现象。内部基因的遗传进化结果显示,黑龙江地区野生水禽中禽流感病毒内部基因有着丰富的来源,与亚洲、欧洲甚至是北美洲的多个国家和地区间的禽流感病毒间有着广泛而频繁的基因交流。本研究分离株大部分基因片段与蒙古、韩国和日本地区的分离株有着十分相近的亲缘关系,这说明在兴凯湖、蒙古、韩国和日本之间的禽流感病毒存在着频繁的基因交流与交换。BG/LX-97/14（H3N3）分离株从已获得的7个基因片段看（未获得NA基因序列）,是多来源重组毒株,其PB2基因来源于日本/韩国的野生水禽源毒株,PB1、PA1和H3基因来源于日本/韩国家禽源毒株,而NP、M和NS基因来源于北美洲阿拉斯加野生水禽源毒株,由此推测野生水禽可以携带北美源禽流感病毒跨越白令海峡造成的地理隔离传播至欧亚大陆,禽流感病毒跨大陆传播的现象同样在BG/JHM-133/15（H3N8）的N8基因、3株H16N3分离株的PB2基因上被监测到,阿拉斯加和兴凯湖很可能是北美大陆和欧亚大陆之间禽流感病毒传播和基因扩散的重要站点。遗传进化分析和系统地理发生学分析结果表明,2016-2017年中国兴凯湖、韩国、日本地区监测到的H5N6亚型禽流感病毒全基因组具有极为相近的亲缘关系,具有相同的进化来源。结合候鸟卫星跟踪数据,推测兴凯湖地区作为此次H5N6亚型禽流感病毒扩散的起源,由野鸟携带传播至韩国和日本。另外,2017-2018年冬季越南地区的家禽中同样监测到了 H5N6亚型禽流感病毒,其中有一部分毒株也是起源于兴凯湖地区。
梅敏敏[7]（2018）在《N-MDRV广东株致病性、序列分析及σB蛋白的原核表达》文中认为近年来在福建、广东、浙江等地皆有新致病型番鸭呼肠孤病毒（New pathotype of muscovy duck reovirus,N-MDRV）病的报道;该病俗称“番鸭新肝病”,主要剖检病变为肝脏不规则坏死、出血;患病鸭日龄愈小,病死率愈高,给养鸭业造成严重的经济损失。目前,有关广东省N-MDRV的致病性及遗传进化分析方面的研究较少。σB蛋白作为N-MDRV主要的外衣壳蛋白,有良好的免疫原性和反应原性。本研究旨在对广东省N-MDRV/SH12和N-MDRV/DH13流行毒株的致病性、全基因序列进行比较分析,同时对N-MDRV/DH13株σB蛋白的原核高效表达进行初步研究。本研究将N-MDRV/SH12、N-MDRV/DH13株均以104.00.00 ELD50的剂量经眼鼻、肌注、爪垫途径分别感染1日龄雏番鸭,N-MDRV/SH12攻毒组死亡率在10%20%之间,N-MDRV/DH13攻毒组死亡率均为30%。为进一步研究N-MDRV对雏番鸭和雏鸡的致病性差异,将N-MDRV/SH12和N-MDRV/DH13株分别肌注感染1日龄雏番鸭和雏鸡。结果显示:2株病毒感染雏番鸭3 d后饮食能力下降,有轻微腹泻;感染7 d后临床症状明显,患病鸭剖检病变为肝脏大范围坏死、出血,脾脏肿大、坏死,法氏囊萎缩（N-MDRV/SH12组）或坏死出血（N-MDRV/DH13组）,N-MDRV/SH12组感染14 d后雏番鸭体重显着下降（P<0.01）。而N-MDRV/SH12和N-MDRV/DH13株感染雏鸡,均不能致死,部分患病鸡感染3 d后饮食能力下降,被毛疏松,N-MDRV/SH12组感染14 d后雏鸡体重显着下降（P<0.05）;患病鸡剖检可见肝脏、脾脏病变类似于“番鸭新肝病”,但法氏囊眼观无明显病变。病理组织切片显示:雏番鸭感染7 d后,肝脏、脾脏、法氏囊坏死灶内有大量红细胞和单核细胞浸润,脾脏、法氏囊的淋巴细胞坏死、减少,感染后期脾脏可见肉芽肿结构。以上结果表明,N-MDRV/SH12和N-MDRV/DH13株感染雏番鸭和雏鸡的致病性不同,但均可感染雏番鸭和雏鸡的肝脏、脾脏。为研究N-MDRV不同致病性毒株基因组结构特点及遗传进化关系,利用RT-PCR方法对N-MDRV/SH12、N-MDRV/DH13株全基因组序列进行扩增和测序。结果显示:2株病毒间各基因片段核苷酸和氨基酸序列相似性较高,分别为97.1%99.8%和97.5%100.0%;与GenBank中N-MDRV、DRV、GRV参考毒株核苷酸和氨基酸序列相似性亦较高,分别为86.3%99.6%和93.3%100%。σC蛋白基因序列相似性及遗传进化树的分析结果均显示,相邻地区的基因2型毒株其遗传关系更近。σA、σB、σNS、μA蛋白变异位点有一定规律性;有共同变异位点的病毒株,其蛋白基因序列相似性和遗传进化树分析的结果均显示,该类病毒株遗传关系更近。除μB蛋白基因外,其他9个蛋白基因片段序列相似性和遗传进化分析结果均显示,水禽源呼肠孤病毒间亲缘关系较近,与鸡源ARV亲缘关系较远;经SimPlot重组软件分析这可能是基因2型的μB蛋白基因片段来源于ARV和ARV-Md基因重组的结果。以上结果表明,N-MDRV/SH12、N-MDRV/DH13株均属于水禽呼肠孤病毒基因2型,且两者遗传演化关系较同分支的其他基因2型毒株更为相近。病毒株各蛋白氨基酸位点差异有可能会导致病毒致病性的不同。比较2株病毒和10株基因2型参考毒株各蛋白氨基酸变异位点及其潜在糖基化位点发现,除了λB蛋白外,其他蛋白的潜在糖基化位点因氨基酸位点变异有所变化;σNS蛋白109、270位点的变异使得N-MDRV/SH12、N-MDRV/DH13株蛋白在pH 7.0时带不同电荷;2株病毒σC、σB蛋白单个氨基酸位点的变异对蛋白预测抗原表位几乎没有影响,但蛋白抗原表位不局限于疏水性。以上结果仅对N-MDRV各蛋白氨基酸位点进行了初步分析,其位点的变异是否与毒株致病性相关,还需得到毒株蛋白进一步验证。为探究N-MDRV中与致病性相关的σB蛋白原核高效表达,本研究选择优化致病性较强的N-MDRV/DH13σB蛋白基因密码子,构建的pET-32a（+）-σB-BL21（DE3）原核表达重组菌经IPTG诱导后表达出σB蛋白。在最佳的诱导条件下获得σB蛋白的表达量占细菌总蛋白量的32.3%,经SDS-PAGE分析发现σB重组蛋白主要以包涵体形式存在。再经Ni2+柱纯化获得高纯度可溶性的σB蛋白,Western blotting分析显示该蛋白具良好的反应原性。本研究为N-MDRVσB蛋白基因疫苗、诊断试剂盒的研制奠定基础。
王茹[8]（2019）在《禽呼肠孤病毒疫苗株筛选及免疫原性分析》文中提出禽呼肠孤病毒（avian reovirus,ARV）是引起禽类常见传染病鸡病毒性关节炎的主要病原。近年来该病在我国呈上升趋势发展,毒株变异性大,传统疫苗株对其保护效果不理想,影响了我国养禽业的发展。本试验对2017年下半年至2018年上半年期间自山东、河南、河北、辽宁等地家禽养殖场采集的疑似呼肠孤感染鸡的组织病料进行病原分离,经RT-PCR、FA、EM等方法对所分离到的ARV毒株进行生物学特性研究,探究了 ARV分离株的血凝性及其致病性,通过动物回归试验,比较各分离毒株毒力强弱和攻毒后排毒期,通过免疫保护试验验证传统疫苗株对新分离毒株保护效果,试验验证各分离株的理化特性。综合试验结果从分离株中筛选疫苗株,经CEF细胞增殖病毒液,制备油乳灭活疫苗。将筛选的疫苗株与传统疫苗株对比,采用SPF鸡进行免疫攻毒保护试验,从免疫后抗体水平、攻毒保护试验结果对2株病毒的免疫原性进行了分析评价。1 ARV的分离鉴定及生物学特性研究从组织病料中成功分离出6株ARV,试验结果显示,各毒株均无血凝性,EM观察病毒粒子大小约为70～80 nm左右;分离毒株与ARV单抗反应均呈现强阳性信号;各分离毒株在LMH、CEF细胞上均可增殖,但LMH细胞对其更为敏感;动物回归试验中,各分离株攻毒后均可引起受试鸡出现发病症状,但呈现出的毒力强弱不同;通过采集泄殖腔拭子检测部分分离株攻毒后排毒情况,结果显示,在攻毒24h后即可从粪便中检测到感染性病毒粒子,攻毒后首周是病毒粒子脱落的高峰期,第2周粪便排毒量明显减少,部分毒株粪便排毒期可持续2周以上:理化检测结果显示,各毒株对氯仿不敏感,对胰酶轻度敏感,耐热性较好,50℃处理1h对各毒株病毒滴度无显着影响,各项理化特征符合ARV特性;免疫保护试验结果显示,传统疫苗对6株ARV分离株均无法产生完全保护。同时,相较于其它毒株,分离毒株RPVA1306和RPVA1307免疫组与对照组发病情况差异较小且发病情况更为严重更具研究和应用价值。该结果验证了分离株的致病性,丰富了 ARV毒种库,证实了传统疫苗对新分离毒株无法起到理想的保护作用,为ARV新疫苗的研发提供了理论依据。2 ARV灭活疫苗的制备及免疫原性分析目前,国内外市场上已有多种ARV疫苗应用于ARV的预防,但临床上病毒性关节炎的发生率仍居高不下。本试验通过测定ARV各分离毒株的TCID50和ELD50,结合动物回归及免疫保护试验结果,筛选出2株毒力较强毒株RPVA1306和RPVA1307,经细胞增殖,制备油乳灭活疫苗。与传统疫苗株对比,采用自制疫苗进行免疫攻毒保护试验,免疫后从抗体水平、攻毒保护试验结果对2株病毒的免疫原性进行分析评价。试验结果表明,2株分离株对原毒株保护效果最佳,其中RPVA1306对2种分离株保护率均能达到80%以上,免疫效果较为理想。
谭华龙[9]（2017）在《12株NDV F/HN基因分析及鸭源毒株生物学特性测定》文中研究说明新城疫是由NDV引起禽呼吸道、消化道黏膜严重出血的一种传染病,是目前养禽业极为重视的传染病之一。近年来我国水禽感染NDV的病例报道越来越多,而且水禽感染NDV已经表现出新的流行特点,临床症状不再局限于一般的生产能力下降,感染NDV的水禽发病率、死亡率正在逐渐升高,并以逐年增加的趋势向全国大部分区域蔓延,使得对NDV流行动态作研究分析十分必要。本研究对1997-2016年期间从广东佛山、肇庆、云浮等地疑似患新城疫家禽病料分离鉴定获得的12株NDV,采用RT-PCR方法对12株NDV的F基因和HN基因扩增,扩增产物经克隆并测序后与GenBank数据库中的参考毒株作遗传进化和同源性分析,并对1株番鸭源NDV作了较为系统的生物特性测定,为今后的诊断与免疫防控研究提供更多详细的参考资料。F基因遗传进化分析结果显示:（1）12株分离株中有9株属于基因Ⅶ型,这9株病毒来源禽种覆盖鸡、鸭和鹅,来源地域覆盖广东省4个地级市的6个县级市,来源时间覆盖最初的1997年至最近的2016年。提示,近20年来,基因Ⅶ型可能一直是广东各地、各种禽NDV流行的优势基因型,且自2007年以来,水禽NDV分离率有明显增高;（2）1株来自1997年病鸡的毒株（CK/FS-SS/N/1997株）和1株来自2014年病鸭的毒株（MDK/FS-SS/485/2014株）属于基因Ⅸ型,其来源均为佛山市三水区,提示,基因Ⅸ型一直存在流行的威胁,已经由鸡向水禽传染（或由水禽向鸡传染）,但传播流行速度尚较缓慢,具有一定的区域局限性;（3）鸽源PG/GZ-HD/PN/2011株属于基因Ⅵ型,与国内外鸽源分离株所属基因型一致。F基因和HN基因相似性分析结果显示:（1）12株毒株与参考毒株间的相似性存在较大的差异,所有分离株与目前使用的疫苗株LaSota、B1、Mukteswar和Clone30的相似性在80.9%91.9%之间;（2）2株基因Ⅸ型毒株与传统强毒株F48E8的相似性高于99%,推测2株毒株为F48E8株的亲缘性较近;（3）12株毒株间相似性的差异较大,9株基因Ⅶ型的毒株中的5株鹅源毒株和1株鸭源毒株之间的相似性高于97%,但与其他3株Ⅶ型病毒（MDK/FS-SS/E/2007、WDK/FS-NH/A/2006和CK/YF-LD/L/1997）之间的相似性仅在83.4%87.8%之间。提示,本省流行的基因型相同的毒株之间存在基因亚型的差异。NDV的F基因与HN基因推导的氨基酸序列分析结果显示,12株分离株与NDV强毒株的氨基酸特征相符,有10株病毒的HN基因第514氨基酸残基出现I→V的变异,有9株分离株的F基因和HN基因的中和抗原位点出现变异。另外,2011年后分离的7株毒株中,有6株毒株的HN基因第347氨基酸残基出现E→D。由此推测,当前广东地区大部分的分离株与传统疫苗株之间存在抗原性差异,这可能是目前大部分禽群对于NDV免疫失败的原因之一。本研究对鸭源NDV（MDK/FS-SS/E/2007）的生物特性测定结果显示,该毒株对鸭胚半数致死量为10-8.668/0.1 mL,MDT为75.2 h,ICPI为1.725和IVPI为2.48,均与NDV强毒标准相符。MDK/FS-SS/E/2007株对雏鸭和雏鹅的人工感染试验结果显示,感染雏鸭和雏鹅出现精神沉郁,瘫痪和扭颈等神经症状,剖检可见脑部充血、出血,胰腺、脾脏和肝脏等器官出现变性坏死,其临床症状与病理变化都呈现典型新城疫的特征。另外,利用MDK/FS-SS/E/2007株制备成灭活油乳疫苗免疫雏番鸭,结果表明,对番鸭于1、2、3周龄进行三次免疫后,HI抗体水平均值在第7周龄达到8log2,用约105个ELD50病毒液攻击番鸭,番鸭保护率达100%。提示本毒株对番鸭具有良好的免疫原性和免疫保护效果。另外,本题尚对该毒株的F蛋白进行了表达,并利用抗His标签鼠单克隆抗体对产物进行了Western blot验证,显示在53 kDa位置只有一条清晰的蛋白印迹,可为制备针对F基因的单克隆抗体和诊断水禽源新城疫病提供参考,也为研究相关基因工程疫苗打下了一定基础。
张凯[10]（2016）在《H9N2亚型禽流感的流行病学调查及H9N2亚型禽流感病毒对番鸭致病性研究》文中研究说明H9N2亚型禽流感病毒呈现世界性分布,在各种鸟类以及家禽体内均有分离,并有人类感染的事件发生,因此对于H9N2亚型禽流感的研究具有重要的经济意义和公共卫生学意义。自1994年在首次分离以来,H9N2亚型禽流感病毒在我国广泛分布,是我国养禽业中常见的病原体之一。近年来,随着我国养鸭业快速发展,家鸭上也不断分离出H9N2亚型禽流感病毒。本研究从2015年6月至2016年3月通过病毒分离、鉴定和序列分析以及血清学手段对H9N2亚型禽流感流行病学调查,及时掌握H9N2亚型禽流感病毒的最新变异情况和我国南方部分地区番鸭H9N2亚型禽流感感染情况。本次共分离到H9N2亚型禽流感毒株24株,包括20株鸡源H9N2亚型禽流感毒株和4株鸭源H9N2亚型型禽流感毒株。结果表明:分离株均属于以Y280株为代表的h9.4.2分支。分离株HA基因之间的核苷酸同源性在94.0%-99.9%之间,与国内商品疫苗株SS94株、F98株和6/96株的同源性分别在89.4%-90.7%,88.1%-89.2%和88.6%-90.0%之间。本研究测定的24株H9N2亚型禽流感病毒的HA蛋白质的裂解位点附近的氨基酸序列均为PSRSSR↓GLF,符合低致病力禽流感的特征。番鸭H9抗体血清学调查发现,2015年6月至2016年2月番鸭H9抗体阳性率在1.51%-5.54%之间,平均阳性率为3.2%,其中6月份阳性率最高为5.54%,7月份阳性率最低为1.51%。利用来自鸡源分离毒株A/Chicken/Guangdong/2015/Ch1和鸭源分离株A/Duck/Shandong/2015/SDQ和A/Duck/Shandong/2015/SD5,研究H9N2亚型禽流感病毒对雏番鸭以及产蛋番鸭致病性。研究结果表明:不同宿主来源的H9N2亚型禽流感毒株均能感染雏番鸭,感染后雏番鸭排毒量和排毒期存在差异。雏番鸭在不同的人工感染方式感染H9N2亚型禽流感病毒后,肺部组织均有不同程度的损伤,静脉注射组的鸭子肺部损伤相对其他三个试验组较为严重。H9N2禽流感病毒人工感染后各试验组雏番鸭体内免疫相关细胞因子的mRNA表达量存在差异,表明H9N2禽流感病毒人工感染后会影响雏番鸭体内免疫动态平衡。产蛋番鸭通过腿肌注射的方式感染H9N2亚型禽流感病毒后,产蛋率未出现明显下降,感染后的产蛋番鸭H9抗体全部转阳,表明单一的H9N2感染并不会使得产蛋番鸭的产蛋性能下降。此外,通过H9N2亚型禽流感和鸭疫里默氏杆菌协同感染发现,H9N2禽流感病毒感染会使得鸭子早期死亡率上升,表明H9N2禽流感病毒会造成雏番鸭抵抗力下降。在H9N2感染后免疫番鸭细小病毒弱毒苗和呼肠孤弱毒疫苗后,我们发现单独免疫组的抗体水平要高于H9N2感染后免疫组,表明H9N2感染会影响疫苗的免疫后的抗体水平。以上分析表明H9N2在人工感染条件下,会造成雏番鸭的免疫抑制,影响雏番鸭对病原的抵抗力和疫苗免疫效果。
二、禽流感病毒番鸭分离株对不同禽类致病性的研究（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、禽流感病毒番鸭分离株对不同禽类致病性的研究（论文提纲范文）
（1）候鸟禽流感病毒遗传变异规律分析及在哺乳动物间传播机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 引言 |
| 第一篇 文献综述 |
| 第一章 流感病毒病原学 |
| 1.1 流感病毒概述 |
| 1.2 流感病毒病原生态学特点 |
| 第二章 流感病毒受体 |
| 2.1 流感病毒受体概述 |
| 2.2 唾液酸的结构及种类 |
| 2.3 不同动物唾液酸受体的异质性 |
| 2.4 不同物种间流感病毒唾液酸受体的分布 |
| 2.5 病毒结合不同唾液酸受体的分子机制 |
| 2.6 流感病毒唾液酸受体研究方法 |
| 第三章 禽流感病毒跨种传播 |
| 3.1 禽流感病毒跨种传播的发生 |
| 3.2 影响禽流感病毒跨种传播的病原因素-基因突变 |
| 3.3 影响禽流感病毒跨种传播的病原因素-基因重组 |
| 第二篇 研究内容 |
| 第一章 中国东部地区候鸟禽流感流行病学调查研究 |
| 1.1 材料与方法 |
| 1.1.1 实验用鸡胚和细胞 |
| 1.1.2 主要试剂 |
| 1.1.3 主要仪器 |
| 1.1.4 样品采集 |
| 1.1.5 禽流感病毒分离 |
| 1.1.6 禽流感病毒RNA的提取 |
| 1.1.7 禽流感病毒高通量测序 |
| 1.1.8 候鸟禽流感病毒抗体检测 |
| 1.2 结果 |
| 1.2.1 样品采集及毒株分离情况 |
| 1.2.2 候鸟AIVs亚型多样性和宿主特异性 |
| 1.2.3 H9N2 禽流感病毒在候鸟中流行的血清学调查 |
| 1.2.4 2020 年候鸟H5N8 禽流感病毒检测及抗原性分析 |
| 1.3 讨论 |
| 1.4 小结 |
| 第二章 中国东部候鸟禽流感病毒遗传进化分析 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 实验用毒株 |
| 2.1.2 候鸟源禽流感病毒基因组收集及比对 |
| 2.1.3 系统发生分析 |
| 2.1.4 进化动力学的空间系统发育重建 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 候鸟源禽流感病毒遗传变异分析 |
| 2.2.2 候鸟源H9N2 禽流感病毒遗传进化分析 |
| 2.2.3 候鸟源H3N8 禽流感病毒遗传进化分析 |
| 2.2.4 候鸟源H13 亚型禽流感病毒遗传变异分析 |
| 2.2.5 候鸟源H5N8 禽流感病毒遗传变异分析 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 中国东部候鸟禽流感病毒分离株受体结合特性研究 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 实验用毒株 |
| 3.1.2 主要试剂 |
| 3.1.3 主要仪器 |
| 3.1.4 红细胞法检测禽流感病毒受体 |
| 3.1.5 糖芯片法检测禽流感病毒受体 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 候鸟禽流感病毒红细胞法受体测定 |
| 3.2.2 候鸟禽流感病毒糖芯片法受体测定 |
| 3.2.3 候鸟禽流感病毒结合聚糖结构分析 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 第四章 候鸟禽流感病毒在哺乳动物间跨种传播能力评估 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 实验用毒株 |
| 4.1.2 实验用动物 |
| 4.1.3 主要试剂 |
| 4.1.4 主要仪器 |
| 4.1.5 小鼠致病性实验 |
| 4.1.6 豚鼠间传播实验 |
| 4.1.7 雪貂间呼吸道飞沫传播实验 |
| 4.2 结果 |
| 4.2.1 候鸟H9N2 亚型禽流感病毒小鼠致病性 |
| 4.2.2 候鸟H9N2 亚型禽流感病毒豚鼠间传播 |
| 4.2.3 候鸟H9N2 亚型禽流感病毒雪貂间传播 |
| 4.2.4 候鸟H5N8 禽流感病毒小鼠致病性 |
| 4.2.5 候鸟H5N8 禽流感病毒豚鼠间传播 |
| 4.2.6 候鸟H3 亚型禽流感病毒豚鼠间传播 |
| 4.2.7 候鸟T222 分离株及豚鼠适应一代毒株雪貂间呼吸道飞沫传播 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 小结 |
| 第五章 候鸟源H3N8 禽流感病毒在哺乳间传播的分子机制研究 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 实验用毒株、细胞及载体 |
| 5.1.2 实验用动物 |
| 5.1.3 主要试剂 |
| 5.1.4 主要仪器 |
| 5.1.5 候鸟源H3N8 流感病毒野毒株RNA提取 |
| 5.1.6 候鸟源H3N8 流感病毒野毒株c DNA制备 |
| 5.1.7 候鸟源H3N8 流感病毒野毒株全基因组及载体扩增 |
| 5.1.8 候鸟源H3N8 流感病毒野毒株感染性克隆的构建 |
| 5.1.9 候鸟源H3N8 禽流感病毒及其突变株的体外拯救 |
| 5.1.10 流感病毒聚合酶活性检测 |
| 5.1.11 病毒滴定和复制动力学测定 |
| 5.1.12 动物实验 |
| 5.1.13 雪貂适应1 代毒株测序 |
| 5.1.14 雪貂适应1 代毒及受体结合能力检测 |
| 5.1.15 病理及组化 |
| 5.1.16 统计分析 |
| 5.2 结果 |
| 5.2.1 T222 毒株及T222-G1 毒株氨基酸差异比对 |
| 5.2.2 rT222-wild及 rT222-S524G突变株拯救 |
| 5.2.3 rT222-wild及 rT222-S524G豚鼠间传播 |
| 5.2.4 rT222-wild及 rT222-S524G雪貂间呼吸道飞沫传播 |
| 5.2.5 rT222-wild及 rT222-S524G雪貂间传播变异分析 |
| 5.2.6 雪貂适应1 代毒株受体结合检测 |
| 5.2.7 PB1-S524G增强了病毒聚合酶活性 |
| 5.2.8 PB1-S524G增强了H3N8 禽流感病毒的体外复制能力 |
| 5.2.9 PB1-S524G增强了H3N8 禽流感病毒的体内复制能力 |
| 5.2.10 PB1-S524G增强了H3N8 禽流感病毒对小鼠的致病性 |
| 5.2.11 PB1-S524G增加了H3N8 禽流感病毒对雪貂的致病性 |
| 5.3 讨论 |
| 5.4 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 导师简介 |
| 作者简介 |
| 学位期间取得的科研成果 |
| 致谢 |
（2）分离株FAdV-4致病性和诱导细胞产生免疫因子特性的初步研究（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩写词表 |
| 文献综述 |
| 引言 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 主要仪器和材料 |
| 1.1.1 主要试剂 |
| 1.1.2 主要仪器设备 |
| 1.1.3 主要病料和实验动物来源 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 病变组织的处理和病毒核酸的提取 |
| 1.2.1.1 病变鸡肝脏的处理和鸡胚接种 |
| 1.2.1.2 病毒DNA的提取 |
| 1.2.1.3 病毒RNA的提取和反转录 |
| 1.2.2 病毒的特异性鉴定 |
| 1.2.3 编码病毒主要结构蛋白Hexon、Fiber2 基因的扩增与分析 |
| 1.2.4 病毒血凝性鉴定 |
| 1.2.5 病毒感染原代肾细胞的显微镜观察 |
| 1.2.6 病毒TCID_(50)的鉴定 |
| 1.2.7 病毒对动物致病力鉴定 |
| 1.2.8 RT-PCR鉴定病毒感染原代肾细胞后干扰素、抗原提呈分子及其相关通路基因的表达 |
| 1.2.8.1 病毒接种原代肾细胞 |
| 1.2.8.2 病毒感染后细胞DNA和 RNA的提取 |
| 1.2.8.3 引物设计及实时荧光(RT-PCR)反应 |
| 1.2.9 抑制NF-κB途径对相关因子的表达 |
| 1.2.9.1 PDTC抑制剂抑制NF-κB的表达 |
| 1.2.9.2 使用实时荧光RT-PCR检测相关因子的表达 |
| 1.2.10 FAdV-4 主要结构蛋白Fiber2 重组质粒的构建和鉴定 |
| 1.2.10.1 Fiber2 基因片段的PCR扩增 |
| 1.2.10.2 目的基因和空质粒的双酶切 |
| 1.2.10.3 目的片段与载体的连接转化 |
| 1.2.11 FAdV-4 Fiber2 蛋白的表达和鉴定 |
| 1.2.11.1 真核重组质粒在细胞内的表达和鉴定 |
| 1.2.11.2 激光共聚焦技术检测真核重组质粒与膜蛋白质粒在细胞内共定位 |
| 1.2.11.3 原核蛋白的表达、纯化和鉴定 |
| 2 结果 |
| 2.1 禽腺病毒分离与鉴定 |
| 2.1.1 本研究所分离到的病毒为Ⅰ群 C亚群的FAdV-4 |
| 2.1.2 本次接种的病毒对鸡胚有明显病变,无血凝特性 |
| 2.2 分离株的致病性鉴定 |
| 2.2.1 分离株TCID_(50)的测定 |
| 2.2.2 分离株感染原代肾细胞病变观察 |
| 2.2.3 动物的致病性试验 |
| 2.3 FAdV-4 感染诱导细胞产生IFN-β和 IFN-γ的信号通路 |
| 2.4 FAdV-4 感染对细胞表达MHCIa、MHCIIβ和 Ii基因的影响 |
| 2.5 FAdV-4 Fiber2 蛋白细胞内定位于细胞核 |
| 2.5.1 Fiber2在细胞内定位分析 |
| 2.5.2 Fiber2在细胞内蛋白表达鉴定 |
| 2.6 Fiber2蛋白原核表达和鉴定 |
| 2.6.1 His-Fiber2 蛋白的表达 |
| 2.6.2 His-Fiber2 原核蛋白的鉴定 |
| 3 讨论 |
| 3.1 分离株为高致病性的FAdV-4 |
| 3.2 机体细胞通过不同途径抵御病毒的侵染 |
| 3.3 FAdV-4主要结构蛋白的定位分析及表达 |
| 4 结论 |
| 参考文献 |
（3）H9N2亚型禽流感病毒株遗传演化分析及HA和NA基因核酸标准品的研制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 中英缩写词表 |
| 前言 |
| 第一篇 文献综述 H9N2亚型禽流感病毒概述 |
| 1.1 H9N2 亚型流感病毒的流行病学调查 |
| 1.2 H9N2 亚型禽流感病毒流行及变异情况 |
| 1.3 H9N2 亚型禽流感病毒的危害 |
| 1.4 H9N2 亚型禽流感病毒的诊断技术 |
| 1.5 核酸标准物质的研究进展 |
| 第二篇 研究内容 |
| 第一章 18株H9N2 亚型禽流感病毒分离株分子流行趋势的研究 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 1.3 结果 |
| 1.4 讨论 |
| 1.5 小结 |
| 第二章 H9N2 亚型禽流感病毒HA基因不同分支特异荧光方法的建立 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.2 方法 |
| 2.3 结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 H9N2 亚型禽流感病毒HA基因和NA基因标准品的研制 |
| 3.1 试验材料 |
| 3.2 方法 |
| 3.3 结果 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 作者简介 |
| 致谢 |
（4）鸭易感病毒检测方法的建立与应用研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词 |
| 第一篇 文献综述 |
| 第一章 鸭病毒病的研究进展 |
| 1 常见鸭病毒病的概述 |
| 1.1 禽流感病毒的研究进展 |
| 1.2 新城疫病毒的研究进展 |
| 1.3 鸭肝炎病毒的研究进展 |
| 1.4 鸭坦布苏病毒的研究进展 |
| 1.5 鹅细小病毒的研究进展 |
| 1.6 禽腺病毒的研究进展 |
| 1.7 鸭瘟病毒的研究进展 |
| 2 鸭病毒病的检测方法 |
| 2.1 病毒分离鉴定 |
| 2.2 血清学技术检测 |
| 2.3 分子生物学检测 |
| 3 本课题研究目的及意义、主要内容 |
| 3.1 研究的目的及意义 |
| 3.2 研究的主要内容 |
| 第二篇 试验研究 |
| 第二章 七种鸭病毒单重PCR检测方法的建立 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 病原 |
| 1.2 药品与试剂 |
| 1.3 仪器与设备 |
| 2 试验方法 |
| 2.1 病毒核酸提取 |
| 2.2 引物设计合成 |
| 2.3 标准质粒的构建 |
| 2.4 单重PCR方法的建立 |
| 2.5 单重PCR方法的特异性 |
| 2.6 单重PCR方法的敏感性 |
| 2.7 单重PCR方法的重复性 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 七种病毒的重组质粒 |
| 3.2 单重PCR的建立 |
| 3.3 单重PCR的特异性 |
| 3.4 单重PCR的敏感性 |
| 3.5 单重PCR的重复性 |
| 4 讨论 |
| 第三章 七种鸭病毒的多重PCR检测方法的建立 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 病原 |
| 1.2 药品与试剂 |
| 1.3 仪器与设备 |
| 1.4 样品的采集 |
| 2 试验方法 |
| 2.1 病毒核酸提取 |
| 2.2 引物设计合成 |
| 2.3 标准质粒的构建 |
| 2.4 多重PCR方法的优化与建立 |
| 2.5 多重PCR方法的特异性 |
| 2.6 多重PCR方法的敏感性 |
| 2.7 多重PCR方法的重复性 |
| 2.8 多重PCR方法的应用 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 七种病毒的重组质粒 |
| 3.2 多重PCR反应体系的优化 |
| 3.3 多重PCR方法的特异性 |
| 3.4 多重PCR方法的敏感性 |
| 3.5 多重PCR方法的重复性 |
| 3.6 多重PCR方法共感染模型的建立 |
| 3.7 多重PCR方法检测临床样品 |
| 4 讨论 |
| 第四章 三种鸭病毒的多重Real-time PCR检测方法的建立 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 病原 |
| 1.2 药品与试剂 |
| 1.3 仪器与设备 |
| 2 试验方法 |
| 2.1 病毒RNA提取及反转录 |
| 2.2 引物、探针的设计合成 |
| 2.3 标准质粒的构建 |
| 2.4 三重Real-time PCR方法的优化与建立 |
| 2.5 三重Real-time PCR方法的特异性 |
| 2.6 三重Real-time PCR方法的敏感性 |
| 2.7 三重Real-time PCR方法的重复性 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 三重Real-time PCR方法的优化与建立 |
| 3.2 三重Real-time PCR方法的特异性 |
| 3.3 三重Real-time PCR方法的敏感性 |
| 3.4 三重Real-time PCR方法的重复性 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 致谢 |
| 硕士期间研究成果 |
（5）2018年我国部分地区H9N2禽流感流行病学调查及HA基因遗传进化分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTARCT |
| 缩略词表 |
| 第一篇 文献综述 |
| 第一章 禽流感概述 |
| 1 禽流感的来源和发展历史 |
| 2 禽流感病毒的病原学特征 |
| 2.1 禽流感病毒的理化性质 |
| 2.2 禽流感病毒的基本结构 |
| 2.3 主要蛋白质结构与功能 |
| 3 禽流感病毒的感染机制 |
| 4 禽流感病毒的遗传变异特点 |
| 5 禽流感的流行病学特点 |
| 5.1 传染源 |
| 5.2 传播途径 |
| 5.3 易感动物 |
| 6 禽流感的检测方法 |
| 6.1 免疫学检测技术 |
| 6.2 分子生物学检测技术 |
| 7 禽流感疫苗 |
| 7.1 亚单位疫苗 |
| 7.2 重组活载体疫苗 |
| 7.3 DNA疫苗 |
| 第二章 H9N2亚型禽流感概述 |
| 1 H9N2的遗传进化和流行情况 |
| 2 H9N2相关疫苗 |
| 3 H9N2研究的目的和意义 |
| 第三章 动物流行病学调查指南 |
| 1 流行病学调查简介 |
| 2 流行病学调查方法 |
| 3 动物疫病流行性病学调查的意义 |
| 第二篇 试验研究 |
| 第四章 2018年我国部分地区H9N2亚型禽流感流行病学调查 |
| 1 试验材料 |
| 1.1 试验耗材 |
| 1.2 试验所需溶液的配制方法 |
| 1.3 试验仪器 |
| 1.4 引物设计 |
| 2 试验方法 |
| 2.1 样品采集 |
| 2.2 病毒分离 |
| 2.3 病毒RNA提取 |
| 2.4 一步法RT-PCR扩增HA与NA基因 |
| 2.5 RT-PCR产物实时毛细电泳 |
| 2.6 核苷酸序列测定 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 采样结果 |
| 3.2 RT-PCR检测结果 |
| 3.3 总体阳性结果 |
| 3.4 省份与阳性率的关系 |
| 3.5 宿主与阳性率的关系 |
| 3.6 场点与阳性率的关系 |
| 4 讨论 |
| 第五章 2008-2018年H9N2亚型禽流感流行病学统计分析 |
| 1 材料与方法 |
| 2 统计结果 |
| 2.1 采样结果 |
| 2.2 样品阳性结果 |
| 3 结果分析 |
| 3.1 总体阳性结果分析 |
| 3.2 场点阳性率分布情况 |
| 3.3 批发市场与零售市场的阳性率比较 |
| 3.4 宿主阳性率分布情况 |
| 4 讨论 |
| 第六章 2008-2018年H9亚型HA基因遗传进化分析 |
| 1 试验方法 |
| 1.1 上传序列 |
| 1.2 分离毒株的基因谱系分析 |
| 2 结果与分析 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 致谢 |
（6）2013-2018年黑龙江兴凯湖地区野鸟禽流感病毒监测与进化分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 绪论 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 禽流感的历史 |
| 1.2.1 二十世纪四次流感大流行 |
| 1.2.2 二十一世纪代表性流感疫情 |
| 1.2.3 其他亚型禽流感病毒感染人事件回顾 |
| 1.3 禽流感的病原学 |
| 1.3.1 禽流感病毒的分类地位 |
| 1.3.2 禽流感病毒基因结构及其蛋白 |
| 1.3.3 禽流感病毒致病性的分子基础 |
| 1.4 禽流感病毒宿主种类 |
| 1.5 禽流感病毒系统地理发生学研究 |
| 1.6 本研究的目的意义 |
| 2 兴凯湖地区野鸟禽流感流行病学监测 |
| 2.1 试验材料和实验器材 |
| 2.1.1 实验样品 |
| 2.1.2 实验仪器 |
| 2.1.3 实验试剂 |
| 2.1.4 SPF鸡胚及SPF鸡红细胞 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 样品采集 |
| 2.2.2 样品处理 |
| 2.2.3 病毒分离 |
| 2.2.4 血凝试验 |
| 2.2.5 RT-PCR实验 |
| 2.2.6 病毒HA亚型和NA亚型鉴定 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 病毒分离结果 |
| 2.3.2 AIV亚型鉴定结果 |
| 2.3.3 HA和NA亚型分布 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 本章小结 |
| 3 禽流感病毒代表株的进化分析 |
| 3.1 实验材料和实验器材 |
| 3.1.1 实验样品 |
| 3.1.2 实验仪器 |
| 3.1.3 实验试剂 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 RT-PCR |
| 3.2.2 PCR产物回收和纯化 |
| 3.2.3 序列拼接 |
| 3.2.4 遗传进化分析 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 病毒基因测序结果 |
| 3.3.2 氨基酸位点统计结果 |
| 3.3.3 ML遗传进化树 |
| 3.3.4 最大可信度树系谱树 |
| 3.4 讨论 |
| 3.4.1 H3基因 |
| 3.4.2 H4基因 |
| 3.4.3 H5基因 |
| 3.4.4 H6基因 |
| 3.4.5 H10基因 |
| 3.4.6 H16基因 |
| 3.4.7 N2基因 |
| 3.4.8 N3基因 |
| 3.4.9 N6基因 |
| 3.4.10 N8基因 |
| 3.4.11 PB2基因 |
| 3.4.12 PB1基因 |
| 3.4.13 PA基因 |
| 3.4.14 NP基因 |
| 3.4.15 M基因 |
| 3.4.16 NS基因 |
| 3.4.17 H5N6亚型禽流感病毒的系统地理发生学分析 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
| 致谢 |
| 附件 |
（7）N-MDRV广东株致病性、序列分析及σB蛋白的原核表达（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 本论文常用缩写词 |
| 1 绪论 |
| 1.1 水禽源呼肠孤病毒病介绍 |
| 1.1.1 番鸭“白点病” |
| 1.1.2 番鸭“新肝病” |
| 1.1.3 北京鸭“脾坏死病” |
| 1.1.4 鹅“白点病” |
| 1.1.5 鹅“出血性坏死性肝炎” |
| 1.2 N-MDRV病原的研究进展 |
| 1.2.1 病原分类地位的探讨 |
| 1.2.2 N-MDRV的生物学特性 |
| 1.2.3 N-MDRV的基因组蛋白的结构与功能 |
| 1.3 水禽源呼肠孤病毒σB蛋白的研究 |
| 1.4 N-MDRV病的防控 |
| 1.5 研究目的及意义 |
| 2 材料方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 毒株、禽胚、雏禽、质粒及血清 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要试剂的配制 |
| 2.1.4 主要仪器 |
| 2.1.5 引物 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 N-MDRV/SH12和N-MDRV/DH13株致病性的研究 |
| 2.2.2 N-MDRV/SH12和N-MDRV/DH13株全基因组序列测定及分析 |
| 2.2.3 N-MDRV/DH13株σB蛋白原核表达的研究 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 N-MDRV/SH12和N-MDRV/DH13株致病性研究结果 |
| 3.1.1 N-MDRV/SH12和N-MDRV/DH13株的鉴定 |
| 3.1.2 N-MDRV/SH12和N-MDRV/DH13株鸭胚半数致死量的测定 |
| 3.1.3 N-MDRV/SH12和N-MDRV/DH13株感染雏番鸭和雏鸡致病性结果 |
| 3.2 N-MDRV/SH12和N-MDRV/DH13株全基因组序列的测定及分析结果 |
| 3.2.1 N-MDRV/SH12和N-MDRV/DH13株各段基因的RT-PCR扩增结果 |
| 3.2.2 N-MDRV/SH12和N-MDRV/DH13株基因组结构分析 |
| 3.2.3 N-MDRV/SH12和N-MDRV/DH13株序列分析 |
| 3.2.4 2株病毒基因组系统进化及重组分析 |
| 3.3 N-MDRV/DH13株σB蛋白基因密码子优化研究的结果 |
| 3.3.1 优化σB蛋白基因序列及合成鉴定 |
| 3.3.2 σB蛋白基因原核表达质粒的鉴定 |
| 3.3.3 σB重组蛋白诱导表达条件的优化及可溶性分析 |
| 3.3.4 重组蛋白的纯化及Western blot鉴定 |
| 4 讨论 |
| 4.1 N-MDRV/SH12和N-MDRV/DH13株致病性研究 |
| 4.2 N-MDRV/SH12和N-MDRV/DH13株全基因组序列分析 |
| 4.3 N-MDRV/DH13株σB蛋白基因密码子优化 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表和录用的论文 |
| 致谢 |
| 附录 |
（8）禽呼肠孤病毒疫苗株筛选及免疫原性分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 引言 |
| 缩略词表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1 病原学 |
| 1.1 ARV的形态结构 |
| 1.2 ARV的理化特性 |
| 1.3 ARV的培养特性 |
| 2 分子生物学特性 |
| 2.1 ARV的基因组 |
| 2.2 编码的蛋白与功能 |
| 3 流行病学 |
| 3.1 致病性 |
| 3.2 临床症状及病理变化 |
| 3.3 流行概况 |
| 4 实验室诊断 |
| 4.1 病毒分离鉴定 |
| 4.2 血清学诊断方法 |
| 4.3 分子生物学诊断方法 |
| 5 防治 |
| 5.1 弱毒疫苗 |
| 5.2 灭活疫苗 |
| 5.3 基因工程苗 |
| 6 本课题研究目的及意义 |
| 参考文献 |
| 第二章 ARV的分离鉴定及生物特性研究 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.2 试验方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 病毒分离 |
| 2.2 RT-PCR鉴定 |
| 2.3 序列分析 |
| 2.4 直接免疫荧光(FA)鉴定结果 |
| 2.5 形态学鉴定结果 |
| 2.6 ARV的部分生物学特性 |
| 2.7 部分理化特性研究 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三章 ARV灭活疫苗的制备及免疫原性分析 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 试验材料及试验动物 |
| 1.2 主要仪器 |
| 1.3 试验方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 病毒液检验 |
| 2.2 疫苗质量检验 |
| 2.3 疫苗安全性检验结果 |
| 2.4 疫苗效力检验结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 致谢 |
（9）12株NDV F/HN基因分析及鸭源毒株生物学特性测定（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词英汉对照表 |
| 1 前言 |
| 1.1 NDV生物学特性 |
| 1.1.1 NDV结构特征 |
| 1.1.2 NDV的理化特性 |
| 1.1.3 NDV的培养特性 |
| 1.1.4 NDV毒力与致病性 |
| 1.1.5 血凝活性与神经氨酸酶活性 |
| 1.2 NDV基因组与结构蛋白特性 |
| 1.2.1 NDV基因组 |
| 1.2.2 NDV结构蛋白的特性 |
| 1.3 NDV的流行病学 |
| 1.4 NDV疫苗学概况 |
| 1.5 本研究目的与意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 毒株、标准血清和抗原及雏禽 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要试剂的配制 |
| 2.1.4 主要仪器 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 病毒复壮 |
| 2.2.2 病毒HA/HI测定 |
| 2.2.3 F基因与HN基因克隆与遗传进化分析 |
| 2.2.4 MDK/FS-SS/E/2007株的生物学特性检测 |
| 2.2.5 动物致病性试验 |
| 2.2.6 动物免疫保护试验 |
| 2.2.7 鸭源MDK/FS-SS/E/2007株F蛋白原核表达载体构建和表达 |
| 2.2.8 阳性重组表达质粒表达 |
| 3 结果 |
| 3.1 HA与HI试验结果 |
| 3.2 F基因与HN基因的PCR扩增结果 |
| 3.3 F基因核苷酸序列与氨基酸序列分析 |
| 3.3.1 F基因遗传进化分析 |
| 3.3.2 F基因核苷酸序列同源性分析 |
| 3.3.3 F蛋白氨基酸序列分析 |
| 3.4 HN基因核苷酸序列与氨基酸序列分析 |
| 3.4.1 HN基因核苷酸序列分析 |
| 3.4.2 HN蛋白氨基酸序列分析 |
| 3.5 MDK/FS-SS/E/2007株的毒力指标的测定结果 |
| 3.5.1 MLD与MDT测定结果 |
| 3.5.2 ICPI的测定结果 |
| 3.5.3 IVPI的测定结果 |
| 3.6 鸭胚ELD_(50)的测定结果 |
| 3.7 动物攻毒试验结果 |
| 3.7.1 雏番鸭攻毒试验结果 |
| 3.7.2 雏鹅攻毒试验结果 |
| 3.8 MDK/FS-SS/E/2007株疫苗免疫保护试验结果 |
| 3.8.1 MDK/FS-SS/E/2007株疫苗对雏鸭免疫应答结果 |
| 3.8.2 免疫保护试验结果 |
| 3.9 F蛋白原核表达载体构建结果 |
| 3.9.1 MDK/FS-SS/E/2007株的F基因PCR扩增结果 |
| 3.9.2 重组质粒pET30a-F-E双酶切鉴定结果 |
| 3.10 表达产物的SDS-PAGE鉴定 |
| 3.10.1 诱导时间的优化结果 |
| 3.10.2 IPTG诱导浓度的优化结果 |
| 3.10.3 重组蛋白可溶性分析结果 |
| 3.11 表达产物的Western-blot鉴定 |
| 4 讨论 |
| 4.1 水禽源NDV的流行情况 |
| 4.2 12株NDV的F基因与HN基因序列分析 |
| 4.3 12株NDV的F蛋白与HN蛋白的抗原变异分析 |
| 4.4 MDK/FS-SS/E/2007株毒力测定与攻毒试验结果分析 |
| 4.5 MDK/FS-SS/E/2007株灭活疫苗免疫保护试验分析 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表论文 |
| 致谢 |
（10）H9N2亚型禽流感的流行病学调查及H9N2亚型禽流感病毒对番鸭致病性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 本文英文常用缩写词 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 样品 |
| 2.1.2 SPF鸡胚 |
| 2.1.3 标准阳性血清和抗原 |
| 2.1.4 菌种和克隆载体 |
| 2.1.5 实验动物 |
| 2.1.6 毒株和弱毒疫苗 |
| 2.1.7 主要试剂 |
| 2.1.8 其他相关试剂和主要溶液的配置 |
| 2.1.9 主要仪器设备 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 样品的处理 |
| 2.2.1.1 组织和拭子样品处理 |
| 2.2.1.2 番鸭血清样品处理 |
| 2.2.2 血清样品H9抗体效价测定 |
| 2.2.2.1 四单位抗原的制备 |
| 2.2.2.2 血凝抑制试验（HI） |
| 2.2.3 病毒的分离 |
| 2.2.4 病毒的鉴定 |
| 2.2.4.1 红细胞凝集试验 |
| 2.2.4.2 中和试验 |
| 2.2.4.3 RT-PCR鉴定 |
| 2.2.5 病毒的HA基因全长测定及分析 |
| 2.2.5.1 引物设计与合成 |
| 2.2.5.2 病毒RNA的抽提 |
| 2.2.5.3 HA全长RT-PCR扩增 |
| 2.2.5.4 HA基因的克隆和测序 |
| 2.2.5.5 HA基因的c DNA序列及其推导的氨基酸序列分析 |
| 2.2.6 H9N2毒株的选取和纯化 |
| 2.2.7 毒株的扩繁和鸡胚半数感染量（EID_(50)）的测定 |
| 2.2.8 毒株的静脉致病指数（IVPI）的测定 |
| 2.2.9 不同宿主来源的H9N2毒株对雏番鸭致病性 |
| 2.2.9.1 动物实验 |
| 2.2.9.2 样品的采集和处理 |
| 2.2.10 H9N2禽流感不同的人工感染途径对番鸭的致病性 |
| 2.2.10.1 动物实验 |
| 2.2.10.2 样品的采集和处理 |
| 2.2.10.3 组织样品的核酸提取以及细胞因子m RNA的c DNA合成 |
| 2.2.10.4 组织器官中细胞因子m RNA表达量的动态变化 |
| 2.2.11 H9N2禽流感和RA协同感染对雏番鸭的致病性 |
| 2.2.11.1 RA的复苏和培养 |
| 2.2.11.2 动物实验 |
| 2.2.11.3 临床症状观察与数据统计 |
| 2.2.12 H9N2禽流感感染对雏番疫苗免疫效果的影响 |
| 2.2.12.1 动物实验 |
| 2.2.12.2 样品采集与处理 |
| 2.2.13 H9N2禽流感对产蛋番鸭生产性能的影响 |
| 2.2.13.1 动物实验 |
| 2.2.13.2 样品的采集和处理 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 番鸭H9亚型禽流感血清学调查结果 |
| 3.2 病毒分离和鉴定 |
| 3.2.1 病毒分离和血清学鉴定 |
| 3.2.2 HA基因和NA基因RT-PCR鉴定 |
| 3.2.3 H9N2亚型禽流感毒株分离结果 |
| 3.3 H9N2分离株的HA基因的克隆测序和序列分析 |
| 3.3.1 HA基因RT-PCR扩增 |
| 3.3.2 HA基因核苷酸序列拼接和整理 |
| 3.3.3 HA基因同源性分析和系统发育树构建 |
| 3.3.4 分离株HA蛋白质裂解为点分析 |
| 3.3.5 HA蛋白质受体位点分析 |
| 3.3.6 HA蛋白质N-糖基化位点 |
| 3.4 毒株的纯化 |
| 3.5 鸡胚半数感染量（EID_(50)）和静脉致病指数（IVPI）的测定 |
| 3.6 不同来源的H9N2毒株对雏番鸭致病性结果 |
| 3.6.1 临床观察结果 |
| 3.6.2 雏番鸭排毒量以及排毒规律的测定 |
| 3.6.3 抗体变化情况 |
| 3.7 不同人工感染途径对番鸭的致病性结果 |
| 3.7.1 临床观察结果 |
| 3.7.2 攻毒鸭拭子排毒率测定 |
| 3.7.3 同居鸭拭子排毒率测定 |
| 3.7.4 抗体变化情况 |
| 3.7.5 病理切片观察 |
| 3.7.6 组织器官中细胞因子m RNA表达量的变化 |
| 3.7.6.1 脾脏中INF-γm RNA表达量变化 |
| 3.7.6.2 各组织器官中MHC和TLR-7 的m RNA表达量变化 |
| 3.7.6.3 组织器官的IL-18、IL-2、IL-6、IL-8m RNA表达量变化 |
| 3.8 H9N2禽流感和RA的协同感染结果 |
| 3.8.1 RA细菌学检查结果与培养 |
| 3.8.2 症状观察和死亡率统计结果 |
| 3.9 H9N2禽流感感染对疫苗免疫的影响 |
| 3.9.1 H9N2禽流感感染对番鸭细小弱毒苗免疫的影响 |
| 3.9.2 H9N2禽流感感染对番鸭呼肠孤弱毒苗免疫的影响 |
| 3.10 H9N2禽流感对产蛋番鸭生产性能的影响 |
| 3.10.1 产蛋番鸭排毒情况 |
| 3.10.2 产蛋番鸭攻毒后产蛋率变化 |
| 3.10.3 抗体变化情况 |
| 4 讨论 |
| 4.1 H9N2亚型禽流感不同宿主之间流行情况 |
| 4.2 分离株HA基因的核苷酸序列分析 |
| 4.3 分离株的HA蛋白质位点变化分析 |
| 4.4 H9N2亚型禽流感病毒对番鸭的致病性 |
| 5 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
四、禽流感病毒番鸭分离株对不同禽类致病性的研究（论文参考文献）
- [1]候鸟禽流感病毒遗传变异规律分析及在哺乳动物间传播机制研究[D]. 张醒海. 吉林大学, 2021
- [2]分离株FAdV-4致病性和诱导细胞产生免疫因子特性的初步研究[D]. 李梅珍. 安徽农业大学, 2020(04)
- [3]H9N2亚型禽流感病毒株遗传演化分析及HA和NA基因核酸标准品的研制[D]. 李玥. 吉林农业大学, 2019(03)
- [4]鸭易感病毒检测方法的建立与应用研究[D]. 姚明. 南京农业大学, 2019(08)
- [5]2018年我国部分地区H9N2禽流感流行病学调查及HA基因遗传进化分析[D]. 陆勤勤. 南京农业大学, 2019(08)
- [6]2013-2018年黑龙江兴凯湖地区野鸟禽流感病毒监测与进化分析[D]. 李祥. 东北林业大学, 2019
- [7]N-MDRV广东株致病性、序列分析及σB蛋白的原核表达[D]. 梅敏敏. 佛山科学技术学院, 2018(03)
- [8]禽呼肠孤病毒疫苗株筛选及免疫原性分析[D]. 王茹. 南京农业大学, 2019(08)
- [9]12株NDV F/HN基因分析及鸭源毒株生物学特性测定[D]. 谭华龙. 佛山科学技术学院, 2017(01)
- [10]H9N2亚型禽流感的流行病学调查及H9N2亚型禽流感病毒对番鸭致病性研究[D]. 张凯. 华南农业大学, 2016(03)